加米霉素納米乳化制劑的制備

謝建瑛,苗耀天,亢永久,趙詠中*

(1.甘肅武威國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)管委會,甘肅武威 733000;2.武威市畜牧獸醫(yī)總站,甘肅武威 733000;3.武威喜農(nóng)生物科技有限責(zé)任公司,甘肅武威 733000)

納米乳(nanoemulsion)是一種新型藥物載體,是由表面活性劑、助表面活性劑、油相及水相在適當(dāng)比例下形成的透明分散體系[1],乳滴粒徑分布在1～100 nm之間,和納米粒、納米囊、脂質(zhì)體等納米劑型相比,納米乳的整體生產(chǎn)工藝要求不高,利于在車間得到轉(zhuǎn)化,故非常適用于對成本有較高要求的獸藥制劑的生產(chǎn)。在包封率方面,一個穩(wěn)定的水包油型納米乳劑包封率能接近100%,顯著高于納米粒、納米囊、納米脂質(zhì)體等,包被后的藥物異味顯著降低,同時,對于水溶性差的藥物來講,包被后的藥物在水中溶解度顯著提升,且能無限稀釋而不破乳,是解決藥物飲水使用問題的常用技術(shù)之一。在獸醫(yī)臨床方面,目前國內(nèi)已經(jīng)有替米考星納米乳[2]、復(fù)合維生素納米乳[3]、中藥植物精油納米乳等產(chǎn)品上市,是養(yǎng)殖領(lǐng)域應(yīng)用最好的納米制劑之一。

加米霉素(gamithromycin)是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類動物專用抗生素,由于使用后在肺部的藥物濃度顯著高于其他部位組織,故常用于動物呼吸系統(tǒng)感染類疾病的防治[4-5]。體外藥敏試驗證實,其抗菌作用顯著優(yōu)于同屬大環(huán)內(nèi)酯類的臨床常用藥替米考星[6]。由于該藥水溶性較差,目前市售只有注射劑型,而注射用藥不但對動物應(yīng)激較大,對養(yǎng)殖場員工來講還費(fèi)時費(fèi)力。本試驗結(jié)合納米乳化工藝,將加米霉素制備成納米乳劑,并檢測了其理化性質(zhì),為加米霉素新劑型的工業(yè)轉(zhuǎn)化及臨床應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 加米霉素(批號:202208002,按無水物計算,含量 98.9%),齊魯晟華制藥有限公司產(chǎn)品;吐溫-80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油(polyoxyl 40 hydrogenated castor oil,簡稱RH-40)、蔗糖脂肪酸酯,天津市恒星化學(xué)試劑制造公司產(chǎn)品;肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate,簡稱IPM),天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;油酸乙酯,江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Nicomp388/Zeta PALS激光粒度測定儀(Zetasizer Nano ZS型),英國Malvern Instrumen公司產(chǎn)品;電子天平(EB-280型),日本Shimadzu公司產(chǎn)品;透射電鏡(JME-1230型),日本JEOL公司產(chǎn)品;高速離心機(jī)(TGL-16B型),湖南星科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 加米霉素納米乳組方的篩選

1.2.1.1 油相、表面活性劑、助表面活性劑及助溶劑的篩選 由于加米霉素親水性差,為了提高其溶解度,可將加米霉素作為油相的一部分。根據(jù)不同油酯對加米霉素的溶解度數(shù)據(jù),篩選出溶解度大和穩(wěn)定性強(qiáng)的油脂作為油相,表面活性劑和助表面活性劑通過對所選油相的乳化性能進(jìn)行驗證評估后,最終確定種類和劑量。

油相從IPM、油酸乙酯、大豆油中比較選擇,表面活性劑從吐溫-80、RH-40和蔗糖脂肪酸酯中選擇?？紤]到加米霉素藥物本身的性質(zhì),選用無水乙醇作為助表面活性劑,主要是由于無水乙醇屬于短鏈醇,一方面能很好地降低界面張力,利于納米乳的形成,另一方面其對加米霉素也具有一定增溶作用,適合加米霉素納米乳的制備。

1.2.1.2 偽三元相圖的繪制 偽三元相圖可以用于確定納米乳的形成區(qū)域和配方用量。室溫下,將確定的表面活性劑和油相分別按質(zhì)量百分比9∶1、8.5∶1.5、8∶2、7.5∶2.5、7∶3、6.5∶3.5、6∶4的比例混勻,然后逐滴加入純化水,中間體系先由稀轉(zhuǎn)粘稠,再由粘稠轉(zhuǎn)稀,最終形成澄清透明、各相均一的納米乳體系。記錄當(dāng)體系由渾濁變澄清和由澄清變渾濁時的臨界點(diǎn)水量,計算體系中各成分的質(zhì)量百分比。分別以表面活性劑(S)、油相(O)、水相(W)作為相圖的3個頂點(diǎn)繪制偽三元相圖[7],確定納米乳的最佳組方。

1.2.1.3 加米霉素納米乳配方的確定及制備 根據(jù)以上實驗結(jié)果篩選最佳配方并制備加米霉素納米乳。

1.2.2 加米霉素納米乳的鑒別及結(jié)構(gòu)類型的判斷 采用離心法鑒別納米乳的穩(wěn)定性[8],即將制備好的加米霉素納米乳于4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min,觀察乳液是否有分層、析出、渾濁等情況發(fā)生。同時在制備的樣品中分別滴加水溶性的亞甲基藍(lán)和油溶性的蘇丹紅Ⅲ,由于亞甲藍(lán)是一種水溶性染料,若為水包油型納米乳,則外相為水,亞甲藍(lán)易擴(kuò)散,導(dǎo)致整個體系呈藍(lán)色,蘇丹紅Ⅲ則不擴(kuò)散。蘇丹紅Ⅲ為脂溶性染料,若體系為油包水型,則外相為油,導(dǎo)致整個體系呈紅色,亞甲藍(lán)溶液則不擴(kuò)散。通過擴(kuò)散結(jié)果來判定納米乳的類型。

1.2.3 加米霉素納米乳的形態(tài)觀察 將加米霉素納米乳用蒸餾水稀釋5倍后用2%的磷鎢酸負(fù)染,通過透射電鏡觀察納米乳的形態(tài)[9]。

1.2.4 加米霉素納米乳的粒徑分析 將加米霉素納米乳稀釋10倍后,用Zetasizer Nano ZS分析儀測定其平均粒徑(Z-average)和多分散系數(shù)(PDI) 。

1.2.5 加米霉素納米乳的穩(wěn)定性考察

1.2.5.1 留樣觀察 將加米霉素納米乳分別于-4℃、室溫和40℃條件下觀察1 d、7 d、15 d、30 d、60 d和180 d,并置于4 000 r/min的離心機(jī)中離心5 min后繼續(xù)觀察是否性狀發(fā)生改變。

1.2.5.2 Zeta電位測定 將加米霉素納米乳稀釋8倍后,用馬爾文電位分析儀檢測其Zeta電位大小,以評估其穩(wěn)定性。

1.2.6 動物安全性評價 隨機(jī)選取體重20 g±0.5 g的昆明種小鼠50只,隨機(jī)將其分為A、B、C、D、E五組,每組10只,公母各半,各組小鼠飼養(yǎng)于同一環(huán)境中,并由同一飼養(yǎng)員進(jìn)行喂養(yǎng)。其中A、B、C組為本研究加米霉素低、中、高劑量組,將本研究制備的樣品以加米霉素計分別按照3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg體重劑量肌肉注射,即A、B、C組小鼠每只分別注射0.002 mL、0.004 mL和0.008 mL(為了確保用量準(zhǔn)確和便于操作,可將樣品稀釋50倍后,每只肌注0.1 mL、0.2 mL和0.4 mL),D組和E組分別為現(xiàn)有藥物對照組和生理鹽水組,D組小鼠每只按照6 mg/kg體重肌注現(xiàn)有市售加米霉素注射液,E組小鼠每只肌注0.4 mL無菌生理鹽水。各組小鼠每日用藥1次,連續(xù)注射1周。期間觀察各組小鼠的臨床表現(xiàn)及死亡情況。試驗結(jié)束后將各組小鼠剖檢,觀察肺、肝臟、脾臟、腎臟等病變狀況,并做好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 加米霉素納米乳配方的篩選

2.1.1 油相的確定 常溫條件下,加米霉素原料在IPM、油酸乙酯和大豆油中的溶解度分別為32.5%、21.3%和16.9%,而且溶解后不會隨環(huán)境溫度的變化而出現(xiàn)反復(fù)析出和溶解現(xiàn)象,表現(xiàn)出了很好地穩(wěn)定性,考慮到藥物載藥量和最終制劑的使用成本,最終選擇IPM作為油相。

2.1.2 表面活性劑的確定 從藥物的穩(wěn)定性和載藥量的角度進(jìn)行試驗,蔗糖脂肪酸酯較其他兩種表面活性劑對IPM的乳化效果更優(yōu),且制備過程中出現(xiàn)的“粘稠態(tài)”不明顯,對攪拌速度和攪拌方式無限制,更利于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化,故選擇蔗糖脂肪酸酯作為表面活性劑。

2.1.3 表面活性劑與助表面活性劑比例(Km)的確定 本試驗分別將Km值按照7∶1、8∶1、9∶1的比例進(jìn)行試驗,通過偽三元相圖(圖1)陰影區(qū)的面積大小確定最佳比例,由圖可知Km值為8∶1時,加米霉素納米乳所形成區(qū)域面積最大,體系也最穩(wěn)定。

圖中陰影部分為可形成的納米乳區(qū)域The shaded area is nanoemulsion region圖1 Km值對加米霉素納米乳形成的影響Fig.1 Effects of Km on formation of Gamithromycin nanoemulsion

2.1.4 加米霉素納米乳配方的確定 根據(jù)以上篩選結(jié)果,確定納米乳中各成分的百分比(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為:蔗糖脂肪酸酯32.0%,加米霉素3.0%,IPM8.0%,無水乙醇4.0%,水53.0%。

2.2 加米霉素納米乳結(jié)構(gòu)類型的鑒定

將制備的加米霉素納米乳離心后,體系仍澄清透明,無分層、析出和渾濁現(xiàn)象。染色試驗中亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度明顯快,最終將整個體系染藍(lán),而蘇丹紅Ⅲ則持續(xù)漂浮在液面,無擴(kuò)散現(xiàn)象,證明其為水包油型(O/W)納米乳。

2.3 加米霉素納米乳的形態(tài)觀察

透射電鏡觀察結(jié)果顯示,加米霉素納米乳呈規(guī)則的球形,分布均勻,無黏連(見圖2)。

圖2 加米霉素納米乳透射電鏡觀察(×50 000)Fig.2 Transmission electron observation of Gamithromycin nanoemulsion(×50 000)

2.4 加米霉素納米乳的粒徑分析

Zetasizer Nano ZS 分析儀測定結(jié)果(圖3)表明,在25℃常溫環(huán)境下,加米霉素納米乳粒徑均小于100 nm,符合納米乳特征,同時進(jìn)一步測定其平均粒徑為13.7 nm,多分散系數(shù)(PDI) 為0.283。

圖3 加米霉素納米乳的粒徑分布Fig.3 Size distribution of Gamithromycin nanoemulsion

2.5 加米霉素納米乳的穩(wěn)定性

2.5.1 留樣觀察 試驗證實:將加米霉素納米乳于不同溫度下連續(xù)放置180 d,期間溶液持續(xù)保持澄清透明、均一,離心后觀察發(fā)現(xiàn)也無析出、分層及渾濁等破乳現(xiàn)象,證明該納米乳穩(wěn)定性良好。

2.5.2 Zeta電位考察 將加米霉素納米乳稀釋10倍后,用馬爾文電位分析儀檢測其Zeta電位,結(jié)果如圖4,其平均電位為+3.34。在此電位下,加米霉素納米乳具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 加米霉素納米乳的Zeta電位分布Fig.4 Zeta potential distribution of Gamithromycin nanoemulsion

2.6 安全性評價結(jié)果

試驗期間的一周內(nèi),A、B、C、D、E 5組小鼠均未出現(xiàn)死亡,采食、飲水和活動行為表現(xiàn)無差異。

將各組小鼠剖檢后,分別將試驗組A、B、C、D和對照組E進(jìn)行比較,未發(fā)現(xiàn)肺、肝臟、脾臟和腎臟器官各組之間有明顯差異,外觀正常,未有明顯的可視病變,表明本研究制備的加米霉素納米乳和現(xiàn)有市售產(chǎn)品加米霉素注射液使用都安全。A、B、C組小鼠之間各器官也未有明顯病變差異,表明本研究制備的加米霉素納米乳安全性良好。

3 討論

加米霉素納米乳的制備和工藝設(shè)計需重點(diǎn)考量載藥量、穩(wěn)定性和工藝轉(zhuǎn)化可行性三個方面。載藥量越高,臨床使用時所需給藥的劑量就越小,輔料的使用量也會更小,終制劑的性價比就更高。對于納米乳制劑來講,載藥量和所選油相種類有關(guān),在滿足藥物穩(wěn)定的前提下,油相對藥物的溶解度越高,載藥量相應(yīng)就越大。本研究針對加米霉素的藥物特點(diǎn)最終選擇了IPM作為油相,從而使載藥量達(dá)到了3%。油相確定后,為了使制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性達(dá)到最佳,需依據(jù)油相性質(zhì)選定與其被乳化所需的親水親油平衡值(HLB)相近的乳化劑,經(jīng)過反復(fù)考察,吐溫-80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油(RH-40)和蔗糖脂肪酸酯符合要求。由于前兩者在生產(chǎn)過程中,納米乳達(dá)到中間“相轉(zhuǎn)化”狀態(tài)時的“黏稠態(tài)”非常明顯,導(dǎo)致工藝轉(zhuǎn)化時攪拌葉漿表面以及配液罐內(nèi)壁粘附大量藥物而無法攪勻。這種情況下若動力電機(jī)功率過小或葉漿面過大,該“黏稠態(tài)”會直接迫使攪拌停止,電機(jī)也容易被燒毀,故表面活性劑的選擇對于工藝轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。經(jīng)過多次試驗評估,本研究最終選擇“相轉(zhuǎn)化”時“粘稠態(tài)”不明顯的蔗糖脂肪酸酯作為表面活性劑,既能確保工藝在普通GMP車間就能生產(chǎn)轉(zhuǎn)化,還能最大程度避免生產(chǎn)事故的發(fā)生。

近年來的試驗分析還發(fā)現(xiàn),加米霉素對養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的多殺性巴氏桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌以及支氣管敗血波氏桿菌等均有很強(qiáng)的體外抗菌活性,證明其是一種廣譜、高效、安全的抗菌藥[10]。但目前由于原料藥合成技術(shù)的限制,使得終端制劑售價較高,長期來看,隨著合成方法多樣化以及制備工藝的改進(jìn),未來終端制劑的售價必將會明顯下降[11],用藥成本降低后,加米霉素相關(guān)制劑的研究、應(yīng)用和推廣速度也會越來越快。還需要說明的是,大環(huán)內(nèi)酯類藥物是動物呼吸道疾病治療的首選品類,但由于該類藥物的長期使用,目前養(yǎng)殖臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有較高的耐藥率。為了維持該類藥物的敏感性,以加米霉素、泰地羅新、泰拉霉素等為代表的新一代大環(huán)內(nèi)酯藥物應(yīng)市場而生,由于上市時間短,耐藥率極低,市場潛力顯著高于其他同類藥物。對于加米霉素來講,目前已經(jīng)有注射液劑型在市場流通,主要用于牛呼吸道感染的預(yù)防與治療。為了使其得到更廣泛地應(yīng)用,其他靶動物的相關(guān)試驗正處于研究中[12-13],由于變更靶動物需要一定研發(fā)周期,尤其是藥學(xué)試驗、動物臨床試驗和藥殘標(biāo)準(zhǔn)建立等需要進(jìn)行多次深入研究和考察,故目前市售產(chǎn)品臨床僅可用于牛,期待不久的將來也能用于豬、羊、家禽等養(yǎng)殖動物領(lǐng)域。

通過納米乳化技術(shù)將加米霉素改良后,首先,整個組方結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,體系中有53%的輔料為水,和有機(jī)溶劑相比局部刺激更小,注射使用產(chǎn)生的應(yīng)激也會更低。其次,對于本納米乳劑,加米霉素藥物是溶解在脂溶性溶劑IPM中的,若口服使用最終會通過腸淋巴管吸收,能避開肝臟的“首關(guān)效應(yīng)”,有效降低了被肝臟酶解的藥物量,有助于藥物生物利用度的提升[14]。再次,目前加米霉素只有注射劑型上市,為了方便臨床給藥,未來定會有很多企業(yè)參與飲水劑型的研發(fā),將其制備成口服溶液劑,而由于該藥不溶于水的性質(zhì)使得其制備成飲水劑型時會遇到技術(shù)瓶頸。本文通過技術(shù)改良將其制備成納米乳劑后,為社會和企業(yè)的研發(fā)提供了技術(shù)參考。最后,通常納米劑型使用后具有靶向性的特點(diǎn),本研究制備的加米霉素納米乳使用后的靶向性還未知,如果藥物在肺、呼吸道等處有高于普通制劑的藥物濃度,則其防控疾病的效果必然會更強(qiáng)。因此,下一步會將加米霉素納米乳的藥物吸收、分布以及代謝規(guī)律的研究作為重點(diǎn),從而為畜禽呼吸道病的防控帶來貢獻(xiàn)。