納米二氧化硅對(duì)小鼠肺臟的急性毒性作用

鄭 珍,方忞芊,葉蓉蓉,許顯玉,2,張金龍,2,陳風(fēng)雷,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

隨著納米材料合成技術(shù)的迅速發(fā)展,納米二氧化硅(silica nanoparticles,SNPs)作為目前較為廣泛使用的納米材料,具有合成技術(shù)成熟、穩(wěn)定性好、吸附能力強(qiáng)、良好生物相容性和有利于表面改性等特點(diǎn),在食品、醫(yī)藥、材料和農(nóng)牧科學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。然而,隨著SNPs使用范圍的不斷擴(kuò)大,也逐漸暴露了SNPs對(duì)于人類和動(dòng)物健康及生態(tài)環(huán)境的毒副作用。SNPs可通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液和皮膚等多種途徑進(jìn)入機(jī)體,因此肺臟、肝臟和腎臟成為SNPs作用的主要靶器官[1]。已有研究表明SNPs可對(duì)大鼠心、肝、肺和睪丸組織產(chǎn)生毒副作用[2-4]。SNPs可通過氣管滴注的方式導(dǎo)致小鼠肺組織及大鼠肺間質(zhì)的纖維化[5-6],但通過其他途徑暴露的相關(guān)研究少之又少。

本文將同等初始發(fā)育狀態(tài)的小鼠隨機(jī)分組,以不同劑量SNPs通過血液途徑暴露后,通過生長(zhǎng)狀態(tài)觀察、臟器系數(shù)計(jì)算、HE和TUNEL染色等方法檢測(cè)SNPs是否對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育和肺臟器官產(chǎn)生毒副作用,驗(yàn)證本文所用劑量是否為安全使用劑量,從而為SNPs的臨床應(yīng)用和毒性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠,28日齡,19.0 g±2.0 g,購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,所有實(shí)驗(yàn)操作都得到揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào):202103322)。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;伊紅,蘇木精,中性樹脂,Solarbio公司產(chǎn)品;12% SDS-PAGE凝膠新賽美公司產(chǎn)品;蛋白酶K,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,抗淬滅劑,碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PVDF膜,ECL發(fā)光液,Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 ASP 300S自動(dòng)脫水機(jī),EG1150H自動(dòng)包埋機(jī),RM2255切片機(jī),TCS SP8 STED激光共聚焦顯微鏡,LEICA公司產(chǎn)品;病理組織漂烘儀,金華市華速科技有限公司產(chǎn)品;透射電鏡,FEI公司產(chǎn)品;CX23光學(xué)顯微鏡,BX43熒光倒置顯微鏡,OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SNPs合成和理化性質(zhì)檢測(cè) 參照St?ber方法[7]合成SNPs,將1700 mmol無水乙醇、155 mmol ddH2O和26 mmol氫氧化銨在燒瓶中以400 r/min的攪拌速度混合10 min;然后,滴加16 mmol四乙基原硅酸鹽(tetraethyl orthosilicate,TEOS)并將反應(yīng)在室溫下攪拌24 h。使用冷凍超高速離心機(jī)以15 000 r/min離心20 min,用ddH2O和95%乙醇徹底洗滌沉淀后在無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用超聲(160 W,20 kHz)處理30 min后,滴加該液體至200目銅網(wǎng)中,除去多余液體后烘干,利用透射電鏡檢測(cè)SNPs形態(tài)結(jié)構(gòu)并通過Image J 軟件 (National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)測(cè)定其粒徑大小。將樣品加入清洗過的專用石英盒中,利用Zetasizer Nano ZS檢測(cè)在10 mmol/L NaCl中SNPs的流體動(dòng)力學(xué)大小和zeta電位,重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2 試驗(yàn)用動(dòng)物SNP處理 貯存的SNPs懸液超聲振蕩3次,每次20 min,用過濾的生理鹽水稀釋至所需濃度以備注射,在注射過程中多次超聲震蕩防止其發(fā)生沉淀。36只ICR小鼠按初始體重隨機(jī)分組為生理鹽水注射組(對(duì)照組)、12.5 mg/kg SNP處理組、25.0 mg/kg SNP處理組、50.0 mg/kg SNP處理組,每組9只。通過一次性尾靜脈注射的方式對(duì)各組小鼠注射等量0.2 mL生理鹽水或SNPs注射液,于25℃恒溫動(dòng)物房在相同飼喂條件下飼養(yǎng)15 d,隔日定點(diǎn)進(jìn)行稱重并記錄,觀察小鼠體征以及飲食行為有無異常。

1.2.3 肺臟組織收集 將第15天稱重后的小鼠安樂死,表面消毒后打開胸腔,取其肺臟于生理鹽水中漂洗去除血跡,各組肺臟以標(biāo)尺進(jìn)行測(cè)量對(duì)比并拍照記錄。對(duì)肺組織進(jìn)行稱重后左右肺各取相同部分進(jìn)行4%多聚甲醛固定。

1.2.4 HE染色檢測(cè)肺臟病理學(xué)變化 4%多聚甲醛中的肺臟組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后制成5 μm厚度的切片,具體處理流程依次為70%乙醇60 min、80%乙醇60 min、85%乙醇90 min、95% Ⅰ乙醇60 min、95% Ⅱ乙醇40 min、無水乙醇Ⅰ60 min、無水乙醇 Ⅱ 60 min、二甲苯Ⅰ 25 min、二甲苯Ⅱ 25 min、石蠟Ⅰ 60 min、石蠟Ⅱ 60 min和石蠟Ⅲ 60 min。將組織與載玻片完全貼合狀態(tài)的石蠟切片按照二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95% Ⅰ乙醇3 min、95% Ⅱ乙醇3 min、80%乙醇3 min和70%乙醇3 min的順序進(jìn)行脫蠟脫水,經(jīng)蘇木精和伊紅染色后繼續(xù)進(jìn)行梯度酒精和二甲苯再脫水,最后以中性樹脂封片,通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)肺臟組織細(xì)胞凋亡變化 石蠟切片于60℃烘箱放置30 min后進(jìn)行脫蠟和水化,順序?yàn)槎妆舰?10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min和蒸餾水2 min。組織切片上滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K,37℃作用15 min,PBS洗滌3次后,除陰性對(duì)照外其余每張切片加新鮮配制的50 μL TUNEL檢測(cè)液,37℃避光孵育60 min,PBS洗滌3次后滴加DAPI染液于37℃避光處理10 min,再次以PBS洗滌,抗淬滅封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,One-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性分析,P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs的理化性質(zhì)

TEM結(jié)果表明SNPs顆粒為單分散球形(圖1A)。通過計(jì)算得出SNPs尺寸為(106.7±10.1)nm(圖1B)。此外,根據(jù)課題組前期研究結(jié)果SNPs在10 mmol/L NaCl溶液中的流體動(dòng)力學(xué)尺寸為(110.8±26.5)nm及zeta電位為(-49.7±6.6)mV[3]。

注:A.SNPs TEM圖;B.圖A粒徑大小分析圖。Note:A.TEM image of SNPs.B.Analysis of size distribution histograms.圖1 SNPs理化性質(zhì)Fig.1 Physicochemical properties of SNPs

2.2 小鼠行為狀態(tài)、體重增長(zhǎng)及肺臟變化分析

SNPs各處理組小鼠精神狀態(tài)及飲食情況與生理鹽水組無顯著差異,未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。記錄小鼠15 d體重并制作體重增長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)SNP處理組和生理鹽水組小鼠體重穩(wěn)定增長(zhǎng),且各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

注:SNPs處理小鼠15日內(nèi)的體重增長(zhǎng)曲線。Note:Body weight gain curves of SNPs treated mice within 15 days.圖2 小鼠體重增長(zhǎng)情況Fig.2 Body weight gains of the mice

2.3 小鼠肺組織HE染色結(jié)果

H&E染色結(jié)果顯示生理鹽水組(對(duì)照組)肺泡排列整齊且腔內(nèi)無出血和肺泡液積聚;肺泡間隙無炎癥反應(yīng),未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁毛細(xì)血管未發(fā)生明顯擴(kuò)張(圖3A);12.5 mg/kg SNP注射組組織結(jié)構(gòu)分布清晰,與生理鹽水組相比未出現(xiàn)明顯病理變化(圖3B);25.0 mg/kg SNP注射組肺泡間隔出現(xiàn)增厚現(xiàn)象(圖3C);50.0 mg/kg SNP注射組除肺泡間隔明顯增厚外,還出現(xiàn)肺泡腔融合與炎性滲出現(xiàn)象(圖3D)。

A.生理鹽水組(對(duì)照組);B.12.5 mg/kg SNP注射組;C.25.0 mg/kg SNP注射組;D.50.0 mg/kg SNP注射組;標(biāo)尺:20 μm;黑色箭頭指示肺泡間隔增厚,白色箭頭指示肺泡內(nèi)炎性滲出物。A.Saline group (Control group); B.12.5 mg/kg SNP injection group; C.25.0 mg/kg SNP injection group; D.50.0 mg/kg SNP injection group; Scale bar,20 μm; Black arrows indicate thickening of the alveolar septum,white arrows indicate inflammatory exudates in the alveoli.圖3 小鼠肺組織HE染色結(jié)果Fig.3 HE stain result of mouse lung tissue

2.4 SNPs誘導(dǎo)肺臟組織細(xì)胞凋亡

為了檢測(cè)SNPs是否引起肺臟組織細(xì)胞的凋亡,將制作好的石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色。TUNEL染色結(jié)果表明生理鹽水組肺組織切片的細(xì)胞核均被染為藍(lán)色,無綠色熒光,表明未發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖4Aa-Ac);12.5、25.0、50.0 mg/kg SNP注射組出現(xiàn)少數(shù)綠色熒光,表明SNP處理組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(圖4Ba-Dc)。

Aa-Dc.激光共聚焦檢測(cè)不同劑量SNPs處理后肺組織細(xì)胞凋亡情況,生理鹽水組(Aa-Ac)、12.5 mg/kg SNP注射組(Ba-Bc)、25.0 mg/kg SNP注射組(Ca-Cc)和50.0 mg/kg SNP注射組(Da-Dc),標(biāo)尺:50 μm。Aa-Dc.Laser confocal detection of lung cell apoptosis after SNPs treatment.Aa-Ac.Normal saline group; Ba-Bc.12.5 mg/kg SNP injection group; Ca-Cc.25.0 mg/kg SNP injection group; Da-Dc.50.0 mg/kg SNP injection group,scale bar,50 μm.圖4 SNPs對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of SNPs on apoptosis of mouse lung tissue cells

3 討論

SNPs是一種直徑小于100 nm的粒子,由于其具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和良好的生物相容性,成為目前應(yīng)用較為廣泛的新興納米材料之一[8]。SNPs可用于成像和藥物監(jiān)測(cè),混合磁性納米二氧化硅(magnetic silica nanoparticles,MSNs)被用作下一代磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)造影劑,SNPs裝載藥物如鏈霉素等進(jìn)行生物遞送大大提高了藥物利用率,以SNPs為佐劑制備的糖蛋白85(glycoprotein 85)蛋白疫苗可有效對(duì)抗禽白血病病毒[9-12]。但隨著其使用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展,SNPs對(duì)于健康的危害也逐漸顯現(xiàn)出來,并引起了高度關(guān)注。研究表明,SNPs可通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚和血液等途徑進(jìn)入機(jī)體[13]。SNPs相關(guān)毒性研究顯示,SNPs暴露后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌損傷,心輸出量、收縮力和心率等降低情況,同時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生壞死;攝入SNPs后大鼠肝和腎發(fā)生氧化應(yīng)激,進(jìn)而造成組織損傷[14-15]。肺臟作為SNPs暴露的直接靶器官之一,可通過吸入方式受到損傷,因此肺臟是SNPs毒性研究熱點(diǎn)。研究證實(shí),支氣管灌注SNPs會(huì)引發(fā)小鼠肺部炎癥,嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肺纖維化;急性暴露于SNPs會(huì)增加小鼠肺通透性,增加小鼠對(duì)致命性肺炎的易感性[16-18]。目前,SNPs在疾病治療及其他藥物遞送等方面發(fā)揮的佐劑作用日益廣泛,其攝入方式也逐漸多樣化,但皮膚與血液暴露方式的毒性研究相對(duì)較少,也成為納米材料臨床應(yīng)用亟待探討的問題。

在本試驗(yàn)中,我們采用了單分散性好實(shí)心SNPs粒子以尾靜脈注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行15 d急性處理,結(jié)果顯示12.5 mg/kg SNPs處理后小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育和臟器形態(tài)等方面與生理鹽水組無顯著差異,表明該劑量作用下SNPs不會(huì)對(duì)機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。將取得的肺組織進(jìn)行切片制作并進(jìn)行凋亡相關(guān)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)隨劑量增加,25.0和50.0 mg/kg劑量下出現(xiàn)肺泡間隔增厚,且50.0 mg/kg SNP處理組出現(xiàn)炎性滲出現(xiàn)象。TUNEL染色結(jié)果顯示隨SNPs劑量增加,細(xì)胞出現(xiàn)零星凋亡,表明12.5、25.0和50.0 mg/kg SNP處理無顯著促凋亡作用但對(duì)肺臟產(chǎn)生了一定的毒副作用。相關(guān)研究表明,納米材料毒性與其表面電荷、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及尺度大小密切相關(guān)[19]。王明祥等[20]對(duì)小鼠進(jìn)行小尺度SNPs染毒處理,發(fā)現(xiàn)其肺臟出現(xiàn)明顯水腫與浸潤(rùn)現(xiàn)象,導(dǎo)致肺損傷;李明月等[21]發(fā)現(xiàn)納米二氧化硅可導(dǎo)致大鼠肺臟發(fā)生明顯纖維化,而本文所采用的SNPs對(duì)小鼠毒性較低。因此,將該顆粒用于體內(nèi)試驗(yàn)時(shí),可參考12.5 mg/kg作為安全使用濃度。但本文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)尚有需要改進(jìn)之處,如動(dòng)物暴露于SNPs環(huán)境且可能受到其影響的情況多為長(zhǎng)期效應(yīng)導(dǎo)致,故也應(yīng)探討低劑量長(zhǎng)期暴露造成的毒理效應(yīng);相同SNPs粒子以不同攝入方式對(duì)機(jī)體和肺臟是否產(chǎn)生不同毒性影響的問題也應(yīng)進(jìn)一步探索。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用更多探究途徑,多方面研究SNPs對(duì)小鼠肺臟的毒性作用,從而為SNPs納米顆粒的毒副作用研究提供更為全面的理論依據(jù)。

本研究表明SNPs通過尾靜脈注射方法急性處理小鼠后引起肺臟組織肺泡間隔增厚和炎性滲出現(xiàn)象。