動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶研究進(jìn)展

陳奕君,周 璇,謝 躍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川成都 611130)

絲氨酸蛋白酶(serine proteases)是一類存在于真核生物、原核生物和病毒的蛋白水解酶,該酶因活性位點(diǎn)絲氨酸殘基對(duì)底物的親核攻擊而得名絲氨酸蛋白酶。與金屬、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶類似,絲氨酸蛋白酶通過分裂肽鍵進(jìn)行蛋白質(zhì)水解反應(yīng)[1],廣泛參與動(dòng)物機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝、消化、凝血、發(fā)育調(diào)節(jié)和受精等生理過程,并與許多人類疾病的發(fā)生息息相關(guān)[2]。內(nèi)寄生蟲作為人和家養(yǎng)及野生動(dòng)物常見的一類病原,可引起動(dòng)物貧血、厭食、消瘦、衰弱、甚至導(dǎo)致死亡[3]。內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶是蟲體感染宿主的關(guān)鍵蛋白分子,參與蟲體的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)攝取以及對(duì)宿主入侵、抗凝和免疫逃逸等生物學(xué)過程[4]。腸道蠕蟲絲氨酸蛋白酶的研究證實(shí),該酶可參與繁殖、躲避宿主免疫系統(tǒng)和發(fā)育等生理過程。鑒于內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶重要的分子特性及其在寄生蟲-宿主互作中的關(guān)鍵作用,它被視為新一代抗寄生蟲干預(yù)免疫治療、化療以及血清診斷試劑的重要靶點(diǎn)。有關(guān)動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶的研究較零散,缺乏系統(tǒng)性歸納和總結(jié),本綜述擬對(duì)動(dòng)物內(nèi)寄生蟲如原蟲、絳蟲、吸蟲和線蟲的絲氨酸蛋白酶研究現(xiàn)狀及其在寄生蟲-宿主互作中的生物學(xué)功能進(jìn)行概述,以期為該蛋白酶的進(jìn)一步研究提供信息參考。

1 絲氨酸蛋白酶概述

絲氨酸蛋白酶主要水解蛋白肽鍵,其結(jié)構(gòu)由β蛋白構(gòu)成,且包含兩個(gè)相似結(jié)構(gòu)域,即N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域。絲氨酸蛋白酶的活性催化位點(diǎn)及其重要的功能位點(diǎn)均位于N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域,其中活性催化中心由來自N結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)殘基(His/Asp/Lys/Glu)以及C結(jié)構(gòu)域的Ser殘基共同構(gòu)成,而其他功能位點(diǎn)包括氧離子孔、底物特異性口袋和底物結(jié)合位點(diǎn)的殘基則相對(duì)可變,位于C結(jié)構(gòu)域[5]。由此,在整個(gè)絲氨酸蛋白酶超家族成員中,有些絲氨酸蛋白酶氨基酸序列間的相似性甚至不到20%,這些序列和結(jié)構(gòu)差異,導(dǎo)致了絲氨酸蛋白酶功能上的變化,給整個(gè)超家族的遺傳進(jìn)化與功能研究帶來了一定困難[6]。目前,絲氨酸蛋白酶主要通過底物的特異性以及催化位點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來進(jìn)行分類。例如,根據(jù)底物的特異性,絲氨酸蛋白酶可分為胰蛋白酶樣、凝乳蛋白酶樣、枯草蛋白酶樣、彈性蛋白酶樣和激肽酶[5];根據(jù)催化位點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),絲氨酸蛋白酶可分為13個(gè)家族和40科[6](表1)?；趦?chǔ)存在MEROPS數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),PA是絲氨酸蛋白酶超家族中最大的家族。該家族主要在真核生物中表達(dá),而在原核生物或植物中的表達(dá)卻極少[3]。

表1 絲氨酸蛋白酶家族Table 1 The family of serine proteases

2 動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶

動(dòng)物內(nèi)寄生蟲是一類寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲,主要包括原蟲、吸蟲、絳蟲及線蟲。這些寄生蟲通過搶奪宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、破壞宿主組織、釋放有毒物質(zhì)(如排泄分泌抗原)等行為,引起宿主動(dòng)物出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良、貧血,組織器官病變,過敏反應(yīng),甚至死亡[3]。研究表明,絲氨酸蛋白酶作為內(nèi)寄生蟲重要的分泌排泄蛋白,在蟲體的宿主入侵過程中扮演著重要角色,是內(nèi)寄生蟲建立有效感染的關(guān)鍵蛋白[4]。例如,惡性瘧原蟲絲氨酸蛋白酶PfSUB1被證實(shí)與蟲體入侵宿主紅細(xì)胞有關(guān)[7],利什曼原蟲絲氨酸蛋白酶LaSP-Sol被證實(shí)參與介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)[8],剛地弓形蟲菱形蛋白酶更是被證實(shí)與蟲體在宿主組織中的轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。在動(dòng)物吸蟲中,肝片吸蟲的絲氨酸蛋白酶被證實(shí)具有水解蛋白和促進(jìn)蟲體營(yíng)養(yǎng)的作用[6],血吸蟲的絲氨酸蛋白酶SmSPs1-5更是被證實(shí)具有抗凝和調(diào)節(jié)宿主血壓的作用[10]。在動(dòng)物絳蟲、線蟲中,絲氨酸蛋白酶還被證實(shí)具有調(diào)控蟲體發(fā)育[11]、參與蟲體宿主寄生與繁殖的作用[12]。由此可見,動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶在蟲體寄生及其與宿主互作的過程中發(fā)揮著重要的作用。目前有關(guān)內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶及其類別與功能如表2所示。

表2 內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶的特征Table 2 Features of serine proteases in endoparasites

3 動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶的功能

3.1 宿主入侵

目前發(fā)現(xiàn)原蟲、線蟲和吸蟲的一些絲氨酸蛋白酶可有參與內(nèi)寄生蟲感染入侵宿主的過程。這些絲氨酸蛋白酶可以通過調(diào)控與入侵相關(guān)分子的釋放或是降解消化宿主組織細(xì)胞從而促進(jìn)蟲體入侵宿主,其還可以促進(jìn)蟲體在宿主體內(nèi)組織中的傳播。在惡性瘧原蟲的相關(guān)研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)瘧原蟲枯草桿菌素樣絲氨酸蛋白酶(PfSUB1)在蟲體裂殖子發(fā)育的最后階段,可被釋放到紅細(xì)胞納蟲空泡(parasitophorous vacuole),對(duì)SERA家族木瓜蛋白酶類蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾,從而有利于宿主細(xì)胞破裂后釋放裂殖子,入侵新的紅細(xì)胞。此外,PfSUB1還作為一種多功能加工蛋白酶,參與原蟲蟲體對(duì)宿主細(xì)胞表面的重塑,促進(jìn)蟲體在組織間的傳播[7,26-27]。例如,剛地弓形蟲絲氨酸蛋白酶通過重塑宿主細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu),協(xié)助剛地弓形蟲速殖子侵入上皮細(xì)胞及其在組織間的傳播。同時(shí)研究證實(shí),利什曼原蟲絲氨酸蛋白酶SB族、SC族和SF族可以直接參與蟲體對(duì)宿主的入侵過程[8,28]。在線蟲絲氨酸蛋白酶的研究中,Sakanari J A等發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)單尖異線蟲(Anisakissimplex)幼蟲含有一種25 ku的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白,可以降解結(jié)締組織胞外基質(zhì),進(jìn)而有利于蟲體穿透宿主胃和腸的黏膜層、黏膜下層和肌層,向網(wǎng)膜、肝臟、胰腺或膽囊遷移[13],與此同時(shí),鼠鞭蟲成蟲分泌一種絲氨酸蛋白酶樣物質(zhì)可以通過破壞腸道黏液屏障以及上皮細(xì)胞膜的完整性(包括降解腸道黏蛋白Muc2)從而解開黏液網(wǎng),促進(jìn)蟲體在入侵和腸道定植等過程,參與鼠鞭蟲對(duì)宿主的致病作用[19]。此外,在斯氏線蟲中發(fā)現(xiàn)的似絲氨酸蛋白酶樣蛋白(Sc-SP-1)僅在蟲體寄生階段表達(dá),并且Sc-SP-1在準(zhǔn)備入侵血腔的蟲體中表達(dá)量高于血腔中的已有線蟲。同時(shí),體外試驗(yàn)證實(shí),Sc-SP-1能與昆蟲宿主中腸上皮結(jié)合引起細(xì)胞脫落,并能夠?qū)е氯嗽炷ば纬煽锥?因此Sc-SP-1的致病功能可能是通過破壞中腸屏障而侵入血腹腔實(shí)現(xiàn)[18]。既往研究表明,旋毛蟲絲氨酸蛋白酶可破壞腸道上皮細(xì)胞膜的完整性,這是由于其水解宿主腸道表面的黏液屏障[20]。此外,相關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn),在蟲體的整個(gè)生命周期中,肌肉移行期的旋毛蟲幼蟲的排泄-分泌蛋白(ES蛋白)與蟲體提取物均表現(xiàn)出大量的絲氨酸蛋白酶活性,這種階段特異性的蛋白水解活性有助于在寄生蟲感染期間破壞宿主內(nèi)部的機(jī)械和體液屏障。這些絲氨酸蛋白酶是抗體反應(yīng)的靶點(diǎn),可以抑制蛋白酶活性,并可能導(dǎo)致致敏宿主中寄生蟲的損傷。有研究者利用RNAi技術(shù)沉默TsSP1.2基因后,發(fā)現(xiàn)與未干擾組相比,回收的新生幼蟲數(shù)量以及各階段蟲體的長(zhǎng)度都出現(xiàn)顯著降低,說明TsSP1.2在蟲體繁殖、入侵和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[24,30]。在血吸蟲的研究中,曼氏血吸蟲發(fā)現(xiàn)存在一種具有凝乳蛋白酶樣活性的彈性蛋白酶(SmCE),通過免疫定位證實(shí)蟲體離開中間宿主前SmCE被激活,推測(cè)SmCE參與蟲體皮膚侵襲過程[31]。該蛋白酶除了降解彈性蛋白外,還能降解結(jié)締組織中的其他蛋白質(zhì)(例如膠原蛋白、纖連蛋白和免疫球蛋白),并與蠕蟲用來消化血液的半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶具有功能相似性[15]。

3.2 凝血和纖溶

3.3 其他

除上述功能之外,有研究表明絲氨酸蛋白酶參與內(nèi)寄生蟲的繁殖過程。如豬蛔蟲絲氨酸蛋白酶在蟲體繁殖交配過程中有促進(jìn)精子活化樣的作用[12]。另外,絲氨酸蛋白酶還參與內(nèi)寄生蟲蟲體營(yíng)養(yǎng)吸收過程,為寄生蟲提供生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而促進(jìn)蟲體生長(zhǎng)發(fā)育[4]。在原蟲中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶可以影響原蟲子孢子的活力及排出[33],還有研究推測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲中的絲氨酸蛋白與包囊的形成有關(guān)[11]。

4 動(dòng)物內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶的免疫保護(hù)抗原特性

絲氨酸蛋白酶作為一種分泌排泄蛋白,可以引起宿主免疫反應(yīng)。在動(dòng)物絳蟲蚴病研究中,Kong Y等(1994)從曼氏裂頭蚴中分離得到3種天然絲氨酸蛋白酶,經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)證實(shí),3種絲氨酸蛋白酶可與曼氏裂頭蚴感染患者的血清IgG特異性結(jié)合,是裂頭蚴病的潛在診斷抗原的有效候選[16]。另外,研究人員發(fā)現(xiàn),人獸共患細(xì)粒棘球蚴可以分泌一種類絲氨酸蛋白酶AG5,且該蛋白在整個(gè)蟲體生活史周期均有表達(dá),因此推測(cè)該蛋白可能作為一種潛在的抗原,用于細(xì)粒棘球絳蟲病中間宿主或最終宿主血清學(xué)診斷和疫苗開發(fā)[17]。類似的,在動(dòng)物線蟲病研究中,Liu M Y等篩選和鑒定到一種旋毛蟲新生幼蟲階段特異性的絲氨酸蛋白酶NBL1[25]。結(jié)果分析揭示,該蛋白包括1個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。重組蛋白rNBL1的截?cái)嘧凅w表位定位發(fā)現(xiàn),NBL1 C端結(jié)構(gòu)域?yàn)槠涿庖唢@性區(qū)域,具有較好的免疫原性。借助旋毛蟲-豬感染模型,研究人員證實(shí)NBL1蛋白可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生驚人的免疫保護(hù)力,抵抗旋毛蟲早期感染[4]。另外,Feng S等對(duì)重組旋毛蟲絲氨酸蛋白酶蛋白(rTs-Adsp)進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果顯示,重組蛋白rTs-Adsp可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG和IgE以及Th1(IFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4、IL-10和IL-13)細(xì)胞因子,同時(shí)相較對(duì)照組,重組蛋白rTs-Adsp可有效降低小鼠肌肉中移行的幼蟲數(shù)量,減蟲率達(dá)46.5%,說明可以作為旋毛蟲病的潛在候選疫苗[23]。Xu D等使用旋毛蟲-豬感染模型重復(fù)了上述免疫試驗(yàn),結(jié)果證實(shí)rTs-Adsp同樣可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)豬產(chǎn)生較好的旋毛蟲病免疫保護(hù)效果[21]。此外,Zhang Y等對(duì)另一種旋毛蟲絲氨酸蛋白酶TsT進(jìn)行免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,重組蛋白rTsT免疫小鼠的血清IgG、IgG1/IgG2a均顯著上升,同時(shí)伴隨腸道IgA以及細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的升高;免疫保護(hù)效果比較發(fā)現(xiàn),相較對(duì)照組,重組蛋白rTsT免疫組小鼠腸道的成蟲減少33.17%,肌肉幼蟲減少37.80%,提示rTsT可作為另一旋毛蟲病的疫苗候選抗原[34,35]。

5 展望

內(nèi)寄生蟲作為一類嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康的重要病原,具有重要的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響?？紤]到目前內(nèi)寄生蟲耐藥性問題正變得日益嚴(yán)重,尋求新的藥物靶點(diǎn)以及其他疫苗的研究變得十分必要和迫切。越來越多的組學(xué)研究以及積累的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶廣泛參與內(nèi)寄生蟲的營(yíng)養(yǎng)發(fā)育、宿主組織和細(xì)胞入侵、抗凝和免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程,說明絲氨酸蛋白酶有望成為抗寄生蟲的新型分子靶點(diǎn)。目前部分研究證實(shí)內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶具有作為新型疫苗的潛質(zhì),但是有關(guān)內(nèi)寄生蟲絲氨酸蛋白酶是否可以作為疫苗用于寄生蟲病防控,仍需要大量的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。相信隨著人們對(duì)寄生蟲絲氨酸蛋白酶研究的不斷深入,所得結(jié)果勢(shì)必將為寄生蟲絲氨酸蛋白酶的應(yīng)用以及開發(fā)其在抗寄生蟲中作用(藥物或疫苗)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。