內(nèi)化素G在單增李斯特菌入侵巨噬細(xì)胞中的作用研究

史文靜,劉圓園,王子堅(jiān),王學(xué)儉,齊玉梅,田常青,茍惠天*,薛慧文*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),甘肅蘭州 730070;2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730199;3.蘭州市西固區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730060)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種食源性病原菌,可導(dǎo)致李斯特菌病。它是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,能夠入侵吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞并繁殖。在攝入受污染的食物后,細(xì)菌會穿過腸道屏障,通過血液進(jìn)入肝臟和脾,大多數(shù)細(xì)菌會被免疫系統(tǒng)清除[1]。在免疫功能受損和低下的群體中,細(xì)菌可穿過血腦屏障和胎盤屏障,到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤[2]。

目前已知有25種內(nèi)化素(internalin,Inl),Inl A和Inl B是李斯特菌特有且重要的毒力因子。其中Inl A由于其C末端Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基序而與細(xì)菌表面共價連接,通過與宿主的E-鈣粘蛋白相互作用促進(jìn)人類腸上皮樣細(xì)胞系的感染,是體內(nèi)侵襲腸道和胎盤絨毛所必需的[3]。Inl B通過其GW結(jié)構(gòu)域與脂磷壁酸結(jié)合到細(xì)菌表面,具有更寬的宿主譜,可與宿主的細(xì)胞膜肝細(xì)胞生長因子受體結(jié)合并通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶來促進(jìn)吞噬,也可結(jié)合補(bǔ)體分子C1q發(fā)揮作用[4]。本研究的Inl G是由Lmo0262基因編碼的細(xì)胞表面蛋白,與Inl A同屬含LPXTG結(jié)構(gòu)[5],緊緊錨定在革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上。與Inl A相比,Inl E、Inl F、Inl G和Inl H不參與入侵,但對宿主組織的定植具有重要意義。有研究表明LM入侵非吞噬細(xì)胞時Inl G、Inl H、Inl E可幫助Inl A入侵細(xì)胞[6]。Bergmann B等[7]發(fā)現(xiàn)LM缺失InlGHE基因簇或單個基因會導(dǎo)致對哺乳動物的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)和其他非吞噬細(xì)胞的入侵作用增加2～4倍。Balandyté L[8]等研究發(fā)現(xiàn)Inl G主要存在于環(huán)境分離菌株中,很少存在于臨床分離的人和動物源菌株中,表明Inl G對LM適應(yīng)宿主外環(huán)境和生存息息相關(guān)。劉圓園[9]等證明Inl G具有較好的免疫原性。目前Inl G被證實(shí)與LM毒力有關(guān),致病力方面研究較少。本研究利用同源重組構(gòu)建了內(nèi)化素G缺失株(LM-ΔInl G)[10],對其生長特性、對溫度和酸堿的耐受性、對巨噬細(xì)胞的內(nèi)化作用,并對LM和LM-ΔInl G進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,為研究Inl G功能提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 單增李斯特菌(ATCC19111),小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW 264.7),甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室存;大腸埃希氏菌DH5α,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;穿梭載體pKSV7,大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase、PCR Mix,大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)、溶菌酶、氯霉素、青霉素G和瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品; DNA Marker,細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Fast Fire qPCR PreMix(SYBR Green)(FP207),北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;胰蛋白酶消化液,蘇州新賽美生物科技有限公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;其他試劑均使用分析純。

1.1.3 主要儀器 BCM-1300潔凈工作臺(生物潔凈型),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;HH.B11-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;Mastercycler nexus GSX1梯度PCR儀,MiniSpin plus臺式離心機(jī),德國Eppendorf公司產(chǎn)品;MCO-17AI型CO2培養(yǎng)箱,日本三洋公司產(chǎn)品;BIO-RAD-2000凝膠成像儀,Gene Pulser Xcell電穿孔系統(tǒng),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;Gene Quant 1300分光光度計,美國GE公司產(chǎn)品;Light Cycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀,瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照GenBank中已公布的InlG序列,設(shè)計同源臂引物,酶切位點(diǎn)(下劃線)及保護(hù)性堿基(斜體)。旁外側(cè)引物D-F和D-R用于PCR鑒定缺失株,Hly-F和Hly-R為LM的特異性鑒定引物。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 LM基因組的提取 將實(shí)驗(yàn)室保存的LM接種于BHI固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)16～18 h,挑取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～18 h,用1.5 mL離心管收集菌體,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取LM全基因組,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LM感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取LM單菌落過夜培養(yǎng),轉(zhuǎn)接1 mL菌液到100 mL的0.5 mol/L蔗糖BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h,加入25 μL 0.05 g/L青霉素G,繼續(xù)培養(yǎng)使光吸收值(OD600)達(dá)0.5～0.6,冰上預(yù)冷30 min后4 ℃離心收集菌體;用含有0.5 mol/L蔗糖的HEPES液洗滌2次,第2次洗滌液體積減半;用5 mL HEPES溶液重懸,加入20 μL溶菌酶充分混勻,37 ℃水浴20 min;4 ℃離心用HEPES溶液洗滌1次收集菌體,用1 mL HEPES溶液重懸分裝到1.5 mL離心管中保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內(nèi)化素G缺失株LM-ΔInl G的構(gòu)建 以LM全基因組DNA為模板,分別以ΔInl G-F1、ΔInl G-R1為上游同源臂的引物,ΔInl G-F2、ΔInl G-R2為下游同源臂的引物擴(kuò)增,利用重疊延伸PCR對ΔInl G的同源臂進(jìn)行融合。測序正確后,將ΔInl G的同源臂與穿梭質(zhì)粒pKSV7連接,形成重組質(zhì)粒pKSV7-ΔInl G。將pKSV7-ΔInl G電擊轉(zhuǎn)化LM感受態(tài)細(xì)胞,并篩選陽性菌。在41 ℃和氯霉素存在下進(jìn)行同源重組。重組完全后,pKSV7質(zhì)粒在30 ℃和無氯霉素條件下丟失。通過PCR檢測基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性。

當(dāng)帶電粒子在沒有初始速度在均勻電場中時，如果帶正電荷，它將沿電場線以零初速度勻加速直線運(yùn)動，如果粒子帶負(fù)電荷，它將在與電場線相反的方向移動。當(dāng)帶電粒子的初始速度方向平行與電場線時，根據(jù)帶電粒子的帶電情況決定其做初速度不為零的勻加速還是勻減速直線運(yùn)動，這取決于。當(dāng)帶電粒子的初速度方向與電場線成一定夾角θ時，將物體的初速度分解在電場線方向上或垂直于電場線方向上，并分步求解。

1.2.5 LM和LM-ΔInl G的生長情況

1.2.5.1 LM和LM-ΔInl G不同溫度下生長曲線測定 把野生株LM和缺失株LM-ΔInl G分別劃線于BHI固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18～20 h,挑單菌落接種于3 mL BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h。調(diào)整菌液為同一濃度,將菌液1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL BHI液體培養(yǎng)基中,分別在30 ℃、37 ℃和41 ℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速150 r/min,每隔2 h直至12 h取樣200 μL于96孔平板,用分光光度計測定菌液OD600,各設(shè)置3個平行。

1.2.5.2 LM和LM-ΔInl G不同pH值條件下生長曲線測定 將培養(yǎng)菌液按照1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL BHI液體培養(yǎng)基中,分別在pH5、pH7和pH9進(jìn)行振蕩培養(yǎng),每隔2 h于96孔板中取200 μL菌液,測定OD600,各設(shè)置3個平行。

1.2.6 Inl G對單增李斯特菌毒力的影響

1.2.6.1 細(xì)菌懸液的制備 挑取LM和LM-ΔInl G單個菌落,轉(zhuǎn)接到5 mL BHI培養(yǎng)至對數(shù)生長期離心收集菌體,用無菌PBS洗滌3遍,用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整OD600至0.12左右(約1×108CFU/mL),準(zhǔn)備感染細(xì)胞。

1.2.6.2 細(xì)胞黏附和侵襲試驗(yàn) 將傳代培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶壁,細(xì)胞密度為5×105/mL(感染復(fù)數(shù)比MOI=1∶100),棄去培養(yǎng)液,用無菌PBS漂洗3遍,加入細(xì)菌懸液在37 ℃、5% CO2條件下感染細(xì)胞2 h。用無菌PBS漂洗3遍,用0.5% Triton X-100裂解細(xì)胞,收集裂解液倍比稀釋涂板計數(shù)。侵襲試驗(yàn)用以上相同方法感染細(xì)胞2 h,無菌PBS漂洗3遍后,每孔加500 μL 100 μg/mL慶大霉素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液作用1 h以殺滅細(xì)胞外細(xì)菌。無菌PBS漂洗3遍,用0.5% Triton X-100裂解細(xì)胞,收集裂解液做倍比稀釋涂板計數(shù)。

1.2.7 LM和LM-ΔInl G的轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.7.1 檢測樣品制備及測序 取1 mL LM和LM-ΔInl G過夜培養(yǎng)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6,收集菌體用PBS洗滌3次,在-80 ℃保存,干冰運(yùn)輸。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)及原始數(shù)據(jù)質(zhì)控均委托北京諾禾致源科技公司完成,包括樣品檢測、RNA文庫構(gòu)建、富集,采用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行高通量測序。

1.2.7.3 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 隨機(jī)選取10個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(表2),由北京擎科生物科技有限公司合成。使用RNA提取試劑盒提取樣品RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。使用Light Cycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀上機(jī)擴(kuò)增,每個樣本設(shè)置3個重復(fù),以16S rRNA為內(nèi)參基因。根據(jù)2-ΔΔCt法計算每個基因的相對轉(zhuǎn)錄水平,用GraphPad Prism8統(tǒng)計軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)化素G基因缺失株LM-ΔInlG的構(gòu)建

擴(kuò)增的InlG上下游同源臂分別為633 bp和596 bp,通過重疊延伸PCR將InlG的同源臂融合,得到1 229 bp的片段,命名為ΔInl G。pKSV7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后與ΔInl G連接,轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒pKSV7-ΔInl G電擊轉(zhuǎn)化LM感受態(tài)細(xì)胞,在41 ℃和氯霉素存在下進(jìn)行同源重組。篩選陽性轉(zhuǎn)化子并擴(kuò)增出大小為1 229 bp的片段。在30 ℃、無抗生素的條件下,傳至30代時穿梭質(zhì)粒成功丟失,在傳代第70代由2條帶變成1條短帶,大小1 644 bp,表明同源重組完全。重組菌株在37 ℃連續(xù)培養(yǎng)20代,獲得1株穩(wěn)定遺傳的缺失株(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～8.完全重組菌M.DNA Marker DL 5 000; 1-8.completely recombinant strain圖1 內(nèi)化素G缺失株的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of Inl G gene deletion strains

2.2 LM和LM-ΔInl G的生長情況

2.2.1 LM和LM-ΔInl G不同溫度條件下生長曲線測定結(jié)果 不同溫度下生長曲線測定結(jié)果發(fā)現(xiàn):30 ℃時兩株菌生長緩慢,LM-ΔInl G的生長速度較高于LM,但生長趨勢接近;在37 ℃和41 ℃生長較好;其中37 ℃時2株菌均生長情況最好,0～2 h為生長適應(yīng)期,2～6 h生長對數(shù)期;6～8 h兩株菌生長趨勢較2～6 h相對緩和,8～12 h生長穩(wěn)定期,LM和LM-ΔInl G生長趨勢一致,表明InlG不參與溫度調(diào)節(jié),不影響LM生長。

2.2.2 LM和LM-ΔInl G不同pH值生長曲線測定結(jié)果 不同pH條件下生長曲線測定結(jié)果顯示,相同pH時,LM和LM-ΔInl G的增長趨勢相同;pH5時LM與LM-ΔInl G生長速度緩慢,pH9時生長速度較高于pH5;pH7時2株菌生長較好。表明InlG缺失后并不會影響細(xì)菌耐堿不耐酸的特性,2株菌均在pH7的條件下生長最好。

2.3 Inl G對單增李斯特菌毒力的影響

LM-ΔInl G比LM對RAW 264.7細(xì)胞黏附、侵襲均增強(qiáng)。LM-ΔInl G對細(xì)胞的黏附能力是LM的1.23倍(P<0.01),侵襲力是約1.98倍(P<0.01),且兩者差異極顯著。數(shù)據(jù)表明LM-ΔInl G缺失株增強(qiáng)了單增李斯特菌對細(xì)胞的內(nèi)化作用。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

2.4.1 差異表達(dá)基因的篩選 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明在LM和LM-ΔInl G都表達(dá)的基因有2 742個,在LM中表達(dá)的基因有31個,而在LM-ΔInl G中表達(dá)的基因有21個。以|log2Fold Change|>1,P<0.05作為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn),得到LM-ΔInl G比LM有42個顯著差異表達(dá)基因,其中18個基因表達(dá)上調(diào),24個基因下調(diào)。Lmo1179、Lmo0447(Gad D1)、溶血素O、肌動蛋白聚集因子(ActA)、磷脂酰肌醇特異性卵磷脂酶(PlcB)、內(nèi)化素C(InlC)、乙醇胺氨裂解酶大亞基和乙醇胺氨裂解酶小亞基等表達(dá)上調(diào),其中以Lmo1179表達(dá)變化差異最大,該基因與氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)和氧化還原過程(oxidation-reduction process)有關(guān)。下調(diào)基因中以Lmo1369表達(dá)變化差異最大,該基因調(diào)控磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶的活性,主要與轉(zhuǎn)移酶活性,轉(zhuǎn)移?；鶊F(tuán)(transferase activity,transferring acyl groups)相關(guān)。

2.4.2 差異表達(dá)基因的GO分類 將LM-ΔInl G的差異表達(dá)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,共獲得93個GO功能注釋,分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個大類,包含45類生物學(xué)過程,19類細(xì)胞組分,29類分子功能。MF中氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)和小分子結(jié)合(small molecule binding),裂解酶活性(lyase activity)是含有差異表達(dá)基因最多的3類,分別為6、6、5個。BP中氮化合物代謝過程(nitrogen compound metabolic process)含有最多的差異表達(dá)基因5個,羧酸的代謝過程(carboxylic acid metabolic process),酮酸的代謝過程(oxoacid metabolic process),有機(jī)酸的代謝過程(organic acid metabolic process)、氧化-還原過程(oxidation-reduction process)和小分子代謝過程(small molecule metabolic process)分別含有4個差異表達(dá)基因。在CC中,細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)差異基因數(shù)目最多,各有3個。在所有GO功能分類中,前20個富集最明顯的分類中CC占了11個,細(xì)胞組分是細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu),不指代謝過程,說明差異表達(dá)基因產(chǎn)物在執(zhí)行功能時所處的細(xì)胞結(jié)構(gòu)位置多在核糖體。

2.4.3 差異表達(dá)基因的KEGG注釋分析 將LM-ΔInl G的差異表達(dá)基因注釋到KEGG pathway代謝通路,通過Pathway富集的顯著程度進(jìn)行排序,顯著差異表達(dá)基因分別富集到群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)、丙酸代謝(propanoate metabolism),纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(valine,leucine and isoleucine degradation)、甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)和丁酸代謝(butanoate metabolism)等22個pathway代謝通路中,其中富集程度最為顯著的是群體感應(yīng)和丙酸代謝信號通路。

2.4.4 差異表達(dá)基因的實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 本研究隨機(jī)選取5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證(圖2)。結(jié)果顯示,10個差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果與DE Seq的結(jié)果趨勢一致,只是差異倍數(shù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有所區(qū)別,說明該轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可信度較高。

圖2 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證分析Fig.2 Validation analysis of the differentially expressed genes by qRT-PCR

3 討論

李斯特菌鑒定出4個毒力基因簇,被稱為李斯特菌致病島(Listeriapathogenicity island,LIPI),包括LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3和LIPI-4。LIPI-1是LM在細(xì)胞內(nèi)生存和傳播所必需的[11],存在于所有LM菌株中,包括PrfA、ActA、Hly、Mpl、PlcA和PlcB共6個基因。LIPI-2稱為內(nèi)化素小島,其家族是LM對宿主細(xì)胞黏附和侵襲所特有的蛋白[12]。一般情況下,內(nèi)化素通常都是以基因簇的形式存在,是由內(nèi)化素基因編碼的N端具有富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats,LRRs)一系列蛋白產(chǎn)物,LRRs存在于各種參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附過程的蛋白質(zhì)[13]。本研究表明InlG基因缺失后并不會影響細(xì)菌耐堿不耐酸的特性。InlG基因不參與溫度調(diào)節(jié),對LM的生長特性影響很小。

本研究對LM與LM-ΔInl G進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得大量的差異表達(dá)基因。GO功能注釋分類顯示,差異表達(dá)基因主要涉及分子功能(催化活性、分子結(jié)合等)、細(xì)胞組分(包括細(xì)胞部分、細(xì)胞、細(xì)胞器等)、生物過程(包括穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)等)3大類。對差異基因進(jìn)行Pathway分析,進(jìn)一步對差異表達(dá)基因參與的主要代謝途徑進(jìn)行研究,有利于明確差異表達(dá)基因在生物代謝周期中發(fā)揮的功能以及與其他基因的相互作用。KEGG富集分析表明,與LM相比,LM-ΔInlG中群體感應(yīng)(QS)、丙酸代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等3個通路顯著富集。QS是微生物產(chǎn)生并識別與自身種群密度相關(guān)的信號分子,當(dāng)信號分子濃度達(dá)到一定閾值,通過包括受體蛋白在內(nèi)的信號分子傳遞系統(tǒng)調(diào)控某些特定基因表達(dá),改變種群生理狀態(tài)的一種現(xiàn)象[14]。QS可以調(diào)控生物發(fā)光、生物膜形成和毒力因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)LM以AgrD信號分子為基礎(chǔ)的QS系統(tǒng)主要參與生物膜形成、調(diào)節(jié)毒力因子表達(dá),而以autoinducer-2(AI-2)信號分子為基礎(chǔ)的QS系統(tǒng)研究尚處于初步階段,發(fā)現(xiàn)其參與生物膜形成[15]。亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸是蛋白質(zhì)中的3種常見氨基酸,統(tǒng)稱支鏈氨基酸,研究表明纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解以及細(xì)胞外基質(zhì)與過表達(dá)的蛋白質(zhì)受體的相互作用有關(guān)[16],可能影響蛋白質(zhì)的合成,進(jìn)而影響能量代謝。這些KEGG通路也存在于其他細(xì)菌和人體細(xì)胞中,提示丙酮酸可能控制通路中酶的活性或穩(wěn)定性,影響能量代謝調(diào)節(jié)[17]。

LM在細(xì)胞內(nèi)的感染與多種因素有關(guān),包括其在細(xì)胞間的存活、增殖和擴(kuò)散。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明內(nèi)化素G缺失后一部分基因表達(dá)上調(diào),其中Hly、ActA、PlcB和InlC是LM的主要毒力因子,協(xié)同參與了細(xì)菌的黏附與侵襲。證明了內(nèi)化素G缺失后LM對RAW 264.7細(xì)胞的內(nèi)化作用增強(qiáng)。在LM細(xì)胞內(nèi)感染周期中,細(xì)菌被胞吞進(jìn)宿主細(xì)胞后被初級吞噬泡包裹,由Hly編碼的LM 的溶血素O通過溶解吞噬泡和膜穿孔介導(dǎo)LM從吞噬小體中逃逸[18]。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶(Plc A)和磷脂酰肌醇特異性卵磷脂酶(Plc B)可以通過抑制自噬前體的成熟或阻止自噬機(jī)制的目標(biāo)識別使LM能夠逃避宿主自噬,推動LM在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞之間的移動,成功逃逸至細(xì)胞胞漿[19]。細(xì)菌逃逸至該環(huán)境后,可在其中存活和分裂,也可通過大量誘導(dǎo)表達(dá)Act A,Act A在細(xì)胞質(zhì)中招募肌動蛋白有核復(fù)合體,介導(dǎo)肌動蛋白聚合形成彗星狀尾巴提供動力,利于LM在宿主細(xì)胞間穿梭[20],形成次級吞噬泡進(jìn)行新一輪感染。有研究報道,缺失PlcA和PlcB的缺失株在感染巨噬細(xì)胞的過程中容易觸發(fā)細(xì)胞自噬,使菌體增殖減少[21],本試驗(yàn)缺失InlG后,PlcB表達(dá)量增加,可以懷疑在感染巨噬細(xì)胞的過程中抑制了細(xì)胞自噬,使菌體增殖增加。作為內(nèi)化素家族的一員,Inl C是一種小型分泌蛋白,無LPXTG基序,含5個連續(xù)的富含亮氨酸的重復(fù)序列[22]。InI C可以通過與緊密連接復(fù)合體的調(diào)節(jié)因子的相互作用,來緩解宿主細(xì)胞的皮質(zhì)張力,使脂膜更易變形而有利于細(xì)菌的轉(zhuǎn)移,隨后進(jìn)入相鄰的健康細(xì)胞[23]。Lmo0447(GadD1)構(gòu)成谷氨酸脫羧酶耐酸系統(tǒng)的一部分[24],該系統(tǒng)有3種脫羧酶Gad D1、Gad D2和Gad D3和兩種逆向轉(zhuǎn)運(yùn)因子Gad T1和Gad T2。有報道稱GadD1與內(nèi)化素InlGHE基因簇密切相關(guān)[25],LM-ΔInl G中GadD1表達(dá)上調(diào),3個谷氨酸脫羧酶對LM抗酸應(yīng)激能力的貢獻(xiàn)為Gad D2>Gad D3>Gad D1[26],這也證明了缺失內(nèi)化素G后單增李斯特菌的耐酸性并沒有顯著變化[27]。

本研究成功構(gòu)建了內(nèi)化素G缺失株LM-ΔInl G,進(jìn)行了體外生長,對不同溫度、不同pH值的應(yīng)激,對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的黏附、侵襲及轉(zhuǎn)錄組測序試驗(yàn)。驗(yàn)證了Inl G與LM的毒力有關(guān),內(nèi)化素G不參與溫度與酸堿的調(diào)節(jié),內(nèi)化素G缺失上調(diào)表達(dá)了LM的主要毒力因子,增強(qiáng)了對細(xì)胞的內(nèi)化作用,下一步將通過分析Inl G的受體以及它是否與其他蛋白協(xié)同作用來探索Inl G的詳細(xì)功能機(jī)制。