牛源產(chǎn)酸芽孢桿菌的分離篩選及益生特性研究

王 婷,安明軒,李正浩,胡瑞瑞,王 悅,倪 偉,胡圣偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832000)

自1950年代以來(lái),抗生素已被用于畜牧業(yè)中,用于促進(jìn)生長(zhǎng)、治療和預(yù)防疾病?？股卦谥扑庮I(lǐng)域生產(chǎn)高達(dá)80%用于食品生產(chǎn),大多數(shù)抗生素被用作飼料添加劑來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[1]。然而,研究表明,濫用抗生素導(dǎo)致威脅動(dòng)物健康和人類健康的多重耐藥病原體的出現(xiàn),抗生素耐藥性的出現(xiàn),使得耐藥菌株在體內(nèi)大量繁殖,造成動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào)問(wèn)題以及抗生素本身的殘留性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,影響正常機(jī)體健康[2];因此需要尋找一種可用于臨床及生產(chǎn)的抗生素的代替品,近年來(lái),微生物作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧業(yè)也得到了認(rèn)可,國(guó)內(nèi)外研制也出了多種益生菌活菌制劑[3],益生菌活菌制劑來(lái)替代抗生素作為一種新的飼料添加劑必將成為一種新趨勢(shì)。

益生菌被定義為活的非病原微生物的單一和/或混合培養(yǎng)物,當(dāng)給予適當(dāng)數(shù)量時(shí),可以為宿主提供益處[4]。動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的有益的細(xì)菌或真菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、丁酸梭菌等。芽孢桿菌是一類在不良環(huán)境中能形孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,具有很強(qiáng)的抵抗力和有較高的穩(wěn)定性[5];芽孢桿菌為需氧菌[6],為多數(shù)厭氧或兼性厭氧菌提供有利的生存環(huán)境,間接發(fā)揮益生效果;產(chǎn)酸芽孢桿菌[7]有較強(qiáng)的產(chǎn)孢能力,具有產(chǎn)乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的益生特性,能夠降低pH抑制有害菌的生長(zhǎng),維持腸道健康;芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)合成多種維生素、酸性物質(zhì)和促生長(zhǎng)因子等物質(zhì),為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)酸芽孢桿菌對(duì)腹瀉、結(jié)腸炎、糖尿病等疾病有治療作用[8]。因此,芽孢桿菌被用作預(yù)防或治療胃腸道疾病的益生菌。本研究旨在從健康牛新鮮糞便樣品中分離純化出產(chǎn)酸芽孢桿菌的細(xì)菌,篩選出耐酸、耐膽鹽、抗逆性良好,可產(chǎn)生水解酶等特性良好的益生芽孢桿菌菌株,體外抑菌能力和抗生素抗菌性的研究,從而為研制和開(kāi)發(fā)牛源益生菌制劑提供理論依據(jù)和優(yōu)勢(shì)菌株的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 動(dòng)物糞便采集于石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院,2020年9月至2020年11月,采集牛新鮮糞便,無(wú)菌試管密封包裝低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只雌性C57BL/6小鼠,體重約21 g,購(gòu)自西安市輝石生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 溴甲酚綠鑒定培養(yǎng)基,LB(Luria-Bertani)瓊脂培養(yǎng)基,MRS肉湯,羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基,可溶性淀粉培養(yǎng)基,MH(Mueller-Hinton)瓊脂培養(yǎng)基,藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 生化恒溫培養(yǎng)箱(BSP-250),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀(TC-E-40D),杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(1530),Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))產(chǎn)品;磁力攪拌器(GL-3250A),上海申安醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 牛源產(chǎn)酸菌株的分離與純化 采集健康牛的新鮮糞便約5 g,置于無(wú)菌的50 mL離心管中,20℃保存。對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理后,取1 mL稀釋液于裝有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中進(jìn)行稀釋,10-2～10-8各1 mL于溴甲酚綠固體篩選培養(yǎng)基中,進(jìn)行稀釋涂布培養(yǎng),待凝固后置于37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取培養(yǎng)基光滑、邊緣完整、較大的菌落,菌落邊緣變黃的菌落于液體培養(yǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)。反復(fù)進(jìn)行分離純化2～3次后,挑取在篩選養(yǎng)基中有生長(zhǎng)特征的菌落進(jìn)行分離純化,菌種和50%甘油以1∶1混勻后置于-20℃保存或-80℃長(zhǎng)期保存用于后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.2 菌種鑒定 以分離純化后的單菌落為模板, 細(xì)菌通用引物(27F 5′-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′, 1492R 5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段。PCR擴(kuò)增體系:模板0.4 μL,細(xì)菌通用引物0.6 μL,高保真Mix 10 μL,用ddH2O補(bǔ)足到20 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 1 min 30 s,35個(gè)循環(huán),72℃ 3 min,4℃結(jié)束反應(yīng)。并設(shè)置陰性對(duì)照。增完畢后取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與10×Loading buffer混勻,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(瓊脂糖濃度為12 g/L),將凝膠置于成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。將PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI中的Blast軟件進(jìn)行GenBank同源性比較。

1.2.3 耐酸耐膽鹽試驗(yàn)

(1)耐酸試驗(yàn) 將分離菌株按3%比例接種到pH為1.0、2.0、3.0的5 mL MRS肉湯中37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h、24 h后。于600 nm處測(cè)OD值,讀取3個(gè)重復(fù)讀數(shù)求平均值后,計(jì)算存活率即可代表菌株對(duì)酸的耐受性。

(2)耐膽鹽試驗(yàn) 將分離菌株按3%比例接種到含0.3%、0.5%的牛膽酸鹽的 5 mL MRS肉湯中,37℃靜置培養(yǎng)3 h,24 h后,于600 nm處測(cè)OD 值,讀取3個(gè)重復(fù)讀數(shù)求平均值后,計(jì)算存活率即可代表菌株對(duì)膽鹽的耐受性。

1.2.4 耐人工腸胃液菌株的篩選 人工胃液的制備:稱取10 g胃蛋白酶中加入1 mol/L稀HCl 16.4 mL,蒸餾水定容至1 000 mL,混勻,pH調(diào)至2.0,用0.22 μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾待用,4℃冰箱保存。

人工腸液的制備:取K2HPO45.59 g,KH2PO40.41 g,胰蛋白酶10 g,加水定容至1 000 mL,混勻,pH調(diào)至8,用0.22 μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾待用,4℃冰箱保存。

活化后的受試菌株離心(6 000 r/min,5 min)收集菌體,用無(wú)菌PBS洗滌2次后調(diào)整菌體濃度為1×109CFU/mL。各取1 mL菌懸液加入到9 mL的模擬胃液中,混勻;于37℃培養(yǎng)3 h,分別取樣并梯度稀釋,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌總數(shù);3 h后,取1 mL上述培養(yǎng)液入到加9 mL模擬腸液中,37℃培養(yǎng)6 h;分別取樣100 μL稀釋后的對(duì)照組(未進(jìn)行胃腸液處理)、胃液組、腸液組的菌液涂于LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃孵育24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率。

1.2.5 細(xì)菌自凝聚試驗(yàn) 活化后的菌株進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng),菌液6 000 r/min離心5 min,用PBS洗滌2次,并調(diào)節(jié)OD600為0.5±0.02,記錄為A0;取4 mL菌懸液于37℃靜置放置24 h;取上層液體于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,記錄為A24;重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)。菌株的自聚率(%)表示為:

式中:A0為0 h的吸光度;A24為24 h的吸光度。

1.2.6 產(chǎn)水解酶能力測(cè)定

(1)產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn) 碘液的配制:稱取KI 2 g,用50 mL去離子水溶解,迅速稱量I20.5 g并加入KI溶液中,用純水定容到100 mL,攪拌溶解后保存在棕色瓶中,橡皮塞封口。

挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基,每個(gè)平板點(diǎn)3個(gè)重復(fù),一個(gè)用水做對(duì)照,37 ℃ 培養(yǎng)24 h,用碘液染5 min,分別測(cè)量菌落(H)及透明圈直徑(C),計(jì)算H/C值,取平均值。

(2)產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,用1 mg/mL剛果紅染液染10～15 min,1 mol/L NaCl洗15 min,分別測(cè)量菌落(H)及透明圈直徑(C),計(jì)算H/C值,取平均值。

1.2.7 體外抑菌試驗(yàn) 以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌作為指示菌,用牛津杯法篩選益生菌中對(duì)常見(jiàn)致病菌有抑制能力的菌株．配制LB瓊脂,待培養(yǎng)基冷卻,加入100 μL指示菌,搖勻后倒平板,在牛津杯中加入菌液200 μL,37 ℃培養(yǎng)18～24 h,測(cè)量抑菌圈直徑,檢測(cè)待測(cè)菌株的抑菌能力。

1.2.8 抗菌藥物藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,取200 μL潛在益生菌菌液在MH瓊脂固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布,待平板表面稍干,將抗生素紙片均勻間隔放置于表面上,共9種常見(jiàn)抗生素,氨芐西林10 μg/片,紅霉素15 μg/片,四環(huán)素30 μg/片,慶大霉素 10 μg/片,萬(wàn)古霉素 30 μg/片,鏈霉素 10 μg/片,氯霉素30 μg/片,克林霉素2 μg/片,氧氟沙星5 μg/片),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑的測(cè)定如下: 用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的最大值與最小值,以二者的平均值確定抑菌圈直徑(單位mm)。

1.2.9 對(duì)小鼠體重的影響 選擇6～8周齡C57BL/6小鼠(清潔級(jí)),體重21 g±0.5 g,雌性,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。將20只小鼠隨機(jī)分成2組,為對(duì)照組和試驗(yàn)組,每組10只。每組每只小鼠分別灌服200 μL無(wú)菌PBS磷酸緩沖液鹽溶液和200 μL 1×109CFU/mL混合菌液,連續(xù)灌胃28 d,觀察并記錄小鼠體重變化、健康狀態(tài)、有無(wú)腹瀉等狀況。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 所有樣品的測(cè)定均設(shè)有平行組,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD),試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,利用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌種分離與鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)中共分離出21株產(chǎn)酸菌株,在溴甲酚綠篩選培養(yǎng)基中菌落邊緣變黃為產(chǎn)酸菌株,藍(lán)色為非產(chǎn)酸菌株;以分離純化后產(chǎn)酸菌株為模板,擴(kuò)增的后獲得的序列片斷大小約為1 500 bp(如圖2所示),與目的條帶相符。PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序后,使用NCBI中Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較鑒定。測(cè)序后分析結(jié)果,比較并分析同源性較高的序列,鑒定結(jié)果如表1所示, 5株地衣芽孢桿菌,7株解淀粉芽孢桿菌,7株枯草芽孢桿菌,2株貝萊斯芽孢桿菌。

表1 牛源芽孢桿菌分離菌株的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of bovine Bacillus isolate strains

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;0.陰性對(duì)照; 1～21.分離菌株M.DNA Marker DL 2000; 0.Negative control; 1-21.Isolated strains圖1 分離菌株16srRNA擴(kuò)增電泳結(jié)果圖Fig.1 Results of electrophoresis of isolated strain 16srRNA amplification

2.2 耐酸耐膽鹽試驗(yàn)的測(cè)定

通過(guò)分離純化得到的21株菌株的耐酸耐膽鹽性試驗(yàn)結(jié)果如表2和表3 所示。在酸性培養(yǎng)基中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加菌株的存活率明顯下降,3 h時(shí),所有菌株的存活率在56%以上,24 h時(shí)菌株存活率下降,可推斷出菌株對(duì)pH 2.0以上的酸性環(huán)境適應(yīng)良好。耐膽鹽試驗(yàn)中,在含有質(zhì)量為0.5%的膽鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,地衣芽孢桿菌BL2、BL4、BL5,解淀粉芽孢桿菌BA7、BA9、BA11,枯草芽孢桿菌 BS13、BS16、BS20及貝萊斯芽孢桿菌 BV17耐受性較高。在含膽鹽濃度為0.3%和0.5%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h和24 h菌株存活率良好,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌株的存活率受到了抑制,但在24 h時(shí),以上菌株均能生長(zhǎng)繁殖且存活率為50%以上,說(shuō)明這些菌株在對(duì)0.3%和0.5%膽鹽含量都均有一定的膽鹽耐受能力。因此選擇這些菌株作為后續(xù)的研究。

表2 分離芽孢桿菌菌株對(duì)不同pH值3 h和24 h的體外存活率Table 2 In vitro survival rates of Bacillus strains isolated for different pH values of 3 h and 24 h

表3 分離芽孢桿菌菌株對(duì)不同膽鹽濃度3 h和24 h的體外存活率Table 3 In vitro survival rates of Bacillus strains isolated for different bile salt concentrations of 3 h and 24 h

2.3 耐人工腸胃液菌株的篩選

將高膽鹽含量耐受能力較好的10株芽孢桿菌在人工腸胃液中培養(yǎng)觀察菌株存活情況如表4所示。不同的菌株在胃腸液的刺激下降低程度不一致。由表4可知,10株高耐受性牛源分離株在模擬胃腸道溶液中的存活率差異較大,其中地衣芽孢桿菌BL2,解淀粉芽孢桿菌BA7、BA11和貝萊斯芽孢桿菌BV17的存活率最高,在模擬胃液中耐受3 h存活率依次為75.63%、73.75%、87.75%和73.85%,模擬腸液中耐受6 h后存活率為63.92%、61.23%、73.14%和54.87%。表明這些菌株可以很好的在動(dòng)物胃腸道存活,足以保證達(dá)到足夠的數(shù)量在宿主腸道發(fā)揮潛在作用。相反,BL4、BL5、BA9及BS13、BS16、BS20在胃腸道環(huán)境中的存活率相對(duì)較低,因此,不宜選作益生菌。

表4 菌株對(duì)模擬胃液和腸液的耐受率Table 4 Tolerance rate of bacterial strains to simulated gastric juice and intestinal juice

2.4 細(xì)菌自凝集試驗(yàn)

四株菌株靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)得了菌株的自凝聚能力大小。結(jié)果顯示,地衣芽孢桿菌BL2的自聚集率為71.39%,解淀粉芽孢桿菌BA7和BA11的自聚集率分別為44.69%和57.90%,芽孢桿菌BV17的自聚集率為82.64%,其芽孢桿菌BV17細(xì)胞自凝聚能力最強(qiáng)。以上結(jié)果說(shuō)明不同菌株的自聚集力的強(qiáng)弱也不同,其中解淀粉芽孢桿菌BA7自凝聚力低于50%,在腸道內(nèi)定植不宜定植,故選擇其他三株芽孢桿菌作為潛在益生菌進(jìn)行之后的試驗(yàn)。

2.5 產(chǎn)水解酶能力測(cè)定

產(chǎn)水解酶試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同菌株的產(chǎn)酶能力不同,在染色后,菌株所產(chǎn)生的水解圈為淡黃色或透明圈。產(chǎn)酶能力的大小結(jié)果顯示菌株BL2、BA11、BV17能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶水解圈,BL2產(chǎn)酶能力較強(qiáng),其產(chǎn)2種酶的能力為1.67±0.22和2.07±0.18,BA11產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的大小1.42±0.37和1.72±0.21,BV17能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶的能力為1.36±0.16和1.91±0.07。說(shuō)明這3株菌芽孢桿菌均有產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的能力。

2.6 體外抑菌試驗(yàn)

由以上3株可產(chǎn)生水解酶的菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及大腸埃希氏菌的體外抑制試驗(yàn)結(jié)果由表5顯示,BL2只對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,抑菌環(huán)直徑為11.50 mm±0.52 mm;BA11和BV17對(duì)3種病原菌均有抑制作用。

表5 菌株對(duì)常見(jiàn)病原菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of strains against common pathogens

2.7 抗菌藥物藥敏試驗(yàn)

本試驗(yàn)選擇了氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、鏈霉素、氯霉素、克林霉素、氧氟沙星等9種常見(jiàn)抗菌藥物,抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示(表6),除地衣芽孢桿菌BL2對(duì)慶大霉素、紅霉素、鏈霉素表現(xiàn)為中度敏感(I),對(duì)氨芐西林、氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、克林霉素均表現(xiàn)為敏感(S);BA11和BV17對(duì)這9種抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感(S),不產(chǎn)生耐藥性,可認(rèn)為是安全性菌株。

表6 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of antimicrobial susceptibility tests

2.8 復(fù)合芽孢桿菌對(duì)小鼠試驗(yàn)影響

通過(guò)用3種芽孢桿菌BL2、BA11、BV17制成混合菌懸液連續(xù)飼喂小鼠28 d,對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠均無(wú)不良反應(yīng),精神正常,無(wú)腹瀉情況和中毒癥狀;由28 d小鼠體重變化結(jié)果顯示,試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠體重變化率相比較,試驗(yàn)組小鼠體重增重率在第14天后明顯高于實(shí)驗(yàn)中小鼠,說(shuō)明3株混合菌株為安全的,并且具有增加體重的作用。

3 討論

益生菌是一種通過(guò)定殖宿主菌群,改變腸道微生物組成和通過(guò)調(diào)節(jié)宿主腸道黏膜和機(jī)體免疫和平衡腸道菌群,從而促進(jìn)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收,抑制病原菌的繁殖,維持腸道健康對(duì)宿主有益的活性微生物[9]。研究表明,益生芽孢桿菌可以提高動(dòng)物體的免疫狀態(tài)及影響腸道組織的形態(tài)[10]。本研究通過(guò)從健康牛新鮮糞便樣品中分離純化出產(chǎn)酸芽孢桿菌的細(xì)菌,分離菌株進(jìn)行耐酸、耐膽鹽、人工模擬腸胃液、自聚集性、產(chǎn)生水解酶、體外抑菌和抗生素敏感性測(cè)試和小鼠試驗(yàn)。初步研究表明,從健康牛新鮮糞便中分離出3株芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌BL2、解淀粉芽孢桿菌BA11、貝萊斯芽孢桿菌BV1具有良好的耐酸耐膽鹽、耐藥、促生長(zhǎng)的益生菌潛能。

目前,細(xì)菌失活在益生菌加工和運(yùn)輸過(guò)程中最嚴(yán)重的問(wèn)題之一[11]。腸道環(huán)境復(fù)雜大多數(shù)益生菌存活困難,胃液的pH和小腸中的膽汁濃度通常在3.0左右和0.1%～0.3%范圍內(nèi),這表明益生菌需要強(qiáng)酸和高濃度膽鹽有一定的耐受性才能在腸胃道中定植和發(fā)揮作用[12]。本研究從牛腸道微生物分離得到10株耐酸、耐膽鹽菌,在pH為2.0、膽鹽濃度為0.5%的條件下能生長(zhǎng)繁殖且存活率為50%以上,其中4株菌株在體外模擬胃腸道耐受性試驗(yàn)有較高的存活率,這表明4株菌株都能在胃腸道環(huán)境中存活,可以作為潛在益生菌為下階段試驗(yàn)提供基礎(chǔ)研究。

自凝集能力[13]是評(píng)價(jià)菌種定殖能力的重要指標(biāo)。益生菌的自凝集能力越強(qiáng),越容易形成腸道黏膜屏障的形成,有利于菌群在腸道中定植。本研究表明,4株芽孢桿菌的自聚集力強(qiáng)弱不同。其中,芽孢桿菌BV17的自聚集率最高為82.64%,解淀粉芽孢桿菌BA7的自聚集率最低為44.69%,因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中只選擇了3株自凝集能力較強(qiáng)的芽孢桿菌。

研究表明,在動(dòng)物飼料中添加適當(dāng)比例的微生態(tài)制劑,可產(chǎn)生蛋白酶[14]、脂肪酶、纖維素酶[15]和淀粉酶等多種水解酶,具有調(diào)整腸道微生態(tài)平衡,提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能的作用。Zeng Z[16]研究表明,從藏牦牛中分離到的地衣芽孢桿菌可以通過(guò)提高消化酶活性和腸絨毛長(zhǎng)度來(lái)提高小鼠的生長(zhǎng)性能;地衣芽孢桿菌處理的小鼠在抗氧化能力和與免疫和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子方面表現(xiàn)出優(yōu)越的特性。本研究中BL2、BA11、BV17能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶,BL2產(chǎn)酶能力較強(qiáng),這3株菌芽孢桿菌均有產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的能力,說(shuō)明3株菌株可能具有促進(jìn)消化提高生長(zhǎng)性能的功能。

抗生素用作治療疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),細(xì)菌耐藥性[17]是抗生素的廣泛使用和濫用產(chǎn)生的一個(gè)主要問(wèn)題,對(duì)全球健康構(gòu)成威脅。由于多種益生菌特性和抗菌特性,益生菌被認(rèn)為是抗生素的安全替代品。李瓊燕[18]研究發(fā)現(xiàn),從蜂蜜中初篩出3株耐高溫的疑似芽孢桿菌,并復(fù)篩出1株耐酸耐膽鹽的菌株BSH,飼喂BSH后給線蟲(chóng)感染腸炎沙門氏菌LT2,發(fā)現(xiàn)BSH對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)感染S.LT2具有保護(hù)作用。我們?cè)隗w外抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),BL2只對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,抑菌環(huán)直徑11.50 mm±0.52 mm;BA11和BV17對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及大腸埃希氏菌均有抑制作用。本研究表明,3株菌株對(duì)9種抗生素出現(xiàn)敏感性未產(chǎn)生耐藥性,可認(rèn)為是安全菌株不會(huì)損害宿主健康。

在小鼠試驗(yàn)中,3株菌株混合灌喂28 d,小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng),精神正常,無(wú)腹瀉情況和中毒癥狀,而且與對(duì)照組相比較,灌喂小鼠體重有所增加,說(shuō)明3株菌株為安全且具有增重作用的益生菌。在之后的研究中,可以通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定混合菌灌喂后對(duì)動(dòng)物體內(nèi)微生物菌群的影響,提高生長(zhǎng)性能作用,為進(jìn)一步制備牛源益生菌或動(dòng)物微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)研制提供參考菌株和理論基礎(chǔ)。