微RNA藥物用于心血管疾病治療的研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)

胡瑩瑩，張 勇，2

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.寒地心血管病全國重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081）

心血管疾病是全球人口死亡的主要原因之一［1］。近年來，我國心血管疾病患病率總體呈上升趨勢，發(fā)病率和致死率持續(xù)高居榜首［2］。目前，盡管在心血管疾病治療方面取得了很大進(jìn)展，但仍迫切需要新的治療干預(yù)措施以降低其發(fā)病率和致死率。隨著非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）研究領(lǐng)域的發(fā)展，越來越多的研究表明，ncRNA 在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，以ncRNA為靶點的下一代藥物可能成為心血管疾病治療的新選擇［3］。據(jù)長度是否＞200個核苷酸，ncRNA分為短鏈ncRNA和長鏈ncRNA，其中短鏈ncRNA 包括微RNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和P 元件誘發(fā)的精巢萎縮相互作用RNA等［4］。

miRNA 是一類長度約為22 個核苷酸的內(nèi)源性單鏈高度保守的短鏈ncRNA，通過轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控維持細(xì)胞功能［5-6］。自1993年在秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)第1個miRNAlin-4［7］，miRNA一直備受關(guān)注。據(jù)估計，miRNA 可靶向≥60%人類蛋白質(zhì)編碼基因［8］。2018年版本miRBase 22展示了271個物種中的約5 萬條成 熟miRNA（http：//www.mirbase.org/）［9］。如今已證明有＞2000 種miRNA 可調(diào)節(jié)人類基因組中約1/3 基因表達(dá)。20 余年間，miRNA 的研究已從實驗室進(jìn)入到臨床試驗階段。2006 年第1 份涉及miRNA與心血管疾病有關(guān)的報告發(fā)表［10］，后續(xù)大量研究描述了心血管疾病患者心肌和血管組織中miRNA 表達(dá)的變化，功能獲得性研究揭示miRNA是調(diào)控心血管功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在心血管生理功能諸多方面發(fā)揮重要作用［11］。作為多種心血管疾病的治療靶標(biāo)，miRNA 可能發(fā)展為治療心血管疾病的新藥物。本綜述梳理miRNA 模擬物（mimic）和miRNA 抑制劑用于常見心血管疾病治療的研究進(jìn)展，討論治療心血管疾病miRNA藥物開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)和潛在解決方法，并對此類藥物的未來發(fā)展前景予以展望。

1 miRNA發(fā)生過程和作用機(jī)制

miRNA 發(fā)生過程涉及多個步驟：①miRNA 通過RNA 聚合酶Ⅱ和Ⅲ轉(zhuǎn)錄為初級miRNA；②核糖核 酸 酶Drosha 和DGCR8（DiGeorge syndrome critical region gene 8）將初級miRNA 加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度約70 個核苷酸的前體miRNA；③前體miRNA 在輸出蛋白5（exportin-5）和Ran-GTP 酶作用下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)；④由RNA酶ⅢDicer 加工形成成熟的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA 在解螺旋酶作用下解離，將miRNA 引導(dǎo)鏈（guide strand）摻入RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，從而介導(dǎo)基因調(diào)控。轉(zhuǎn)錄后基因沉默是通過核苷酸互補(bǔ)結(jié)合所介導(dǎo)，主要是與靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3′非翻譯區(qū)結(jié)合。miRNA 種子序列位于miRNA序列5′端的2～7個核苷酸，種子序列完全互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致目標(biāo)mRNA 脫腺苷酸化和降解。更為常見的是不完全互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致翻譯抑制［12-13］。

2 miRNA藥物開發(fā)策略

miRNA 藥物開發(fā)主要有2 種策略：第1 種是應(yīng)用miRNA 模擬物下調(diào)異常表達(dá)的蛋白質(zhì)，第2 種是基于miRNA 抑制劑（也稱為antimiR）增加或“挽救”下調(diào)的特定蛋白質(zhì)表達(dá)［14］。miRNA 模擬物是一種合成雙鏈寡核苷酸，在靶細(xì)胞中被切割成功能性單鏈miRNA，模擬生物體內(nèi)源miRNA［15］。miRNA模擬物的引導(dǎo)鏈與該miRNA 相同，而過客鏈（passenger strand）經(jīng)過修飾，通常與膽固醇等分子連接以增強(qiáng)細(xì)胞攝取。miRNA 抑制劑是合成的單鏈反義寡核苷酸分子，可特異性識別并抑制固有的miRNA，通過與單鏈成熟miRNA 結(jié)合直接阻斷miRNA 功能，阻止與靶mRNA 結(jié)合，從而降低致病性或異常表達(dá)的miRNA。未修飾的RNA 鏈易降解，因此miRNA 治療需要有效的遞送方法并保留miRNA 功能修飾以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。病毒、脂質(zhì)體或納米顆粒等可用作遞送miRNA模擬物或miRNA 抑制劑的載體［16］。2′-O-甲基化、2′-O-甲氧基乙基、2′-氟和鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）等修飾方式可促進(jìn)miRNA 抑制劑的穩(wěn)定和吸收［17-18］。miRNA 模擬物必須經(jīng)歷與雙鏈前miRNA 相同的過程，因此對于miRNA模擬物來說，優(yōu)化特異性遞送、細(xì)胞攝取和調(diào)節(jié)功能的化學(xué)修飾比miRNA 抑制劑更具挑戰(zhàn)性。

作為目前治療用ncRNA 的研究熱點，miRNA模擬物與siRNA 具有許多共同特征，二者均為外源性人工導(dǎo)入的長度約22個核苷酸的雙鏈寡核苷酸，與Argonaute 蛋白結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體并誘導(dǎo)靶基因沉默。但miRNA 和siRNA 在與靶序列的互補(bǔ)模式上存在差異。siRNA 與目標(biāo)mRNA完美互補(bǔ)，而miRNA 遵循“種子配對規(guī)則”，即miRNA 種子區(qū)域與位于mRNA 的3′非翻譯區(qū)的結(jié)合位點互補(bǔ)結(jié)合［19］。有研究報道，miRNA與靶序列的互補(bǔ)比例為20%～90%，而所有siRNA 與靶序列的互補(bǔ)比例均為100%［20］。

3 miRNA 藥物在常見心血管疾病治療中的研究

3.1 心衰

CDR132L是一種合成的miR-132特異性反義寡核苷酸。研究表明，心肌組織中過度激活miR-132會導(dǎo)致病理性心肌重構(gòu)，從而導(dǎo)致心衰。antimiR-132可逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，將自噬和鈣信號傳導(dǎo)恢復(fù)正常并減少心肌纖維化［21］。非臨床評估表明，在心肌梗死導(dǎo)致的亞急性和慢性心衰曼加利察豬模型中，CDR132L 在藥理劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性，劑量依賴性地將藥物有效遞送至心肌組織［22］。心臟收縮和舒張功能的同時改善表明，CDR132L在慢性心衰患者中具有廣泛的適用性［23］。在非臨床數(shù)據(jù)的支持下，CDR132L成為第1個進(jìn)入臨床試驗治療心血管疾病的miRNA藥物。Ⅰb期臨床試驗（NCT04045405）首次證實，CDR132L 在穩(wěn)定型缺血性心衰（紐約心臟病協(xié)會心衰分級1～3級）治療中安全性和耐受性良好，無明顯毒性反應(yīng)。CDR132L 可減少心衰患者心衰標(biāo)志物N 端腦鈉肽前體，明顯縮窄心電圖QRS 波，改善心肌重構(gòu)［24］?；谝陨辖Y(jié)果，一項Ⅱ期多中心臨床試驗（NCT05350969）評估CDR132L 在心肌梗死后左心室射血分?jǐn)?shù)降低患者中的療效和安全性研究已于近期開展。

miR-208a 是一種與心衰和心肌重構(gòu)有關(guān)的心肌特異性miRNA。抑制miR-208a可防止病理性心肌重構(gòu)［25］。在舒張性心衰模型大鼠（達(dá)爾鹽敏感大鼠）中，皮下遞送antimiR-208a 可劑量依賴性減弱應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)、心功能惡化和心肌肌球蛋白轉(zhuǎn)換，同時改善心功能和大鼠存活率［26］。在主動脈弓縮窄小鼠心肌中miR-652表達(dá)增加，LNA-antimiR-652通過減少心肌纖維化和細(xì)胞凋亡，降低B 型利鈉肽基因表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成，改善小鼠心功能，其中Jagged1（Notch1 配體）為miR-652 的直接靶標(biāo)［27］。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控因子，抑制miR-27b-3p 在病理性心肌重構(gòu)發(fā)展中具有保護(hù)作用。成纖維細(xì)胞生長因子1 作為miR-27b-3p的靶基因，可上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活子1α/β 表達(dá)，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化，抑制心肌細(xì)胞肥大，提示miR-27b-3p 可能是治療以病理性心肌重構(gòu)為特征疾病的潛在靶點［28］。上述研究表明，miR-132，miR-208，miR-652 和miR-27b-3p具有調(diào)節(jié)心功能和心肌重構(gòu)的作用，可能成為治療心衰病理性心肌重構(gòu)的潛在靶點。

3.2 心肌梗死

miR-92a 屬于miR-17～92 簇，是一種抗血管生成的miRNA。急性心肌梗死模型小鼠反復(fù)靜脈注射antimiR-92a 抑制miR-92a，可誘導(dǎo)血管生成并改善心室功能［29］。研究表明，antimiR-92a 局部治療可減少豬缺血再灌注損傷模型心肌梗死面積，發(fā)揮心臟保護(hù)作用［30］。Bellera 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，在小型豬急性心肌梗死模型中，將封裝在微球中的antimiR-92a 經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射，其主要分布于心肌前壁毛細(xì)血管，未分布至遠(yuǎn)端器官，誘導(dǎo)心肌梗死1 個月后antimiR-92a 誘導(dǎo)血管生成。同時，antimiR-92a 治療也可增強(qiáng)心肌梗死后內(nèi)皮細(xì)胞自噬和心肌細(xì)胞代謝［32］。鑒于miR-92a 在血管生成、自噬和心肌細(xì)胞代謝等方面的重要作用，抑制miR-92a 有望成為缺血后心臟保護(hù)的新型治療靶點。MRG-110（antimiR-92a）是一種靶向miR-92a-3p的基于LNA的反義寡核苷酸，對心血管疾病和傷口愈合具有治療作用［33］。Ⅰ期臨床試驗（NCT03603431）評估了MRG-110 的安全性、耐受性、藥動學(xué)和藥效學(xué)，全身輸注MRG-110 可有效抑制人外周血中miR-92a 水平［34］。目前antimiR-92a 在心血管疾病相關(guān)領(lǐng)域尚未開展更深入的臨床研究。

Bernardo 等［35］報道，皮下遞送8-mer LNAantimiR-34 可有效抑制miR-34 家族（miR-34 a，b和c），減輕心肌梗死誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)和功能障礙，并改善壓力超負(fù)荷引起的心臟病理性肥大和功能障礙。miR-34 也是一種腫瘤抑制因子，但抑制miR-34家族并不會促進(jìn)腫瘤發(fā)生，從而提示治療性抑制miR-34家族具有治療心肌梗死和心衰的潛力［36］。

目前非臨床試驗研究表明，除miR-92a 和miR-34外，未來有潛力作為心肌梗死治療靶點的還有miR-15，miR-22，miR-99a，miR-214，miR-133和miR-210。Hullinger等［37］報道，在小鼠和約克夏豬心肌梗死模型中，以全身給藥方式用LNA 修飾的antimiR-15 可劑量依賴性地抑制心肌組織中miR-15。小鼠心肌梗死模型中治療性靶向抑制miR-15可減少心肌梗死面積，改善心肌重構(gòu)并增強(qiáng)心功能。miR-22 為心肌細(xì)胞自噬過程中豐富且強(qiáng)效的抑制劑，老年小鼠心肌梗死后，抑制miR-22 可激活心肌細(xì)胞自噬，防止梗死后心肌重構(gòu)，改善心功能，而在年輕小鼠中未見明顯效果［38］。過表達(dá)miR-99a可通過mTOR/P70S6K信號通路改善低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而改善心肌梗死模型小鼠心功能。心肌內(nèi)注射miR-99a 可改善心肌梗死模型小鼠心肌梗死后4 周左心室功能，提高小鼠存活率［39］。同樣，腺病毒遞送的miR-214 在急性心肌梗死模型大鼠中可改善左心室重塑并減少心肌細(xì)胞凋亡［40］。β 腎上腺素受體阻斷藥卡維地洛（carvedilol）抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，顯著改善心肌梗死后心功能，該作用與miR-133 有關(guān)［41］。miRNA-210 靶向甘油-3-磷酸脫氫酶，控制線粒體代謝，保護(hù)心臟免受心肌缺血再灌注損傷［42］。綜合上述結(jié)果表明，以miRNA為治療靶點有希望用于心肌梗死和缺血性損傷后心功能保持患者的治療。

3.3 心肌纖維化

miR-29 在多種器官纖維化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括心肌纖維化、肝纖維化、肺纖維化、系統(tǒng)性硬化癥和瘢痕疙瘩等［43］。miR-29 家族通過多種信號通路在心肌纖維化中發(fā)揮抗纖維化作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad通路被認(rèn)為是其中之一［44］。MRG-201（remlarsen）是一種miR-29a模擬物，用于治療纖維化和瘢痕疙瘩疾病的研究已完成Ⅰ期（NCT02603224）和Ⅱ期（NCT03601052）臨床試驗。MRG-201可抑制切口皮膚傷口中膠原蛋白表達(dá)和纖維增生發(fā)展，表明MRG-201可能是預(yù)防纖維化瘢痕（肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩）形成或預(yù)防皮膚纖維化（如硬皮?。┑挠行Ш蜻x藥物［45］。以上結(jié)果表明，miR-29具有成為心肌纖維化新治療靶點的潛力，這為進(jìn)一步開發(fā)miR-29模擬物奠定良好基礎(chǔ)。

miR-21 在衰竭心臟的成纖維細(xì)胞中特異性增加，通過特定的antagomiR 沉默體內(nèi)miR-21，可降低心肌細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-絲裂原活化蛋白激酶活性，抑制間質(zhì)纖維化并減輕心臟功能障礙［46］。骨橋蛋白是一種與心肌纖維化密切相關(guān)的多功能細(xì)胞因子。在與血管緊張素Ⅱ相關(guān)的心肌纖維化中，骨橋蛋白激活miR-21并靶向PTEN/Smad7，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞存活率增加，從而促進(jìn)心肌纖維化；LNA介導(dǎo)的miR-21沉默可改善體內(nèi)心肌纖維化的發(fā)展［47］。antimiR-21（RG-012）目前正進(jìn)行治療奧爾波特（Alport）綜合征的Ⅱ期臨床試驗（NCT02855268）。

miR-133 和miR-590 通過轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因TGF-β1和TGF-βRⅡ蛋白表達(dá)水平，減少膠原蛋白合成，抑制心房纖維化。尼古丁可通過下調(diào)miR-133和miR-590促進(jìn)犬心房纖維化［48］。

3.4 心律失常

miRNA 在心律失常中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，有望成為心律失常藥物的有效治療靶點。肌肉特異性miR-1通過調(diào)節(jié)離子通道基因的表達(dá)控制心臟興奮性。Yang等［49］研究表明，miR-1通過抑制間隙連接蛋白α1 和內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J 成員2分別編碼的間隙連接蛋白43 和K+通道亞單位Kir2.1 表達(dá)，導(dǎo)致缺血心肌傳導(dǎo)減慢和膜電位降低，繼而引發(fā)缺血性心律失常。隨后的一項研究表明，過表達(dá)miR-1 可靶向蛋白磷酸酶2A 調(diào)節(jié)亞基B56α，引起蘭尼堿受體2 過度磷酸化，增強(qiáng)Ca2+釋放并促進(jìn)心律失常發(fā)生［50］。值得注意的是，上述研究中LNA-antimiR-1 能夠預(yù)防或逆轉(zhuǎn)心律失常，表明miR-1可作為抗心律失常治療的潛在靶點。本教研室研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-1 表達(dá)是普萘洛爾［51］和丹參酮ⅡA［52］抗心律失常作用的機(jī)制之一。

miR-26 屬于心臟富集但非心臟特異性miRNA家族。研究發(fā)現(xiàn)，房顫動物模型和房顫患者的心房樣本中miR-26 表達(dá)下調(diào)，敲除內(nèi)源性miR-26 促進(jìn)小鼠房顫發(fā)生，而腺病毒介導(dǎo)的miR-26 過表達(dá)則降低房顫易感性［53］。在ATP 誘導(dǎo)的犬房顫模型中，miR-328顯著上調(diào)。犬心房腺病毒過表達(dá)miR-328可重現(xiàn)房顫表型，antimiR-328抑制L型Ca2+通道基因表達(dá)，縮短動作電位時程，可逆轉(zhuǎn)房顫的不良心房電重構(gòu)［54］。

3.5 動脈粥樣硬化

miRNA 在動脈粥樣硬化的每個進(jìn)展階段均具有重要作用。Sun 等［55］研究報道，在高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的主動脈內(nèi)膜和患有冠狀動脈疾病患者的血漿中，miR-181b 表達(dá)顯著下調(diào)。尾靜脈注射遞送脂質(zhì)體包裹的miR-181b 模擬物至血管壁，可增加miR-181b 表達(dá)，抑制血管壁中NF-κB 活化和促炎基因表達(dá)，減少動脈粥樣硬化病變形成。上述研究表明，miR-181b 模擬物為治療動脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病提供一種新方法。研究表明，miR-29 參與維持動脈完整性和調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化［56］。Ulrich 等［57］報道，動脈粥樣硬化模型小鼠長期皮下注射LNA-antimiR-29，可減小病變面積，還可通過增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌改善斑塊穩(wěn)定性，為治療動脈粥樣硬化提供獨立于降脂策略的治療機(jī)會。miR-33 是巨噬細(xì)胞膽固醇流出和高密度脂蛋白生物合成的重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明，抑制miR-33可增加高密度脂蛋白水平并減少斑塊，巨噬細(xì)胞特異性缺失miR-33 可減少高脂血癥條件下的脂質(zhì)積累和炎癥，從而減少斑塊［58］。另外，miR-126-5p 模擬物可通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用［59］。

4 miRNA藥物開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)

miRNA 復(fù)雜精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制使其在多種病理過程中成為很有希望的治療藥物，但miRNA藥物尚處于臨床開發(fā)階段，迄今尚無miRNA 藥物上市，目前大部分研究是將miRNA 作為生物標(biāo)志物或預(yù)后因素進(jìn)行評估。近幾年，miRNA 藥物非臨床和臨床試驗正逐漸增加。據(jù)美國臨床試驗數(shù)據(jù)庫（www.clinicaltrials.gov）查詢結(jié)果顯示，目前處在臨床研究不同階段的miRNA 藥物涉及肝炎、腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病和皮膚疾病等領(lǐng)域。非臨床研究結(jié)果表明，在心血管疾病中，miRNA 藥物有可能用于心衰、心肌梗死、心肌纖維化、心律失常和動脈粥樣硬化等治療（表1），突顯了它們作為心血管疾病治療靶標(biāo)的潛力。然而，除心血管疾病本身病理機(jī)制復(fù)雜等因素外，治療心血管疾病的miRNA藥物開發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

表1 以微RNA（miRNA）為靶點治療心血管疾病藥物的非臨床研究概況

4.1 miRNA調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜

miRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控十分復(fù)雜，受多種調(diào)節(jié)因素影響，潛在機(jī)制在很大程度上仍未知，所以miRNA 藥物的發(fā)展需進(jìn)一步闡明miRNA 的調(diào)節(jié)機(jī)制。①多靶點效應(yīng)：一個miRNA 可靶向數(shù)十甚至數(shù)百個基因，是miRNA 典型特性之一，這既是其發(fā)揮作用的優(yōu)勢，但也導(dǎo)致其作用的非特異性。miRNA可同步調(diào)節(jié)同一通路的不同基因而影響整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也可參與一個或多個完整的疾病途徑［60］。目前全球已有4 款siRNA 藥物上市，有超過60 個siRNA 藥物相關(guān)項目處在臨床研究的不同階段，但miRNA 藥物開發(fā)相對緩慢，主要原因在于兩者靶標(biāo)數(shù)量存在巨大差異。一般藥物靶點的數(shù)量不超過5 個，siRNA 藥物靶點一般為3～5 個，而miRNA藥物靶點遠(yuǎn)超此范圍［20］，其中一些未知靶點可能導(dǎo)致生理功能障礙或毒性反應(yīng)，這也是2 個miRNA 藥物因不良事件而終止臨床試驗的原因（RG-101出現(xiàn)少數(shù)高膽紅素血癥，MRX34發(fā)生5次嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件）。②多miRNA 協(xié)同效應(yīng)：任何單個基因均可作為多個miRNA 的靶點，這些miRNA 具有累加的生物學(xué)效應(yīng)。例如，miR-34a和miR-15/16 均為癌癥抑制miRNA，miR-34a 和miR-15/16 模擬物的混合物顯示出抑制癌細(xì)胞的協(xié)同作用。靶向具有協(xié)同作用的多種miRNA 可能是一種有效的治療方法，值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。③組織細(xì)胞特異性：miRNA 過表達(dá)或抑制在治療上可行的前提是其可靶向相關(guān)類型的組織細(xì)胞。已有一些miRNA 的組織特異性得到證實，如心肌和骨骼肌特異性miR-1 和miR-133 及肝特異性miR-122 等［61］。miRNA 表達(dá)的特異性機(jī)制對于了解相應(yīng)組織的正常發(fā)育和疾病發(fā)展至關(guān)重要，而確定為心血管疾病治療靶點的miRNA 大多數(shù)是機(jī)體普遍表達(dá)的，引發(fā)了對脫靶效應(yīng)的擔(dān)憂。④競爭效應(yīng)：外源性人工miRNA 會引發(fā)競爭和飽和效應(yīng)，即外源性和內(nèi)源性miRNA之間對細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的競爭，從而影響未知基因表達(dá)，導(dǎo)致不良事件發(fā)生［62］?？傊?，由于miRNA 自身特性導(dǎo)致的脫靶、不良反應(yīng)和非特異性等問題，限制了miRNA藥物的開發(fā)。

4.2 非臨床研究的局限性

心血管疾病藥物開發(fā)非臨床研究的主要挑戰(zhàn)是動物模型無法完全復(fù)制人類疾病，這也是其他疾病藥物開發(fā)面臨的共同挑戰(zhàn)［63］。多數(shù)研究是在小型嚙齒動物的單一模型系統(tǒng)中進(jìn)行的。猴、豬、狗和兔等大型動物模型可能更能模擬人類心血管疾病，但新陳代謝和免疫系統(tǒng)仍存在限制；且大型動物需要更大的繁殖空間和更高的維護(hù)成本，實驗干預(yù)更耗時，妊娠時間較長，基因敲除或敲入模型制備更困難［64］。由于上述限制，工程心肌組織和活心肌切片等新興工具成為體外和體內(nèi)模型之間的橋梁［65-66］。此外，還需增強(qiáng)對個體和性別差異機(jī)制的探討。

4.3 有效遞送是研發(fā)瓶頸

如何將藥物有效遞送至靶器官和靶細(xì)胞，并跨細(xì)胞膜執(zhí)行藥物的細(xì)胞內(nèi)功能，同時降低毒性和脫靶效應(yīng)的風(fēng)險，是miRNA 藥物開發(fā)最大的挑戰(zhàn)之一。優(yōu)化遞送策略是解決上述難題的首選方法。如何優(yōu)化遞送載體和遞送方式是提高miRNA 藥物在心血管疾病治療中有效性和安全性的關(guān)鍵之一。

4.3.1 遞送載體

限制miRNA 臨床轉(zhuǎn)化的一個重要挑戰(zhàn)是靶向遞送問題。miRNA 的細(xì)胞膜穿透能力有限，不能單獨遞送到目標(biāo)組織。此外，miRNA 帶有負(fù)電荷，組織穿透能力較差。病毒載體（慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒）和非病毒載體（聚合物、脂質(zhì)體和納米顆粒等）是miRNA 遞送的常用載體［67］?；诓《据d體的RNA療法有載體生成容易、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高和基因表達(dá)長期穩(wěn)定等優(yōu)點，但存在免疫原性低等安全性問題［68］。腺病毒相關(guān)載體可有效實現(xiàn)miRNA 在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，常用于心血管疾病動物模型中miRNA 過表達(dá)研究。非臨床研究中非病毒載體對心血管疾病顯示出一定的效果，如3.5 動脈粥樣硬化部分介紹的miR-126-5p 和miR-181b 模擬物分別采用了納米顆粒載體和脂質(zhì)體載體的遞送策略。Lesizza 等［69］成功地將hsa-miR-199a-3p 和hsa-miR-590-3p 模擬物的合成脂質(zhì)制劑通過單次心內(nèi)注射，改善了急性心肌梗死后心功能。但與其他器官相比，靶向心臟更具挑戰(zhàn)性［70］。胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）作為天然的生物載體，具有免疫源性低、不良反應(yīng)小、生物相容性和靶向遞送等優(yōu)勢。有研究者使用心肌靶向肽（cardiac targeting peptide，CTP）對EV 表面進(jìn)行功能化修飾，制備了具有更高靶向能力的CTP-EV。該研究將天然藥物姜黃素與其發(fā)揮心臟保護(hù)作用的miR-144-3p 共同加載到CTP-EV 中，實現(xiàn)主動心肌靶向；同時，體外和體內(nèi)實驗均表現(xiàn)出對心肌梗死后更強(qiáng)的心臟保護(hù)作用。因此，CTP-EV 可能是遞送治療分子的潛在有效策略［71］。在另一項研究中，Tan 等［72］開發(fā)了一種血小板樣膜融合納米遞送系統(tǒng)，由搭載miR-21 為核心的介孔二氧化硅納米微球和血小板膜與陽離子脂質(zhì)體的融合膜外殼組成，可將miR-21 主動靶向遞送至心肌缺血再灌注小鼠心肌損傷區(qū)域的巨噬細(xì)胞，對炎性巨噬細(xì)胞進(jìn)行抗炎重編程，進(jìn)而改善心肌重構(gòu)。這一遞送系統(tǒng)的突出優(yōu)勢在于其有機(jī)融合了介孔二氧化硅納米微球?qū)iRNA的高負(fù)載效率、血小板膜仿生技術(shù)的主動靶向性和陽離子脂質(zhì)體的遞送效率，同時兼顧遞送過程中miRNA 的穩(wěn)定性、靶向性及搭載和遞送效率，在調(diào)控心血管疾病炎癥反應(yīng)方面表現(xiàn)出良好的性能，具有臨床轉(zhuǎn)化前景，也為miRNA 藥物在其他疾病中的精準(zhǔn)應(yīng)用提供新思路。

4.3.2 遞送方式

靜脈給藥或皮下注射等全身給藥方式是大多數(shù)臨床應(yīng)用的首選，但無法避免組織非特異性和脫靶效應(yīng)的問題，心血管疾病miRNA治療可考慮通過局部遞送增加miRNA藥物在心臟或血管中的濃度。一種策略是通過導(dǎo)管將miRNA 藥物遞送至心臟。Hinkel 等［30］首次嘗試在豬缺血再灌注模型中通過冠狀動脈順行或逆行灌注及靜脈輸注3種方式測試LNA-antimiR-92a 的功效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種方式均可降低心肌miR-92a 表達(dá)，且與靜脈輸注相比，冠狀動脈順行或逆行灌注可改善心功能，減少梗死面積。值得注意的是，肝和腎miR-92a 表達(dá)亦受到抑制，表明利用導(dǎo)管遞送antimiR至心臟并不能完全阻止其全身作用。另一種策略是應(yīng)用藥物洗脫支架或球囊將miRNA 藥物遞送至血管壁。Wang 等［73］通過使用antimiR-21涂層支架實現(xiàn)局部抑制miR-21，未觀察到其他器官中miR-21抑制，也未出現(xiàn)脫靶副作用。上述2種策略在非臨床研究中顯示出較好的效果，但將其轉(zhuǎn)化為臨床仍然面臨諸多困難。

5 結(jié)語

近年來研究表明，RNA 療法在包括心血管疾病在內(nèi)的多種疾病中具有治療潛力。多種RNA 療法的興起進(jìn)一步推動miRNA藥物的發(fā)展，越來越多的miRNA 藥物進(jìn)入臨床試驗階段，特別是第1 個用于治療心衰的miRNA 藥物CDR132L 進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗，預(yù)示miRNA藥物有望成為下一代心血管疾病治療藥物。隨著miRNA功能研究逐漸深入，將逐步建立更為完善的非臨床研究模式。生物信息學(xué)的不斷發(fā)展也為篩選潛在的治療性miRNA 提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。所以盡管目前miRNA 藥物開發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)，但隨著多學(xué)科交叉融合及技術(shù)手段升級，miRNA 藥物的穩(wěn)定性、靶向性和安全性等問題也將逐步被攻克。