銀川地區(qū)肉牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗

岳 康,郭延生,劉紅燕,,郭亞男,王建東*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所,寧夏銀川 750002;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

牛子宮內(nèi)膜炎是一種繁殖障礙性疾病,不僅導(dǎo)致母牛不易受孕、容易流產(chǎn)和產(chǎn)犢時間間隔延長[1],還會增加養(yǎng)殖成本[2]。我國牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率約為20%～50%[3],并且60%～90%會引發(fā)不孕癥[4-5]。美國每年因不孕癥或繁殖疾病淘汰近12.19%的奶牛,子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率達53%,占淘汰?？倲?shù)的52.37%[4]。此外,英國報導(dǎo)不孕牛中約95%是由子宮內(nèi)膜炎引起的[5]。

關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的報道很少。寧夏適于肉牛的養(yǎng)殖,但隨著肉牛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大以及飼養(yǎng)管理水平低下等因素,肉牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率在不斷上升,導(dǎo)致肉牛繁殖力低下,給寧夏肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,阻礙其健康發(fā)展。

本試驗對引起銀川地區(qū)肉牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌進行分離鑒定,并對分離出來的病原菌進行藥物敏感性試驗,旨在說明銀川地區(qū)肉牛子宮內(nèi)膜炎的感染情況,為合理治療肉牛子宮內(nèi)膜炎提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗菌株從銀川地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場及散戶中采集的50份患子宮內(nèi)膜炎的肉牛子宮分泌物中分離獲得。

1.1.2 主要試劑 無菌脫纖維羊血,購自廣州鴻泉生物科技有限公司;哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ),購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;水解酪蛋白瓊脂(MHA)培養(yǎng)基,水解酪蛋白肉湯(MHB)培養(yǎng)基,各種生化制劑及藥敏片,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 主要儀器 小型高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5424),Eppendorf中國有限公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;PCR儀(T100 Thermal Cycler),膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ),Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 2022年2～8月在銀川地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場及散戶中選取50例臨床確診為患子宮內(nèi)膜炎的肉牛。將病牛固定,對病牛進行排糞刺激使其排糞,待糞排干凈后,用清水清洗病牛外陰部,再用0.1%的新潔爾滅消毒。采用人工受精的方法,用無菌輸精槍抽取子宮分泌物3 mL放入準(zhǔn)備好的無菌管中,立即置于液氮罐中保存,隨后盡快送往實驗進行病原菌的分離鑒定。

1.2.2 病原菌分離鑒定 將采集的病牛子宮分泌物分別劃線接種于血平板上,需氧培養(yǎng)放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,厭氧培養(yǎng)先將血平板裝入含有厭氧產(chǎn)氣包的厭氧袋中,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。觀察菌落形態(tài)特征,挑取單一菌落至MHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～24 h,進一步將培養(yǎng)的菌液接種于血平板上進行分離培養(yǎng),連續(xù)純化3代。將每代培養(yǎng)好的菌株用16S rRNA通用引物[6]擴增,擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序,結(jié)果與GenBank中已提交的菌株序列進行比對鑒定。

1.2.3 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法,即Kirby-Barer法[7-8],對分離出的菌株進行藥敏實驗。將分離菌株均勻涂抹在MHA平板上,然后將藥敏片貼于平板表面,將放有藥敏紙片的平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h,使用游標(biāo)卡尺對抑菌圈直徑進行測量并記錄。藥敏結(jié)果對照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的的判定標(biāo)準(zhǔn)進行判定[9-10],結(jié)果用耐藥(resistence)、敏感(sensitive)及中介(intermediate)表示。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離鑒定結(jié)果

本試驗從50份子宮分泌物中總計分離獲得89株細菌,主要病原菌為大腸埃希氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。其中,大腸埃希氏菌32株,檢出率為36%,鏈球菌25株,檢出率為28%,金黃色葡萄球菌17株,檢出率為19%,蠟狀芽孢桿菌9株,檢出率為10%,產(chǎn)氣夾膜梭菌6株,檢出率為7%。結(jié)果見表1。

表1 樣本菌株分離概況Table 1 Sample strain isolation overview

對所有分離到的菌株培養(yǎng)純化后,提核酸用16S rRNA通用引物進行PCR擴增鑒定。

結(jié)果顯示通用引物能成功擴增所有菌株的16S rRNA序列,各菌株序列長度約為1.4～1.5 kb(圖1)。各菌株16S rRNA序列比對發(fā)現(xiàn),其與NCBI上已公布的菌株序列同源性均大于98%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.大腸埃希氏菌;4～6.鏈球菌;7～9.金黃色葡萄球菌;10～12.蠟樣芽孢桿菌;13～15.產(chǎn)氣莢膜梭菌M.DNA Marker DL 2 000;1-3.Escherichia coli;4-6.Streptococcus;7-9.Staphylococcusaureus;10-12.Baccillus cereus;13-15.Clostridiumaerosola gas圖1 部分菌株P(guān)CR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of some strains

2.2 藥敏試驗結(jié)果

2.2.1 大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果 32株大腸埃希氏菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表2,分離的大腸埃希氏菌對恩諾沙星、利奈唑胺藥物的耐藥率均超過70%;對紅霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、氟苯尼考的耐藥率達50%～70%;對頭孢唑啉、米諾環(huán)素、頭孢他啶高度敏感,耐藥率在10%以下;對哌拉西林完全敏感。

表2 大腸埃希氏菌藥敏試驗Table 2 Drug susceptibility test of Escherichia coli

2.2.2 鏈球菌藥敏試驗結(jié)果 25株鏈球菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表3,分離的鏈球菌對慶大霉素、氨芐西林、青霉素藥物的耐藥率均超過80%;對阿米卡星、恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢唑啉、克林霉素、鏈霉素、林可霉素、卡那霉素、氟苯尼考的耐藥率在50%～70%;對左氧氟沙星、頭孢曲松鈉較為敏感,耐藥率為20%。

表3 鏈球菌藥敏試驗Table 3 Drug susceptibility test of Streptococcus

2.2.3 金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果 17株金黃色葡萄球菌對15種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表4,分離的金黃色葡萄球菌對慶大霉素、林可霉素、青霉素藥物的耐藥率均超過70%;對頭孢唑啉、卡那霉素的耐藥率為50%～70%;對萬古霉素完全敏感。

表4 金黃色葡萄球菌藥敏試驗Table 4 Drug susceptibility test of Staphylococcus aureus

2.2.4 蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗結(jié)果 9株蠟樣芽孢桿菌對14抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表5,分離的蠟樣芽孢桿菌對慶大的耐藥率達78%;對四環(huán)素、林可、磺胺嘧啶、氟苯尼考的耐藥率為50%～70%;對頭孢唑啉、氟苯尼考較為敏感,耐藥率為22%以下,對于米諾環(huán)素完全敏感。

表5 蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗Table 5 Drug susceptibility test of Bacillus cereus

2.2.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌藥敏試驗結(jié)果 6株產(chǎn)氣莢膜梭菌對14抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表6,分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對慶大霉素、林可霉素、卡那霉素、青霉素的耐藥率最高達83%以上;對阿米卡星、頭孢唑啉、頭孢他啶、鏈霉素、紅霉素的耐藥率在50～67%;對恩諾沙星、磺胺嘧啶的耐藥率為33%;對四環(huán)素、氟苯尼考較為敏感,耐藥率為17%;對于頭孢噻肟高度敏感。

表6 產(chǎn)氣莢膜梭菌藥敏試驗Table 6 Drug susceptibility test of Clostridium perfringens

3 討論

本試驗對銀川地區(qū)收集到的50份患子宮內(nèi)膜炎的肉牛子宮分泌物進行病原菌分離鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起銀川地區(qū)肉牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為大腸埃希氏菌(36%)、鏈球菌(28%)、金黃色葡萄球菌(19%)、蠟樣芽孢桿菌(10%)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌(7%)。趙紅霞等[11]報道引起內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌為大腸埃希氏菌(48.4%)、金黃色葡萄球菌(20.4%)、鏈球菌(32.3%)以及沙門氏菌(8.1%),且大腸埃希氏菌和鏈球菌的占比高于其他病原菌,與本試驗結(jié)果基本一致。李蕊等[12]報道引起保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌有鏈球菌、葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、屎腸球菌、銅綠假單胞菌和棒狀桿菌,這與本試驗及戴浩楠[13]、張維軍[14]等人的報道結(jié)果有所不同,這可能與地域差異、飼養(yǎng)條件以及牛品種不同有關(guān)。

藥敏試驗結(jié)果顯示,5種分離得到的病原菌對24種藥品產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。分離出的大腸埃希菌對頭孢唑啉、米諾環(huán)素、頭孢他啶高度敏感。鏈球菌對左氧氟沙星、頭孢曲松鈉較為敏感。金黃色葡萄球菌對萬古霉素100%敏感,這與王桂琴等[15]報道的完全一致。蠟樣芽孢桿菌對頭孢唑啉、鏈霉素、米諾環(huán)素敏感。分離的大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌對林可霉素,氨芐西林的敏感度都不高。這與李明[16]的研究結(jié)果結(jié)果基本一致。說明牛場在對于牛子宮內(nèi)膜炎的治療過程中,沒有合理的進行藥物的選擇和更替,從而導(dǎo)致常用藥物在病牛體內(nèi)產(chǎn)生了耐藥性。病原菌對頭孢類藥物都表現(xiàn)為不耐或者中耐,幾乎沒有特別強的耐藥性,與龔團蓮[17]的研究結(jié)果相同。

本研究中青霉素、慶大霉素、林可霉素、以及四環(huán)素的藥物敏感性結(jié)果較差,這可能與牛場長期使用這些藥物且不用相似藥效的藥物而使病牛產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。因抗生素殘留問題,各國都已經(jīng)規(guī)范和限制抗生素的使用。為了避免耐藥菌株的產(chǎn)生,應(yīng)規(guī)范合理選用抗菌藥物,定期對反復(fù)患病的動物進行藥物敏感性檢測。對于已經(jīng)耐藥的病原菌,用藥時應(yīng)該合理替換藥物,避免耐藥菌株的產(chǎn)生。近年來,關(guān)于中藥治療子宮內(nèi)膜炎的成功病例有很多,可以參考中藥治療[18],或者中西結(jié)合的方式治療。

綜上所述,本試驗中銀川地區(qū)肉牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌主要為大腸埃希氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌。分離出的89株病原菌對常用24種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥情況,僅對少數(shù)藥物敏感,可以為規(guī)范治療肉牛子宮內(nèi)膜炎的用藥提供一定的指導(dǎo)。