基于線粒體Cytb基因序列的褐石斑魚種群遺傳多樣性分析*

鐘聲平,蔣 艷,陳秀荔,趙永貞,趙龍巖,劉永宏,黃國強**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,廣西海洋藥物重點實驗室,廣西南寧 530299;2.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司,廣西海水養(yǎng)殖新品種繁育工程技術(shù)研究中心,廣西北海 536000;3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院,廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室,廣西南寧 530021)

褐石斑魚(Epinephelusbruneus)隸屬鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚亞科(Epinephelinae)石斑魚屬(Epinephelus),俗稱土溝龍、假油斑,為西太平洋海區(qū)暖水性底層魚類,主要分布在韓國、日本和中國(南至海南島)沿海[1]。褐石斑魚具有生長快、適應(yīng)能力強、營養(yǎng)價值高等特點,養(yǎng)殖開發(fā)潛力巨大[2]。20世紀(jì)90年代末,日本、韓國和中國臺灣地區(qū)開始養(yǎng)殖褐石斑魚[3]。然而,褐石斑魚人工規(guī)?；缂夹g(shù)尚未突破,目前人工養(yǎng)殖的苗種主要來源于野生捕撈[4]。此外,由于褐石斑魚野生種群數(shù)量逐年下降,世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)于2016年將褐石斑魚收錄到瀕危物種紅色名錄下,現(xiàn)已被列為易危物種,其種質(zhì)資源極易因人類活動的影響而衰退[5],因此急需開展褐石斑魚種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等遺傳背景相關(guān)的調(diào)查分析。目前,關(guān)于褐石斑魚的研究主要集中在生理學(xué)[3]、早期發(fā)育[6]、細(xì)胞遺傳學(xué)[7]、雜交育種[4]和人工養(yǎng)殖[8]等方面,尚未見有關(guān)褐石斑魚地理種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究報道。

動物線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快且不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點,已成為研究動物起源進(jìn)化、群體遺傳、系統(tǒng)發(fā)育等的重要標(biāo)記[9]。其中,線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA的13個蛋白質(zhì)編碼基因中研究得最多,且進(jìn)化速度適中,因此在魚類的種群分化與遺傳結(jié)構(gòu)中應(yīng)用廣泛[10]。本研究以西太平洋海區(qū)3個不同地理群體的褐石斑魚為研究對象,利用線粒體Cytb基因序列對褐石斑魚分布區(qū)域內(nèi)的種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,旨在從分子水平上揭示褐石斑魚地理種群間的遺傳差異和種群分化,不僅為褐石斑魚種質(zhì)資源遺傳背景調(diào)查分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),而且為褐石斑魚種質(zhì)資源保護(hù)和利用、人工繁育、生態(tài)養(yǎng)殖以及良種選育提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

褐石斑魚分別采自中國海南島(109.226°N,20.140°E)、福建廈門(118.241°N,24.302°E)和韓國濟州島(126.594°N,33.974°E) 3個近海海域,為當(dāng)?shù)貪O船出海釣捕收獲。其中,采集海南島(HN)地理種群30尾,體長(26.4±2.6) cm,體質(zhì)量(426.8±52.7) g;福建廈門(XM)地理種群27尾,體長(21.7±3.8) cm,體質(zhì)量(309.7±65.4) g;韓國濟州島(HG)地理種群31尾,體長(25.2±2.7) cm,體質(zhì)量(393.5±49.6) g。根據(jù)郭明蘭等[11]和Liu等[12]對云紋石斑魚(E.moara)和褐石斑魚形態(tài)比較的特征鑒定為褐石斑魚,解剖取其背部肌肉,放置于-20 ℃的無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取和檢測

取每個樣品0.1 g,用SDS/蛋白酶K消化,采用酚-氯仿抽提法和乙醇沉淀法[13]提取總DNA,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA,并使用超微量紫外分光光度計測定DNA濃度并稀釋至100 ng/μL,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及序列測定

Cytb基因片段擴增的引物序列為L14724 (5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)和 H15149 (5′-CCTCAGAAGGATATTGTCCTC-3′),由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)體積為50 μL,其中10×PCR buffer (plus Mg2+) 5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 1 μL,正反向引物(5 pmol/μL)各1 μL,Taq酶(2.5 U/μL) 1 μL,模板(約100 ng) 1 μL,加超純水至50 μL。PCR擴增反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán);再72 ℃鏈延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,柱式純化試劑盒純化,純化產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選用Dnastar軟件包對序列進(jìn)行編輯、校對和排序,并對排序結(jié)果進(jìn)行分析和手工調(diào)整。用DnaSP軟件[14]確定單倍型。單倍型數(shù)目、多態(tài)位點、轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失等分子多態(tài)性參數(shù)使用Arlequin軟件[15]統(tǒng)計獲得。單倍型多態(tài)度(h)、核苷酸多態(tài)度(π)、兩兩序列平均核苷酸差異數(shù)(k)以及相應(yīng)的方差使用Arlequin軟件計算。

以巨石斑魚(E.tauvina)和斜帶石斑魚(E.coioides)的Cytb基因序列為外群,采用jModelTest軟件[16]依據(jù)貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)(Bayesian Information Criterion,BIC)從88種核苷酸替換模型中選取最適合本研究的線粒體Cytb基因的最佳替換模型。采用鄰接法(Neighbor Joining,NJ),最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)和最大似然法(Maximum Likelihood,ML)等3種方法構(gòu)建褐石斑魚Cytb單倍型分子系統(tǒng)樹,使用PAUP軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹[17]。系統(tǒng)樹的可靠性采用1 000次重抽樣進(jìn)行評估,應(yīng)用NETWORK軟件(http://www.uxus-technology.com)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

應(yīng)用Arlequin軟件計算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(FST),檢測群體遺傳結(jié)構(gòu),FST值的顯著性使用10 000次重抽樣檢驗。單倍型間的遺傳距離采用HKY核苷酸進(jìn)化模型計算。采用分子方差分析(AMOVA)[18]評估褐石斑魚的群體遺傳結(jié)構(gòu),通過10 000次重抽樣來檢驗不同遺傳結(jié)構(gòu)水平上協(xié)方差的顯著性。采用IBDWS (Isolation by Distance Web Service)[19]檢驗群體間是否存在距離隔離(Isolation by Distance,IBD)[20]。采用Tajima′sD檢驗[21]和Fu′sFs檢驗[22]兩種檢驗方法進(jìn)行群體歷史動態(tài)分析,使用Arlequin軟件進(jìn)行運算。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytb基因序列遺傳變異和遺傳多樣性

經(jīng)序列比對并去除引物序列后,獲得的DNA序列片段長402 bp,該片段起始的1-3 bp堿基序列為ATG,對應(yīng)斜帶石斑魚線粒體基因組全序列中的Cytb基因序列的起始密碼子[23]。結(jié)果顯示,本次測序序列為褐石斑魚線粒體Cytb基因部分序列,其A+T含量(54.2%)高于C+G含量(45.8%)。褐石斑魚Cytb基因序列遺傳變異水平較低,在目的片段內(nèi)僅檢測到18個多態(tài)位點,均發(fā)生在密碼子第3位點,為T/C和A/G兩種轉(zhuǎn)換突變。

在88個個體中,共檢測到7種單倍型,其中Hap1為3個群體(71個個體)所共有,Hap6為韓國和中國廈門群體共有,而其他單倍型在群體間分布不均,每個地理群體都有其各自特有的單倍型(表1)。由表2可知,韓國群體的單倍型類型較中國海南和廈門群體豐富,其單倍型多態(tài)度最高,為0.556 67。各群體內(nèi)平均核苷酸差異度和核苷酸多態(tài)度均隨突變位點數(shù)目的增加而增加,呈正比例關(guān)系,韓國群體個體間的平均核苷酸差異度(0.613 33)、核苷酸多態(tài)度(0.001 53)均高于中國海南和廈門群體。褐石斑魚中國海南群體(h=0.338 10,π=0.000 88)和廈門群體(h=0.323 53,π=0.001 13)均屬于低單倍型多態(tài)度和低核苷酸多態(tài)度類群;褐石斑魚韓國群體(h=0.556 67,π=0.001 53)屬于高單倍型多態(tài)度和低核苷酸多態(tài)度類群。綜上可知,西太平洋海區(qū)褐石斑魚總體遺傳多樣性水平較低,韓國群體的遺傳多樣性水平高于中國海區(qū)的海南群體和廈門群體。

表1 褐石斑魚在3個群體中的單倍型分布

表2 褐石斑魚的取樣信息以及遺傳多樣性指數(shù)

2.2 單倍型譜系結(jié)構(gòu)

ModelTest結(jié)果顯示,褐石斑魚3個地理群體的Cytb基因部分序列的最佳模型是HKY。使用PAUP軟件構(gòu)建了褐石斑魚單倍型NJ、MP和ML樹,結(jié)果顯示3種方法得出的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致。褐石斑魚的Hap3、Hap4、Hap5、Hap6、Hap7和Hap1單倍型首先聚合成一個進(jìn)化分支,然后與Hap2單倍型聚合成褐石斑魚進(jìn)化分支,最后與巨石斑魚和斜帶石斑魚外群分支聚合?？傮w而言,褐石斑魚單倍型進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較為簡單,并且3個地理種群的單倍型不能依據(jù)地理分布各自聚類,而是相互聚類為一個大的進(jìn)化分支,不存在明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)(圖1)。采用中介網(wǎng)絡(luò)圖法構(gòu)建褐石斑魚單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,結(jié)果顯示褐石斑魚的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖為星形結(jié)構(gòu),不同地理分布的單倍型沒有單獨聚類,與系統(tǒng)進(jìn)化樹的譜系結(jié)構(gòu)類似,不存在顯著的地理譜系結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 褐石斑魚線粒體Cytb基因單倍型的最大釋然進(jìn)化樹

圖2 褐石斑魚3個群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 群體遺傳分化

對3個群體的遺傳分化進(jìn)行分子方差分析(表3),結(jié)果顯示90.28%的遺傳差異來源于群體內(nèi),僅9.72%的遺傳差異來源于群體間,統(tǒng)計結(jié)果差異顯著(P=0.005 25),表明褐石斑魚遺傳變異主要來源于群體內(nèi),不同群體間存在中等水平的遺傳差異,群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)為0.097 16。根據(jù)HKY距離模型計算兩兩群體間的FST值(表4),結(jié)果顯示韓國與中國海南群體間遺傳分化最高(FST為0.177 5),中國海南與廈門群體間遺傳分化最低(FST為0.013 4)。綜上,西太平洋海區(qū)褐石斑魚地理群體間存在不同程度的遺傳分化,并且分化程度大小與地理距離相關(guān)。Mantel檢驗結(jié)果顯示,褐石斑魚群體間遺傳距離和地理距離間存在顯著相關(guān),褐石斑魚地理群體間遺傳距離與群體間的地理距離成線性相關(guān)(圖3)。

圖3 褐石斑魚兩兩群體間地理距離與遺傳距離FST/(1-FST)的回歸分布

表3 褐石斑魚群體的分子方差分析

表4 褐石斑魚群體間的FST值(對角線下)和對應(yīng)的P值(對角線上)

2.4 群體擴張歷史特征

對褐石斑魚3個地理群體以及其合并群體分別進(jìn)行Tajima′sD檢驗和Fu′sFs檢驗(表5),結(jié)果顯示褐石斑魚中國海南、廈門和韓國地理群體Tajima′sD和Fu′sFs值均為負(fù)值,統(tǒng)計檢驗結(jié)果不顯著(P>0.05)。褐石斑魚合并群體的Tajima′sD和Fu′sFs值為較大的負(fù)值,統(tǒng)計檢驗結(jié)果顯著(P<0.05)。表明褐石斑魚3個地理種群的線粒體Cytb基因符合中性進(jìn)化,西北太平洋海區(qū)的褐石斑魚種群可能發(fā)生了群體擴張的歷史動態(tài)。

表5 褐石斑魚群體的Tajima′s D和Fu′s Fs統(tǒng)計值及相應(yīng)的P值

3 討論

3.1 褐石斑魚的遺傳多樣性

褐石斑魚為暖水性底層魚類,主要分布于西太平洋中國、日本、韓國等3個國家,其生長速度快、適應(yīng)能力強、經(jīng)濟價值高,有潛力成為我國石斑魚養(yǎng)殖的名貴新品種。然而,有關(guān)褐石斑魚種質(zhì)資源遺傳背景調(diào)查,尤其是種質(zhì)遺傳多樣性評估尚未開展系統(tǒng)研究,不利于我國褐石斑魚種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)利用。遺傳多樣性是魚類生物多樣性的重要組成部分,種內(nèi)遺傳多樣性越豐富,物種對環(huán)境的適應(yīng)能力越強[24]。線粒體DNA的單倍型多態(tài)度(h)和核苷酸多態(tài)度(π)是衡量種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)。Grant等[25]提出魚類DNA單倍型多態(tài)度和核苷酸多態(tài)度高低水平的臨界值分別是0.5和0.005,根據(jù)不同的臨界值,可將魚類遺傳多樣性分為高單倍型多態(tài)度(h>0.5)和高核苷酸多態(tài)度(π>0.005)、高單倍型多態(tài)度(h>0.5)和低核苷酸多態(tài)度(π<0.005)、低單倍型多態(tài)度(h<0.5)和高核苷酸多態(tài)度(π>0.005)以及低單倍型多態(tài)度(h<0.5)和低核苷酸多態(tài)度(π<0.005)等4種類型。本研究結(jié)果顯示,褐石斑魚3個地理群體合并后的單倍型多態(tài)度(h=0.445 47)和核苷酸多態(tài)度(π=0.001 29)屬于低單倍型多態(tài)度和低核苷酸多態(tài)度類群,低于大西洋真鱈(Gadusmorhua,h=0.97,π=0.018 6)[26]、小黃魚(Larimichthyspolyactis,h=0.989,π=0.004 8)[27]等海洋魚類的Cytb基因序列遺傳多樣性。石斑魚屬的斜帶石斑魚(h=0.740,π=0.003 69)[28]、棕點石斑魚(E.fuscoguttatus,h=0.747,π=0.004 14)[29]的Cytb基因序列遺傳多樣性高于本研究的褐石斑魚群體。推測可能是由于人類對褐石斑魚過度捕撈及各種活動對其棲息地造成破壞[7],導(dǎo)致其繁殖群體數(shù)量大幅度下降,從而使褐石斑魚遺傳多樣性水平下降。在非洲海區(qū)的安氏石斑魚(E.andersoni)的遺傳多樣性研究中也有類似的結(jié)論,由于人類捕撈活動造成安氏石斑魚野生種群數(shù)量下降,從而導(dǎo)致其種群遺傳多樣性水平較低(h=0.367,π=0.001)[30]。本研究結(jié)果提示需要加強中國海區(qū)褐石斑魚野生種質(zhì)資源的保護(hù),人工繁育的親本有必要補充遺傳多樣性較高的韓國親本來保證繁育后代的遺傳多樣性水平。

3.2 褐石斑魚群體遺傳分化

遺傳分化指數(shù)(FST)是衡量不同地理群體間遺傳差異的重要指標(biāo)。Balloux等[31]依據(jù)遺傳分化指數(shù)的臨界值,將群體遺傳分化程度劃分為4種類型:極小遺傳分化類型(00.25)。本研究中兩兩群體間的FST分析結(jié)果顯示,地理距離最遠(yuǎn)的韓國和中國海南群體間遺傳分化程度最高(FST為0.177 5),屬于較大遺傳分化類型;地理距離最近的中國海南和廈門群體間遺傳分化最低(FST為0.013 4),屬于極小遺傳分化類型;分子方差分析結(jié)果也顯示,褐石斑魚3個地理群體間的遺傳分化程度為中度遺傳分化類型(FST為0.097 16)。地理隔離是群體間基因交流的天然屏障,在海洋這個開放的環(huán)境中,通常認(rèn)為距離隔離是促使遺傳分化產(chǎn)生的主要機制[32]。王登玉等[28]對中國東南近海斜帶石斑魚群體遺傳分化的研究表明,斜帶石斑魚地理群體間存在極大的遺傳分化(FST為0.344),并且距離隔離是斜帶石斑魚3個地理群體間遺傳分化的主要因素。傅蒙娜等[33]基于線粒體Cytb基因開展中國海區(qū)3個條紋斑竹鯊(Chiloscylliumplagiosum)群體遺傳分化的研究也表明,地理距離較遠(yuǎn)的福建群體和海南群體遺傳分化差異顯著,距離隔離是條紋斑竹鯊群體遺傳分化的重要因素。本研究中Mantel檢驗結(jié)果顯示褐石斑魚群體間遺傳距離FST/(1-FST)和地理距離間存在顯著相關(guān)(r=0.984 0),并且統(tǒng)計檢驗極顯著(P=0.000 0),表明距離隔離是褐石斑魚群體遺傳分化的主要因素。Richardson等[34]在對黑緣石斑魚(E.morio)的線粒體DNA遺傳多樣性檢測中發(fā)現(xiàn)其稚魚及成魚的定居習(xí)性,導(dǎo)致群體間遺傳分化顯著。褐石斑魚為暖水性底層魚類,棲息于巖礁和底質(zhì)為沙泥質(zhì)的海域,成魚棲息深度為20-200 m,幼魚經(jīng)常出現(xiàn)在淺水區(qū)[1],是具有較強領(lǐng)域性的定居種。褐石斑魚的這種生活特性可能是造成其群體存在距離隔離遺傳分化的主要原因。由于褐石斑魚不同地理群體間存在遺傳分化,所以在褐石斑魚人工繁育時,可以選擇來自不同地理群體的親體,來提高繁殖群體的遺傳分化水平,避免人工繁育后代出現(xiàn)近交衰退而導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。

3.3 褐石斑魚群體擴張歷史特征

Slatkin等[20]指出自然種群遭受瓶頸效應(yīng)后的群體快速擴張可以導(dǎo)致出現(xiàn)星狀結(jié)構(gòu)的基因譜系。本研究中褐石斑魚單倍型網(wǎng)絡(luò)圖表現(xiàn)為簡單星形結(jié)構(gòu),符合群體擴張歷史特征。在絲鰭紫魚(Pristipomoidesfilamentosus)[35]和安氏石斑魚[30]等海洋魚類中也存在類似的結(jié)果,因為群體擴張歷史導(dǎo)致單倍型網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)簡單星狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Tajima′sD和Fu′sFs檢驗是兩種常用的檢驗種群歷史是否發(fā)生擴張的參數(shù),統(tǒng)計檢驗顯著的負(fù)數(shù)D值可能是選擇作用、群體擴張和瓶頸效應(yīng)等原因造成的[21]。Fu′sFs檢驗的方法主要是基于中性進(jìn)化的前提下樣本中出現(xiàn)所觀測到的等位基因(單倍型)數(shù)目的概率。Fs檢驗對群體擴張非常敏感,群體擴張通常產(chǎn)生絕對值較大的負(fù)數(shù)Fs值[22]。合并褐石斑魚3個地理群體的數(shù)據(jù)進(jìn)行中性檢驗發(fā)現(xiàn),整個群體的D值為負(fù)值,Fs值為較大的負(fù)值(-4.195 6),并且統(tǒng)計檢驗結(jié)果顯著(P<0.05)。Tajima′sD和Fu′sFs的檢驗結(jié)果也證實西太平洋海區(qū)褐石斑魚群體存在擴張的歷史特征。Chen等[36]研究表明,赤點石斑魚(E.akaara)的群體擴張歷史動態(tài)是由更新世冰期海平面下降造成大部分棲息地消失,導(dǎo)致其種群避難于東海和南海盆地產(chǎn)生的。與赤點石斑魚類似,褐石斑魚大部分現(xiàn)有棲息地位于大陸架。伴隨每次冰盛期(Glacial maximum),海平面下降120-140 m[37]。褐石斑魚棲息地也會因為海平面的下降而逐漸形成陸地,導(dǎo)致其種群避難于海洋盆地,待海平面上升后重新進(jìn)入現(xiàn)有棲息地,分布區(qū)迅速擴大,呈現(xiàn)種群擴張的歷史動態(tài)。本研究結(jié)果表明,褐石斑魚不僅整體遺傳多樣性水平較低,而且容易受到氣候變化導(dǎo)致種群數(shù)量波動,在全球氣候變化的背景下,加強對褐石斑魚種質(zhì)資源的保護(hù)尤為關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本研究開展了褐石斑魚西太平洋海區(qū)的中國海南島(HN)、福建廈門(XM)和韓國濟州島(HG) 3個地理群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究。結(jié)果顯示:各地理群體總體遺傳多樣性水平較低,韓國群體遺傳多樣性水平高于中國海南和廈門群體。褐石斑魚群體遺傳變異主要來源于群體內(nèi),群體間存在中度遺傳分化。距離隔離是褐石斑魚群體遺傳分化的主要因素。總之,褐石斑魚總體遺傳多樣性水平較低,其種群存在擴張的歷史特征,易受到漁業(yè)捕撈和氣候變化的影響導(dǎo)致其種群衰退,因此急需加強褐石斑魚野生種群的監(jiān)測和保護(hù)。