蝦殼活性肽對斑馬魚氧化應激損傷的保護作用

賀舒雯朱豪杰韓鵬薇楊賽杰崔 波程云輝, 李虹輝文 李

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院,湖南 長沙 410114;2. 齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院,山東 濟南 250353)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦,是淡水經(jīng)濟蝦類,其肉質細嫩、味道鮮美且營養(yǎng)價值高廣受人們的喜愛。中國作為世界上最大的克氏原螯蝦生產(chǎn)和消費國,每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸蝦殼等副產(chǎn)物,絕大部分副產(chǎn)物被直接丟棄[1]。研究[2-4]表明,蝦殼中富含蛋白質和各種礦物元素,酶解克氏原螯蝦殼蛋白制備的生物活性肽含有豐富的氨基酸,可為機體提供所需的營養(yǎng)和能量。此外,蝦殼活性肽在體外具有較強的自由基清除能力和還原能力,被證明具有較好的抗氧化潛力。但是,當前關于克氏原螯蝦蝦殼肽的研究主要集中在體外抗氧化活性評價,而對機體內抗氧化應激作用及機制研究鮮有報道。

生物活性肽(Bioactive peptides,BP)是由氨基酸通過肽鍵共價連接形成的有機物質,是蛋白質水解的中間產(chǎn)物,兼具氨基酸與蛋白質的生物學功能,在機體健康中發(fā)揮著重要作用[5]。已有研究報道,生物活性肽具有營養(yǎng)、促消化、抗氧化、抗炎和免疫調節(jié)等功能特性[6-7];生物活性肽可有效清除體內過剩的活性氧自由基,保護細胞和線粒體的正常結構和功能,還可促進超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性,以及降低脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛含量,在保護機體免受氧化應激損傷中起著重要作用[8-10]。氧化應激是機體內一種有害的氧化還原失衡狀態(tài),過多的活性氧自由基會對核酸、蛋白質、糖類、脂質等生物大分子造成氧化損害,影響細胞的功能甚至存活,是導致組織損傷和疾病發(fā)生的重要因素之一[11-12]。

研究[13]發(fā)現(xiàn),酶解牙鲆肌肉蛋白制備的生物活性肽對AAPH誘導的Vero腎成纖維細胞氧化應激損傷具有保護作用。紅鰭笛鯛魚鱗肽可保護果蠅免受H2O2、百草枯和紫外線照射引起的氧化損傷[14]。來源于金烏賊中的抗氧化肽能提高超氧化物歧化酶活性,降低氧化損傷秀麗隱桿線蟲體內活性氧和丙二醛含量,具有激活抗氧化防御、抑制自由基和脂質過氧化的作用[15]。王際英等[16]在飼料中添加適量的鱈魚小肽顯著提高了星斑川鰈幼魚的消化酶活性和抗氧化能力,促進機體生長,并在一定程度上提升肌肉品質。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可增強中華絨螯蟹抗氧化能力,對脂多糖誘導的肝胰臟損傷和細胞凋亡具有保護作用。課題組[18]前期研究發(fā)現(xiàn),日糧添加蝦殼蛋白酶解物能顯著促進斑馬魚生長,提升其抗氧化能力及核心生物中相關基因表達,有益于機體健康。研究擬利用酶解法制備蝦殼活性肽,測定其體外抗氧化活性,并分析日糧添加蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚的生長性能、肌肉氨基酸含量、肌纖維組織形態(tài)及抗氧化功能的影響,以期為防治氧化應激損傷的相關疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦殼粉:湖南省水產(chǎn)科學研究所;

斑馬魚:360尾,初始平均體重為(0.46±0.02) g,長沙學院水生動物營養(yǎng)與品質調控湖南省重點實驗室;

斑馬魚飼料:安徽新彩虹飼料科技有限公司;

堿性蛋白酶:20萬U/g,北京索萊寶科技有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼:98%,北京百靈威有限公司;

十水四硼酸鈉:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛、蛋白質羰基等測定試劑盒:南京建成生物工程研究所;

RNA抽提試劑、SYBR Green qPCR Mix:莫納生物科技有限公司;

熒光定量PCR引物:鉑尚生物技術(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦殼活性肽制備及體外抗氧化活性分析 采用堿提酸沉法提取克氏原螯蝦殼蛋白(PCSP),并測定其蛋白質含量。在pH 9.0,37 ℃條件下,按m蝦殼蛋白∶V水=1∶20 (g/mL)將蝦殼蛋白與水混合,堿性蛋白酶添加量為4 000 U/g,水解3 h。將水解產(chǎn)物置于沸水浴中處理10 min使酶失活,收集上清液,置于-20 ℃預凍12 h后進行真空冷凍干燥,具體參數(shù)為:冷阱溫度-60 ℃,真空度10 Pa左右,干燥48 h,獲得蝦殼活性肽(PCSBP)凍干粉,并評估其體外抗氧化活性。通過測定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)和羥自由基(·OH)清除能力,分析其體外抗氧化活性,并使用液相色譜—串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定蝦殼活性肽序列。

1.2.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理 選取360尾健康、性成熟且規(guī)格大小相一致的野生型斑馬魚,初始平均體重為(0.46±0.02) g,將其隨機分為正常組(ND)、禁食組(FA)、禁食后恢復投喂基礎日糧組(FR-ND)和禁食后恢復投喂蝦殼活性肽日糧組(FR-PCSBP)4個組,每組設置3個重復,每個重復30尾魚。斑馬魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng),水溫保持在24～26 ℃,采取定時投喂策略,試驗周期為14 d。

1.2.3 斑馬魚生長指標及肌肉氨基酸含量測定 試驗結束后,分別對各組斑馬魚進行稱重和測量,計算存活率、終末體重和終末體長等指標,分析蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚生長性能的影響。稱取斑馬魚新鮮肌肉組織50～100 mg,利用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量。

1.2.4 肌肉組織形態(tài)及超微結構特性 取新鮮肌肉組織用4%多聚甲醛固定液固定24 h后,制作石蠟切片并進行蘇木素—伊紅(HE)染色,通過光學顯微鏡觀察肌肉組織形態(tài)變化。將1 mm3大小組織置于2.5%戊二醛固定液中固定,再用四氧化鋨固定后制作超薄切片,用乙醇脫水,再用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察肌肉超微結構變化并采集圖像。

1.2.5 抗氧化物質及氧化應激指標測定 稱取100 mg肌肉樣品,按m肌肉∶V生理鹽水=1∶9 (g/mL)比例加入生理鹽水,在冰浴條件下用勻漿儀進行組織勻漿,4 ℃、4 000 r/min離心15 min,收集上清液待測。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定肌肉超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量,以及氧化應激指標丙二醛(MDA)和蛋白質羰基(PC)含量。

1.2.6 抗氧化相關基因表達分析 稱取新鮮肌肉樣品50～100 mg,采用Trizol法提取總RNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix試劑在Bio-Rad CFX96TM系統(tǒng)中進行抗氧化相關基因(nrf2、keap1、sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx1b、gpx2、gpx3、gsta1、gstm1、gstr、gstz1、gsr)表達分析,熒光定量PCR引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列?

1.2.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析(One-way-ANOVA)與顯著性檢驗,所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差表示,Duncan法確定各組間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 蝦殼活性肽體外抗氧化活性分析及肽序測定

利用堿性蛋白酶對蝦殼蛋白進行水解后獲得蝦殼活性肽,并對其進行體外抗氧化活性分析(圖1)及肽序測定(圖2)。結果顯示,酶解后獲得的蝦殼活性肽對DPPH自由基和羥自由基清除率為(46.35±1.32)%,(75.22±2.18)%,分別是谷胱甘肽的0.53倍和0.77倍,表現(xiàn)出潛在的抗氧化活性;采用LC-MS/MS法測定蝦殼活性肽序列,結果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)2 769條匹配肽譜,其中肽序列為1 600條,蛋白質組數(shù)量為122個,具有特征肽段的蛋白質140個。已有研究[3]表明,酶解克氏原螯蝦殼制備的生物活性肽含有豐富的氨基酸,并具有較強的還原能力和羥自由基清除能力。唐志紅等[4]利用克氏原螯蝦副產(chǎn)物分離蛋白為原料,以胰酶酶解制備肽混合物,并通過體外抗氧化試驗發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物具有較強的抗氧化活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 肽譜匹配分數(shù)分布及肽譜匹配的前體質量誤差

2.2 蝦殼活性肽對斑馬魚生長性能的影響

通過測定蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚生長性能的影響(表2)可知,各組之間斑馬魚存活率無顯著差異(P>0.05),禁食組中斑馬魚終末體重和終末體長均明顯下降(P<0.05);當恢復正常飲食后斑馬魚生長性能有所改善,但低于正常組水平,而恢復含蝦殼活性肽飲食后斑馬魚生長性能逐漸恢復到正常組水平,說明日糧添加蝦殼活性肽能有效改善禁食脅迫下斑馬魚的生長性能。

2.3 蝦殼活性肽對斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響

通過測定蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響(表3)可知,與正常組相比,禁食組中斑馬魚肌肉氨基酸總量明顯下降,必需氨基酸和呈味氨基酸含量也呈下降趨勢,當恢復正常飲食后肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量均有所升高,但未達到正常組水平,而恢復含蝦殼活性肽飲食后斑馬魚肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量均恢復到正常組水平,說明日糧添加蝦殼活性肽有助于氨基酸合成。

表3 蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚肌肉氨基酸含量的影響

2.4 蝦殼活性肽對斑馬魚肌肉組織結構的影響

通過觀察蝦殼活性肽對禁食脅迫下斑馬魚肌肉組織結構的變化(圖3)可知,與正常組相比,禁食后可見斑馬魚肌細胞間隙增寬,肌纖維出現(xiàn)部分斷裂現(xiàn)象,胞質輕微水腫,有空泡形成,當恢復正常飲食后肌纖維排列相對規(guī)則,細胞間隙減少,肌肉組織結構有所恢復,但肌纖維仍有少量斷裂現(xiàn)象,而在恢復含蝦殼活性肽飲食后肌肉組織排列整齊緊密,肌纖維未見明顯斷裂,Z線連續(xù),H帶結構清晰,水腫程度降低,肌肉組織結構基本恢復到正常組水平。研究[19]發(fā)現(xiàn),正常斑馬魚胚胎在受精后24～120 h時,肌原纖維超微結構正常,排列整齊,Z線、M線清晰可見,而隨著檳榔堿處理后,斑馬魚肌纖維排列和超微結構形態(tài)發(fā)生了顯著變化,并出現(xiàn)細胞質空泡、線粒體腫脹等現(xiàn)象。此外,正常斑馬魚心肌纖維細胞間絲連接緊密,Z線、H帶和明暗帶也能清晰區(qū)分,當經(jīng)過三氯生暴露后,肌細胞核膜輕微起皺,肌絲間隙有一定水腫跡象,肌絲斷裂,H帶和明暗帶難以區(qū)分[20]。這與禁食后斑馬魚呈現(xiàn)出的肌肉組織及超微結構變化均有相似之處,說明當機體遭受應激后會造成肌肉組織損傷。

2.5 蝦殼活性肽對斑馬魚肌肉抗氧化功能的影響

通過對斑馬魚肌肉抗氧化酶活性(圖4)和氧化應激損傷(圖5)指標的測定與分析可知,禁食組中肌肉抗氧化酶SOD、GSH-PX活性和GSH含量均有不同程度降低,氧化應激損傷指標MDA、PC含量顯著增加(P<0.05)。與禁食組相比,恢復正常飲食組中SOD、GSH-PX酶活性及GSH含量得到顯著提高,并降低了MDA含量(P<0.05),而在恢復含蝦殼活性肽飲食組中,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性和GSH含量均顯著提升,且恢復到正常飲食水平,同時還顯著降低了MDA、PC含量(P<0.05),有效地改善了斑馬魚肌肉氧化應激損傷。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

禁食脅迫誘導機體內生成過量自由基,使組織受到氧化損傷[21]。GSH-Px是機體中清除脂質過氧化物和過氧化氫的重要抗氧化物[22-23],受禁食脅迫后其活性顯著下降,其根本原因是由于禁食使機體不能夠合成充足的氨基酸,導致GSH合成受阻,而GSH作為GSH-Px發(fā)揮作用的輔助底物,GSH含量下降,GSH-Px的活性必定下降[24]。細胞中多不飽和脂肪酸過氧化會產(chǎn)生MDA,而MDA含量是評價脂質氧化性損傷的重要指標[25]。吳曉雲(yún)等[26]研究發(fā)現(xiàn),禁食7 d長江鱘肌肉組織中的MDA含量上升和GSH-Px活力下降,與試驗過程中禁食脅迫下斑馬魚肌肉組織發(fā)生的變化一致,說明禁食使斑馬魚肌肉抗氧化能力下降。在斑馬魚攝食后,機體合成氨基酸的底物得到補充,氨基酸開始合成,GSH得到補充,隨之GSH-Px活力也上升。

2.6 蝦殼活性肽對斑馬魚肌肉抗氧化相關基因表達的影響

通過對斑馬魚肌肉抗氧化相關基因表達的測定與分析(圖6),結果顯示,禁食組中斑馬魚肌肉抗氧化酶基因sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gstm1、gstr、gstz1、gsr轉錄水平較正常組顯著降低(P<0.05),當恢復正常飲食后,sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gstm1、gstz1、gsr表達明顯升高,而在恢復含蝦殼活性肽飲食后,發(fā)現(xiàn)抗氧化信號分子nrf2轉錄水平顯著下調,keap1明顯上調,其下游抗氧化酶基因sod1、sod2、cat、gpx1a、gpx2、gpx3、gstm1、gstr、gstz1、gsr表達顯著升高且部分基因表達量達到最高值(P<0.05),說明增加了斑馬魚肌肉組織抗氧化防御能力,以改善禁食誘導的氧化應激損傷。

圖6 蝦殼活性肽對斑馬魚肌肉抗氧化相關基因表達的影響

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,keap1)-核因子E2相關因子2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor-2,nrf2)是維持過氧化物和抗氧化平衡的重要信號通路。已有研究[27]證明,nrf2是一種關鍵的轉錄因子,通過與其下游抗氧化酶基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應元件ARE結合,促進抗氧化酶基因(sod、cat、gpx、gst等)轉錄表達。Deng等[28]研究報道,上調nrf2表達可提高肌肉中sod、cat、gpx和gst基因的表達。研究在飲食中添加蝦殼活性肽后,斑馬魚肌肉nrf2表達顯著上調,keap1下調并恢復至正常飲食水平,其下游抗氧化酶活性及基因表達得到顯著提高,并顯著降低了MDA、PC含量,有效減輕了肌肉氧化應激水平,恰好佐證了上述結論。

3 結論

研究利用酶解法制備得到了蝦殼活性肽,在體外表現(xiàn)出潛在的抗氧化活性,而在日糧中添加蝦殼活性肽可顯著提高禁食脅迫下斑馬魚肌肉超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量,并降低丙二醛(MDA)和蛋白質羰基(PC)的生成量。此外,還顯著增加抗氧化酶基因表達,并且上調抗氧化信號分子nrf2以及下調keap1表達水平,進而增強斑馬魚抗氧化功能,緩解機體氧化應激損傷。研究證明蝦殼活性肽對氧化應激損傷具有一定的保護作用,但對于蝦殼活性肽的分離提純以及在機體中的分子機制尚不清楚,有待進一步深入研究。