丹酚酸B 對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的生物學(xué)變化及機制

岑美婷

廣州市第一人民醫(yī)院（廣東廣州 510180）

骨質(zhì)疏松癥是骨病中最常見的一種，表現(xiàn)為骨礦質(zhì)密度低，骨微結(jié)構(gòu)退化，從而引起骨脆性骨折［1］。目前，骨質(zhì)疏松癥的治療藥物主要為包括雙磷酸鹽、降鈣素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑在內(nèi)的骨吸收抑制劑［2］。雖然這些藥物對骨量起到有效的穩(wěn)定作用，卻不會使骨形成增加。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種很容易從骨髓等組織中分離出來的是非造血細(xì)胞［3］。MSCs具有多種能力分化成其他細(xì)胞類型，包括骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)元［4］。近年來，在促進骨折、節(jié)段性骨缺損等愈合方面，一直在使用MSCs，而且成績喜人。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將 MSCs 引導(dǎo)至骨骼可以促進骨形成并增加骨量［5］。在骨質(zhì)疏松癥患者中，研究顯示MSCs成骨分化潛力降低，因此，尋找有效的方法來促進MSCs成骨分化顯得刻不容緩。

中藥丹參的主要生物活性成分丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB）被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療［6］。研究顯示，SalB具有保護神經(jīng)的功能，同時也能緩解肝臟纖維化［7-8］。最近的研究表明SalB可以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展［9］。丹參聯(lián)合MSCs治療股骨頭缺血性壞死可能通過增加股骨頭中血管內(nèi)皮生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)促進血運重建，促進骨化和血運重建［10］。丹參能在缺血條件下增強MSCs的存活，可通過促進MSCs的存活來增強對腦缺血性中風(fēng)的治療效果［11］。在本研究中，探討了丹酚酸B對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的影響以及對小鼠MSCs成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 從廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購進8周齡18只體質(zhì)量20～25 g的無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級雌性C57小鼠，許可證號SYXK（粵）2022～0002。飼養(yǎng)條件：溫度24 ℃，相對濕度45%。每天照明12 h的光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水、攝食。每周更換消毒過的墊料、籠具1次。

1.1.2 藥物 SalB是由四川省維克奇生物科技有限公司采購的。使用生理鹽水將其完全溶解后，腹腔注射進小鼠體內(nèi)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及干預(yù)方法 將18只小鼠分為3組：假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松組、SalB治療組，各6只。雙側(cè)卵巢摘除術(shù)后連續(xù)3天進行抗感染治療。術(shù)后4周，每2天注射1次，持續(xù)12周的SalB 2.5 mg/kg腹腔內(nèi)注射SalB治療組，另2組按同樣計量的生理鹽水腹腔注射，療程相同。

1.2.2 建立骨質(zhì)疏松模型 手術(shù)前8小時對小鼠實施例行禁食，手術(shù)前4小時對小鼠實施禁食。把剪刀、鑷子、縫合線、持針器、消毒紗布、酒精棉球、碘伏等一系列的手術(shù)器械都消毒好，然后晾干，待用。對小鼠進行常規(guī)麻醉后，先用酒精棉球浸濕后背部的毛發(fā)，再用刮毛刀清除手術(shù)視野周圍的毛發(fā)，讓手術(shù)視野完全暴露出來，再以雙側(cè)卵巢摘除術(shù)復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。假手術(shù)組把卵巢周圍的一些脂肪組織經(jīng)過同樣的切口切除。在無菌的情況下進行手術(shù)，并嚴(yán)格遵循了實驗動物的倫理學(xué)原則。

1.2.3 骨密度檢測 給藥結(jié)束后，將所有小鼠在麻醉狀態(tài)下處死，并取出它們的右側(cè)股骨，測定它們的骨密度。利用Skyscan1172微型CT掃描系統(tǒng)對小鼠的右側(cè)股骨進行了骨密度的檢查。

1.2.4 qRT-PCR 沖出骨髓MSCs后加入TRIzol裂解液，并按說明書操作提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，PCR反應(yīng)依照SYBR Primix EX Taq TMII試劑盒中所提供的操作說明來進行。采用2-△Ct方法，以Gapdh為內(nèi)參，計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 WB實驗 骨組織經(jīng)液氮研磨勻漿后提取蛋白質(zhì)進行WB實驗。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。接下來進行SDS－PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉與雜交等一系列操作。最后進行化學(xué)發(fā)光與顯影，將膠片進行掃描或拍照，利用凝膠圖像處理系統(tǒng)對目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值進行分析。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1）小鼠右后股骨的骨密度；

2）小鼠骨髓MSCs的Runx2 和 Osterix水平；

3）骨組織核因子-κB 配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和骨保護素（osteoprotegerin，OPG）蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有結(jié)果均采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件處理分析，并對3組間的樣本均數(shù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），以（±s）表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠右后股骨的骨密度

Skyscan1172微型CT掃描系統(tǒng)掃描小鼠右側(cè)股骨測定骨密度， 骨質(zhì)疏松組骨密度為（0.481±0.017）mg/cm3，低于假手術(shù)組骨密度（0.571±0.012）mg/cm3（P=0.001 5）。而SalB治療組骨密度為（0.534±0.008）mg/cm3，高于骨質(zhì)疏松組（P=0.007 3），見圖1。

圖1 各組小鼠股骨骨密度比較

2.2 小鼠骨髓MSCs的Runx2和Osterix水平

經(jīng)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，各組Runx2 和 Osterix水平均表現(xiàn)為：假手術(shù)組＞SalB治療組＞骨質(zhì)疏松組。見圖2。（在Runx2 mRNA中，假手術(shù)組vs骨質(zhì)疏松組，P=0.002 7；骨質(zhì)疏松組vsSalB組，P=0.013 2＜0.05。在Osterix mRNA中，假手術(shù)組vs骨質(zhì)疏松組，P=0.001 3＜0.05；骨質(zhì)疏松組vsSalB組，P=0.002 7。）

圖2 各組Runx2 和Osterix 水平比較

2.3 骨組織OPG和RANKL蛋白水平

經(jīng)WB實驗發(fā)現(xiàn)，骨組織OPG和RANKL蛋白水平均表現(xiàn)為：骨質(zhì)疏松組＜SalB治療組＜假手術(shù)組。見圖3。

圖3 各組OPG 和RANKL 蛋白水平

3 討 論

年齡的增長會導(dǎo)致骨髓中的MSCs數(shù)量下降，進而導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。骨質(zhì)疏松是一種發(fā)病率不斷上升的慢性病，處于更年期的婦女更容易發(fā)生骨質(zhì)疏松［12-13］。更年期是老化的一種自然構(gòu)成，其中包括卵巢的生殖功能下降［14］。可采用手術(shù)切除卵巢，也可以采用醫(yī)源性切除的方法，如化學(xué)治療和放射治療等。因此，該研究利用小鼠的卵巢摘除后，來探討更年期后的骨質(zhì)疏松問題。已知，卵巢切除術(shù)后會引起骨質(zhì)疏松癥，骨密度、生物力學(xué)強度、骨質(zhì)量和骨小梁微結(jié)構(gòu)明顯下降，上述變化與雌激素缺乏有關(guān)［15］。這種方法的優(yōu)勢是可重復(fù)，可獲得較高的成功率。有研究顯示，在小鼠去卵巢后，骨小梁的數(shù)量顯著降低，骨質(zhì)稀疏。與此同時，與正常小鼠相比，破骨細(xì)胞的數(shù)量要多。此外，與正常小鼠相比，它的破骨功能也變得更加活躍［16-17］。

骨骼是一種緊密的結(jié)締組織，包括大約 80%的皮質(zhì)骨和約 20% 的小梁骨［18］。骨骼會經(jīng)過不斷地重塑，通過重新吸收舊骨，并在同一位置形成相同數(shù)量的新骨［19-20］。骨礦物質(zhì)密度已被看作是骨強度的替代指標(biāo)，也是骨質(zhì)量的重要因素。骨質(zhì)疏松癥是因為骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化，它會提高骨脆性，還會提高髖骨和脊椎骨折的易感性，所以與骨折風(fēng)險提高相關(guān)［21］。

根據(jù)報道，Runx2與Osterix是前成骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵基因［22-23］。由于骨的形成依賴于成骨細(xì)胞的分化，Runx2和Osterix的表達(dá)被認(rèn)為是骨骼發(fā)育的成骨轉(zhuǎn)錄因子［24］。Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子稱為Runx因子，其蛋白質(zhì)在基因啟動子調(diào)控復(fù)合物的形成過程中，位于整合細(xì)胞信號的亞核區(qū)內(nèi)。在骨骼發(fā)育的胚胎發(fā)生過程中，Runx2是人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。它被公認(rèn)具有致癌的特性，許多研究顯示Runx2功能的紊亂會引起不同腫瘤的進展和侵襲［25］。長期以來，Osterix（Osx）是調(diào)控成骨細(xì)胞分化及骨礦化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。有研究顯示，Osx不僅在膜內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，同時也可以在軟骨的最終分化過程中對軟骨內(nèi)成骨產(chǎn)生影響［26］。

骨重塑是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞交互作用調(diào)控的［27］。近年來，由于核因子-κB 受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）、RANKL和OPG對骨重建的影響，人們對它們的認(rèn)識越來越多［28］。RANK 是腫瘤壞死因子家族中的一員，主要表達(dá)于破骨細(xì)胞或其前體。RANK與其配體RANKL相互作用并通過控制破骨細(xì)胞的分化、增殖和總體存活，從而調(diào)控骨吸收［29］。據(jù)報道，SalB可以增強OPG的表達(dá)，從而增加了 MSCs的成骨分化［30］。同時，SalB通過調(diào)節(jié) RANKL/RANK/OPG信號通路來改善潑尼松所導(dǎo)致的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨質(zhì)減少癥并改善骨質(zhì)量［9］。本實驗的結(jié)果顯示，與骨質(zhì)疏松組相比，SalB 治療后OPG及RANKL蛋白的表達(dá)均增加。

丹參屬于中草藥，其藥理功效豐富。SalB是丹參中含量最高、活性最高的親水性組分之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，SalB 具有抗氧化、抗炎和抗纖維化作用，還可抑制細(xì)胞凋亡［31］。同時，SalB可通過激活ERK通路，增強人體內(nèi)充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力［32］。此外，SalB可經(jīng)Wnt/β-Catenin通路，增強人牙周膜細(xì)胞的成骨分化［33］。本實驗發(fā)現(xiàn)，SalB處理后，小鼠的骨密度明顯高于骨質(zhì)疏松組，而Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)也明顯高于比骨質(zhì)疏松組。

綜上所述，丹參對小鼠的骨質(zhì)疏松具有一定的影響，但還需要更多的實驗來驗證本研究的結(jié)論。