CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤的現(xiàn)狀研究

彭 倩 呂 琳

廣州市第一人民醫(yī)院（華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院）腫瘤科（廣東廣州 510180）

1 前 言

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅我國居民健康的重大疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)2020年中國腫瘤死亡病例數(shù)300萬例，占全球腫瘤死亡人數(shù)的30%，排名前五的癌癥類型分別為肺癌、肝癌、胃癌、食道癌和結(jié)直腸癌［1］。由此可見，惡性腫瘤在中國乃至全世界仍然是一個(gè)亟待解決的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。近年來，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，腫瘤治療已不止局限于傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)治療，免疫療法、納米療法、干細(xì)胞治療和基因療法為臨床腫瘤治療提供了新思路、新方法。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）細(xì)胞療法作為惡性腫瘤免疫治療最有希望的進(jìn)展之一，在血液腫瘤領(lǐng)域取得了令人鼓舞的療效，受到國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注［2］。

CAR-T細(xì)胞療法通過基因工程技術(shù)來改造T細(xì)胞，使其獲得識別腫瘤細(xì)胞的能力，從而特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。2017年8月，第一個(gè)CAR-T細(xì)胞療法Tisagenlecleucel（Kymriah）被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療B前體急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia，BCP-ALL）；同年10月，第二個(gè) CAR-T細(xì)胞療法Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）被批準(zhǔn)用于治療成人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）［3］。至此，全球范圍內(nèi)掀起了對不同血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤的研究活動(dòng)，以評估CAR-T治療在這些疾病中的安全性和有效性。多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)顯示，CD19特異性的 CAR-T細(xì)胞在治療B細(xì)胞淋巴瘤中取得了令人振奮的成績，其完全緩解率（complete remission，CR）可達(dá)70%～94%。靶向CD20的CAR-T細(xì)胞在難治性或復(fù)發(fā)性 B 細(xì)胞淋巴瘤治療中也被證實(shí)了具有可行性和有效性［4-5］。截止2022年12月，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了6款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品上市，國家藥品監(jiān)督管理局也分別于2021年6月和9月先后批準(zhǔn)了兩款 CAR-T產(chǎn)品上市，預(yù)示 CAR-T 治療時(shí)代的到來。可以說，CAR-T細(xì)胞療法的出現(xiàn)，為惡性腫瘤治療提供了一條全新的治療途徑，具有革命性的意義。然而，由于實(shí)體瘤的異質(zhì)性及其周圍所存在的特殊腫瘤微環(huán)境，用CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。

本文將系統(tǒng)介紹 CAR-T 療法在實(shí)體瘤中的最新研究進(jìn)展，包括 CAR-T 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和發(fā)展歷程、CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤常用靶點(diǎn)、影響CAR-T細(xì)胞治療效果的因素以及CAR-T細(xì)胞治療的優(yōu)化等方面的最新研究進(jìn)展，以期為后續(xù)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤提供思路。

2 CAR-T 的結(jié)構(gòu)功能與發(fā)展歷程

在CAR-T細(xì)胞中，研究人員利用基因編輯和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)對T細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其表面表達(dá)嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），CAR能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的特定抗原，進(jìn)而激活CAR-T細(xì)胞攻擊和殺死腫瘤細(xì)胞［6］。典型的CAR結(jié)構(gòu)包括三個(gè)主要部分：細(xì)胞外抗原識別區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)［7］。細(xì)胞外抗原識別區(qū)通常是由重鏈變異區(qū)和輕鏈變異區(qū)連接而成的單鏈可變區(qū)片段抗體（single-chain variable fragment，ScFv），主要負(fù)責(zé)識別并結(jié)合可識別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）或腫瘤特異抗原（tumor-specific antigen，TSA）?？缒^(qū)是CAR-T細(xì)胞內(nèi)域和外域之間的部分，該區(qū)域包括了膜外和膜內(nèi)的氨基酸殘基，負(fù)責(zé)將外域與內(nèi)域連接在一起，并傳遞所識別的癌細(xì)胞抗原的信號，引導(dǎo)T細(xì)胞對癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)則負(fù)責(zé)提供T細(xì)胞活化所需的信號。

早在1989年CAR技術(shù)便已經(jīng)被報(bào)道，直至1993年，Eshhar等人率先研制出第一代CAR-T細(xì)胞，歷經(jīng)30多年持續(xù)不斷的改進(jìn)和發(fā)展，CAR-T細(xì)胞已實(shí)現(xiàn)5代技術(shù)更迭［8］。最初的CAR細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)只有CD3-ζ鏈，在特異性識別腫瘤抗原和改善T細(xì)胞抗腫瘤活性方面是有效的。然而，由于缺乏胞內(nèi)共刺激信號，并不能提供長時(shí)間的T細(xì)胞擴(kuò)增信號和持續(xù)的抗腫瘤效應(yīng)，臨床療效有限［9-10］。在第二代CAR中，共刺激信號（如CD28、4-1BB與CD3-ζ分子整合，CAR-T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性反應(yīng)顯著改善。在第二代的基礎(chǔ)上，第三代CAR結(jié)合了兩個(gè)不同的共刺激結(jié)構(gòu)域（如CD28-41BB- CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ），以期達(dá)到更好的信號傳導(dǎo)的效果和腫瘤殺傷作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)，與第二代相比，第三代CAR-T細(xì)胞殺傷活性并沒有獲得明顯的提升［11-12］，因此，需要進(jìn)一步的研究來探索這些治療的安全性和有效性。第四代CAR是在第二代結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可共表達(dá)一些小分子物質(zhì)（如促炎癥細(xì)胞因子IL-12），以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CAR-T細(xì)胞的進(jìn)一步活化，被稱為 T 細(xì)胞重定向通用細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷（T cells redirected for antigen-unrestricted cytokine-initiated killing，TRUCKs）。TRUCKs可增強(qiáng) T 細(xì)胞活化，激活并吸引先天性免疫細(xì)胞，以消除靶向病變中的抗原陰性癌細(xì)胞［13］。第五代 CAR 基于第二代CAR 結(jié)構(gòu)，在CD28和CD3ζ之間添加了激活其它細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共刺激結(jié)構(gòu)域，如胞內(nèi)IL-2受體β鏈（IL-2 receptor β-chain，IL-2Rβ）結(jié)構(gòu)域和STAT3/5 的結(jié)構(gòu)域，提供抗原依賴的細(xì)胞因子信號，并提高了CAR-T細(xì)胞增殖、存活和抗腫瘤活性［14-15］。

3 CAR-T 細(xì)胞治療惡性實(shí)體瘤的常用靶點(diǎn)

3.1 表皮生長因子受體和表皮生長因子受體變體III

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和EGFR變體III（EGFRvIII）在多種癌癥類型中的高表達(dá)。EGFRvIII約在30%的GBM患者中擴(kuò)增，并且已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中作為GBM腫瘤治療的靶標(biāo)進(jìn)行研究［16］，此次試驗(yàn)中沒有觀察到最嚴(yán)重和最常見的毒性反應(yīng)：細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)系統(tǒng)毒性；但同時(shí)，也沒有觀察到任何患者的MRI腫瘤明顯消退。同樣，在對晚期復(fù)發(fā)/難治性EGFR陽性非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者進(jìn)行EGFR-CAR T細(xì)胞治療的I期臨床試驗(yàn)中，1例患者顯示部分緩解，持續(xù)13個(gè)月以上，6例患者病情穩(wěn)定，2例患者出現(xiàn)病情進(jìn)展［17］。復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性膽道癌EGFR陽性患者接受了1～3個(gè)周期的EGFR-CART細(xì)胞輸注，1 例患者達(dá)到完全緩解，10例患者達(dá)到疾病穩(wěn)定；但有3例患者出現(xiàn)≥3級急性發(fā)熱/寒戰(zhàn)；有患者出現(xiàn)與預(yù)處理治療相關(guān)的1/2級靶介導(dǎo)毒性，包括黏膜/皮膚毒性和急性肺水腫以及≥3級淋巴細(xì)胞減少和血小板減少［18］?？梢?，靶向EGFRvIII和EGFR的CAR-T細(xì)胞對實(shí)體瘤的安全性和治療效果仍有待進(jìn)一步確定。

3.2 白介素13α2受體

白介素13α2受體（interleukin-13α2 receptor，IL-13Rα2）在超過50%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過度表達(dá)，其表達(dá)隨著惡性腫瘤分級的增加而增加，并與長期生存率降低有關(guān)［19］。E.Brown等人對3名腫瘤切除后復(fù)發(fā)性高級別膠質(zhì)瘤（WHO III級和IV級）患者顱內(nèi)注射IL13Rα2-CAR T細(xì)胞以治療腫瘤。接受治療的三名患者在復(fù)發(fā)后的平均生存期為11個(gè)月，最佳生存期接近14個(gè)月，且未觀察到嚴(yán)重治療相關(guān)副作用［20］。該研究團(tuán)隊(duì)也開展了另一項(xiàng)靶向IL13Rα2的同種異體 CAR T 細(xì)胞用于治療復(fù)發(fā)性 GBM，盡管顱內(nèi)和脊柱抗腫瘤作用在臨床和影像學(xué)檢查結(jié)果中顯著，但作用是暫時(shí)的，僅持續(xù)約 7.5 個(gè)月，腫瘤在新區(qū)域復(fù)發(fā)［21］。

3.3 間皮素

間皮素（mesothelin，MSLN）是一種通過糖磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）結(jié)構(gòu)域錨定在質(zhì)膜上的糖蛋白，其表達(dá)通常局限于人體腹膜和胸膜腔的間皮細(xì)胞以及心包，但在多種實(shí)體腫瘤中均可觀察到高表達(dá)［22］。因此，間皮素已經(jīng)成為癌癥免疫治療一個(gè)有吸引力的靶標(biāo)。

Pang等人在間皮素高表達(dá)的晚期胰腺癌 、卵巢癌患者中開展了I期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，MSLN高表達(dá)的晚期胰腺癌患者在輸注靶向MSLN-CAR T細(xì)胞5次后，第240天CT顯示完全緩解［23］。在另一項(xiàng)針對六名晚期胰腺癌患者的試驗(yàn)中，靜脈注射靶向MSLN-CAR T細(xì)胞后疾病穩(wěn)定，兩名患者的無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）分別為3.8個(gè)月和5.4個(gè)月，并且沒有觀察到與腫瘤外毒性相關(guān)的不良并發(fā)癥［24］。2021年11月，S.Adusumilli等人公布的一項(xiàng)MSLN- CAR T 治療惡性胸膜間皮瘤的臨床療效數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在治療評估截止時(shí)間時(shí)，23例惡性胸膜間皮瘤患者接受靶向MSLN-CAR T細(xì)胞治療后中位隨訪時(shí)間為3.19個(gè)月，輸注CAR-T細(xì)胞后的中位生存期為17.7個(gè)月，未觀察到2級以上的細(xì)胞因子釋放綜合征或免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征，未出現(xiàn)“脫靶效應(yīng)事件”［25］。

此外，以人類表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（disialoganglioside 2，GD2）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CD70和Claudin18.2等為靶點(diǎn)的CAR-T治療實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)也正有序進(jìn)行中，見表1。

表1 目前正在進(jìn)行的CAR-T治療實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)項(xiàng)目

4 影響惡性實(shí)體瘤中CAR-T 細(xì)胞療效的因素

導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤療效不佳的因素有很多，如患者疾病進(jìn)展、T細(xì)胞收獲不足、CAR細(xì)胞制造延遲、CAR細(xì)胞產(chǎn)量低、內(nèi)在T細(xì)胞缺陷等，但最主要的還是以下三種原因：缺乏腫瘤特異性抗原、CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸和浸潤腫瘤效率低下、腫瘤免疫微環(huán)境的抑制作用。

4.1 缺乏腫瘤特異性抗原

腫瘤抗原是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中新出現(xiàn)和高表達(dá)的蛋白和多肽分子的總稱。按腫瘤抗原和腫瘤的關(guān)系，腫瘤抗原主要分為兩種：TSA和TAA。TAA是指并非腫瘤細(xì)胞所特有，正常組織細(xì)胞上也有低表達(dá)的抗原［26］。TSA又稱新抗原，是指在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生非同義點(diǎn)突變、密碼子插入/缺失、移碼突變、剪接突變和基因融合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列的發(fā)生改變后僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原，相對于TAA更具特異性［27］。理想的CAR靶標(biāo)應(yīng)在整個(gè)腫瘤中、在多個(gè)患者中高度均勻地表達(dá)，并且在重要的正常組織中表達(dá)最少或沒有表達(dá)。但遺憾的是，實(shí)體瘤的異質(zhì)性高，很難獲得用于CAR-T細(xì)胞治療的理想TSA。

另一方面，低水平的CAR-T靶抗原表達(dá)也是實(shí)體瘤CAR-T治療無效和疾病復(fù)發(fā)發(fā)生的重要因素［28-29］。Anurathapan等人在他們的研究中發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷程度與表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞數(shù)量成正比；CAR-T殺傷能力與抗原表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)，以及“低”抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞能夠逃避CAR介導(dǎo)的殺傷，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［30］。此外，在實(shí)體瘤中，輸注特定靶向的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療后，可能導(dǎo)致靶抗原表達(dá)下調(diào)，使CAR-T細(xì)胞無法識別腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗。Fry等人的研究結(jié)果提示，B-ALL患者輸注靶向CD22的CAR-T細(xì)胞治療后中位緩解持續(xù)時(shí)間為6個(gè)月，復(fù)發(fā)與CD22位點(diǎn)密度降低有關(guān)［31］。

總體而言，不論是腫瘤特異性抗體的設(shè)計(jì)還是腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的密度，都可以影響CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，嚴(yán)重限制了CAR-T在實(shí)體瘤中的應(yīng)用。

4.2 CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸和腫瘤浸潤效率低下

CAR-T細(xì)胞治療惡性實(shí)體瘤的基本前提是需要從血液中轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤存在部位，從而與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合。具體而言，脈管系統(tǒng)中的CAR-T細(xì)胞遷移至腫瘤組織中，需要經(jīng)歷以下幾個(gè)過程：（1）選擇素-配體相互作用介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞邊集和附壁；（2）靶組織中的趨化因子激活CAR-T細(xì)胞上的趨化因子受體，活化的CAR-T細(xì)胞表達(dá)整合素使細(xì)胞緊密粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞；（3）細(xì)胞間細(xì)胞黏附分子（intercellular cell adhesion molecules，ICAMs）、血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecules，VCAMs）和趨化因子協(xié)同作用，使CAR-T細(xì)胞進(jìn)行跨內(nèi)皮遷移，破壞基底膜并最終離開血管滲入組織［32-35］。

事實(shí)上，在實(shí)體瘤中，任何旨在遷移、運(yùn)輸、浸潤到腫瘤部位的CAR-T細(xì)胞都需要克服以上所有的物理障礙才能找到癌細(xì)胞進(jìn)行接觸，由此可見其運(yùn)輸過程之艱辛［36］。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也會(huì)做出相應(yīng)的抵抗以抑制CAR-T細(xì)胞的滲出、遷移和浸潤。黏附分子異常表達(dá)的異常脈管系統(tǒng)可減少CAR-T細(xì)胞附著和遷移［37-39］；CAR-T遷移、滲透和運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織中所依賴的各種類型的趨化因子（如CCL5、CXCL9和CXCL10）表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)；致密的腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)為CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位創(chuàng)造了物理屏障［40-41］；腫瘤細(xì)胞表達(dá)抑制性免疫檢查點(diǎn)的配體，如程序性死亡-1配體（programmed death-1 ligand，PD-L1/L2）直接抑制T細(xì)胞功能［42］。因此，除了缺乏腫瘤特異性抗原外，CAR-T細(xì)胞如何盡可能多的運(yùn)輸至腫瘤組織也是一個(gè)令人棘手的問題。

4.3 腫瘤免疫微環(huán)境的抑制作用

為了識別和解決腫瘤細(xì)胞，浸潤的CAR-T細(xì)胞必須停留在腫瘤組織中，并特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原，進(jìn)而激活一系列殺傷效應(yīng)。但令人遺憾的是，眾多研究人員已經(jīng)證實(shí)T細(xì)胞代謝在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中可能受到強(qiáng)烈抑制［43-45］。

腫瘤細(xì)胞通過糖酵解代謝創(chuàng)造了一個(gè)以缺氧、高乳酸和高水平免疫抑制代謝物為特征的微環(huán)境，顯著抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞活性和功能。同時(shí)，腫瘤微環(huán)境中還存在不少癌癥相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞，如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）和抑制性免疫細(xì)胞，包括髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANs）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Treg），這些細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)展，包括分泌生長因子、細(xì)胞因子和促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成的趨化因子［46-48］。CAFs是腫瘤相關(guān)基質(zhì)的主要成分，可分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、誘導(dǎo)炎癥和新生血管形成、建立免疫抑制TME、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、抑制免疫細(xì)胞功能等方式促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［49］。Treg細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞功能的T細(xì)胞亞群，它們在抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［50］。一般認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境中的TAMs主要是M2型，通過分泌TNF-α和IL-10以促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，從而抑制抗腫瘤T細(xì)胞的功能，介導(dǎo)免疫逃逸［51］。TANs根據(jù)其活化、細(xì)胞因子狀態(tài)和對腫瘤細(xì)胞生長的影響分為N1型（抗腫瘤）或N2型（促腫瘤）。TGF-β可誘導(dǎo)TANs分化成N2-TAN，后者又通過分泌CCL17招募Treg細(xì)胞［52］。另一方面，VEGF、IL-1、IFN-γ以及趨化因子CCL2，CCL4，CXCL1、CXCL12可刺激MDSCs的擴(kuò)增，通過PEG-2募集到腫瘤部位，進(jìn)而產(chǎn)生iNOS、精氨酸酶、IL-10和TGF-β，抑制淋巴細(xì)胞活性、募集Tregs和增加免疫抑制檢查點(diǎn)分子的表達(dá)促使NK細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞失活。

5 克服實(shí)體瘤CAR-T 療法障礙的策略

5.1 設(shè)計(jì)多靶標(biāo)CAR-T細(xì)胞

由于腫瘤存在異質(zhì)性和抗原逃逸，CAR-T細(xì)胞療法的下一步發(fā)展可以從靶向一種以上的抗原入手，通過靶向腫瘤微環(huán)境中或多個(gè)TAA或其他因子來增加同時(shí)消除多個(gè)亞克隆群體的機(jī)會(huì)。已有不少臨床前研究向我們展示了多靶標(biāo)CAR-T細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤作用、減少免疫逃逸能力和提高T細(xì)胞活力作用［53-56］。具體而言，Hegde等人在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中同時(shí)使用靶向HER2和IL-13Rα2特異性CAR-T細(xì)胞，在小鼠模型中顯示出更強(qiáng)的腫瘤殺傷作用，且抗原逃逸更少［57］。Kakarla等人在已建立的A549小鼠肺癌模型中同時(shí)使用靶向EphA2和FAP的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療，靶向FAP的CAR-T細(xì)胞的浸潤顯著減少了FAP陽性基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)腫瘤生長減少。與單獨(dú)使用任何一種相比，雙靶標(biāo)CAR-T細(xì)胞治療顯著增強(qiáng)了抗腫瘤活性并延長了小鼠生存時(shí)間［58］。

5.2 提高CAR-T遷移和浸潤的策略

CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸需要在效應(yīng)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子和趨化因子受體之間建立趨化性遷移。例如將趨化因子受體整合到CAR設(shè)計(jì)中來刺激CAR-T細(xì)胞募集，增加CAR-T的抗腫瘤作用，如CCR2、CCR2b、CCR4、CCR7、CCR8、CXCR4和CXCR6。已有研究證實(shí)，IL-8受體CXCR1或CXCR2修飾的CAR顯著增強(qiáng)了腫瘤組織中T細(xì)胞的遷移和抗腫瘤活性，從而在侵襲性腫瘤（如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，卵巢癌和胰腺癌）的臨床前模型中誘導(dǎo)腫瘤完全消退和持久的免疫記憶［59］。

通過腹膜內(nèi)和腫瘤內(nèi)注射區(qū)域直接注入也是增加CAR-T細(xì)胞浸潤的直接途徑。在I期臨床試驗(yàn)研究中，研究人員通過腫瘤內(nèi)注射將靶向ErbB的CAR-T細(xì)胞遞送給頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，不僅降低了細(xì)胞因子釋放綜合征發(fā)生概率，還最大程度減少CAR-T細(xì)胞消耗［60-61］。這種方法也適用于其他癌癥，卵巢癌和惡性胸膜間皮瘤可以通過腹膜和胸膜腔將CAR-T細(xì)胞局部遞送至腫瘤組織［62］。

腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）［63］。HSPG的降解是T細(xì)胞通過富含基質(zhì)的實(shí)體瘤的第一步。乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是一種降解HSPG的酶。在體外擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HPSE mRNA表達(dá)減少，由此限制了它們在實(shí)體瘤中的抗腫瘤功能。Caruanu等人設(shè)計(jì)了表達(dá)HPSE的CAR-T細(xì)胞，使其降解HSPG的能力提高，從而促進(jìn)T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的浸潤［64］。

5.3 克服免疫抑制性TME

鑒于腫瘤免疫微環(huán)境的免疫抑制特性，研究人員正在研究改善腫瘤微環(huán)境的策略，以提高CAR-T細(xì)胞對實(shí)體瘤的存活率和療效。

CAR-T細(xì)胞療法與阻斷抑制性免疫檢查點(diǎn)（如PD-1/PD-L1、CTLA-4）的組合，可以顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性，而不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性，已被應(yīng)用于臨床前模型和臨床試驗(yàn)中提高治療效果［65-67］。在臨床前和臨床研究中也已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法來靶向免疫抑制細(xì)胞和細(xì)胞因子。全反式維甲酸（tretinoin，ATRA）通過誘導(dǎo)未成熟的髓系細(xì)胞分化為成熟的樹突狀細(xì)胞，刺激T細(xì)胞，減少腫瘤微環(huán)境中的MDSC，與CAR-T細(xì)胞共同給藥可增強(qiáng)抗腫瘤活性［68-69］。Tregs的消耗是另一種增強(qiáng)抗腫瘤免疫的有效方法，Agliardi G等人的研究表明，局部遞送IL-12不僅減少Treg數(shù)量，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而且還重塑TME，推動(dòng)促炎CD4 + T細(xì)胞浸潤［70］。靶向免疫抑制細(xì)胞因子來修飾CAR-T細(xì)胞，通過限制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的抑制信號或?qū)⒁种菩盘栟D(zhuǎn)換為激活信號也被證實(shí)可進(jìn)一步提高CAR-T細(xì)胞的功效。Tang等人用CRISPR/Cas2技術(shù)敲除CAR-T細(xì)胞中的內(nèi)源性TGF-β受體II（TGFBR2），減少誘導(dǎo)的Treg轉(zhuǎn)化并防止CAR-T 細(xì)胞的衰竭，在異種移植實(shí)體瘤模型中都顯示了更好的體內(nèi)腫瘤消除效果［71］。Stuber及其同事也發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中，阻斷TGF-β受體信號傳導(dǎo)后可使靶向ROR1-CAR T細(xì)胞免受TGF-β的抑制作用，在體外和3D腫瘤模型中維持其抗腫瘤功能［72］。

簡而言之，在腫瘤微環(huán)境中富集的抑制性免疫細(xì)胞或細(xì)胞因子可以作為提高CAR-T細(xì)胞功效的額外和有希望的靶標(biāo)。為了克服腫瘤微環(huán)境中的各種障礙，與其他策略相結(jié)合將產(chǎn)生優(yōu)異的腫瘤殺傷效果。

6 總結(jié)與展望

因此，CAR-T細(xì)胞療法在腫瘤的臨床應(yīng)用中既是一個(gè)機(jī)會(huì)，也是一個(gè)挑戰(zhàn)。伴隨著患者需求的不斷增加，不僅要借鑒CAR-T細(xì)胞治療在血液腫瘤方面的成功經(jīng)驗(yàn)，還要立足于實(shí)體腫瘤治療所面臨的特有問題深度思考，突破實(shí)體瘤應(yīng)用的限制，推進(jìn)臨床研究的發(fā)展。同時(shí)，CAR-T與其它治療手段聯(lián)合應(yīng)用于實(shí)體瘤方面的研究，將是未來癌癥臨床治療領(lǐng)域一項(xiàng)重要發(fā)展方向，CAR-T細(xì)胞治療有望更好、更安全地服務(wù)于更多患者。