坦布蘇病毒GX株對雛鴨的感染性和致病性試驗

胡自強(qiáng),黃允真,張俊勤,李 珂,信愛國,楊 坤,馬靜文,徐志宏,廖 明,高詩敏*,孫敏華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西晉中 030801;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所,廣東廣州 510640;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗室,廣東廣州 510640;4.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗室,廣東廣州 510640;5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥與診斷學(xué)科群廣東科學(xué)觀測實(shí)驗站,廣東廣州 510640;6.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所,云南昆明 650000)

坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬中的Ntaya病毒群,其基因組包含約10990個核苷酸[1]。1955年,人們首次從馬來西亞三代喙庫蚊中分離出TMUV原型毒株MM1775[2]。Kono Y[3]在2000年報道了馬來西亞某個肉雞養(yǎng)殖場暴發(fā)腦炎和生長障礙的疾病,分離到一株TMUV,并明確為該病原引起,這是首次明確TMUV對雞的致病性。后續(xù)研究中,研究人員陸續(xù)從鳥類和蚊子中分離出TMUV菌株,包括雞、鴨、鵝、鴿子、麻雀和庫蚊[4-6]。我國首次報道該病毒是在2010年4月,一場以卵巢輸卵管炎癥和蛋鴨產(chǎn)蛋下降為特征的鴨病毒感染疫情在我國主要鴨養(yǎng)殖區(qū)蔓延,該次疫病的病原體被確定為一種新的黃病毒,命名為鴨坦布蘇病毒[7](Duck Tembusu virus,DTMUV)。

坦布蘇病毒病在我國主要流行于水禽中,伴隨疾病的流行,坦布蘇病毒感染宿主范圍也在不斷擴(kuò)大,偶有產(chǎn)蛋種雞感染TMUV引起產(chǎn)蛋下降的報道[8,9],主要流行毒株為TMUV 2型,但未有TMUV在雞群中大規(guī)模流行的報道。2020年我國廣東地區(qū)開始出現(xiàn)TMUV 3型毒株感染引起的產(chǎn)蛋種雞產(chǎn)蛋下降的流行疾病[10],隨后在我國廣西、福建、湖北、江蘇等地雞群中也發(fā)現(xiàn)了TMUV 3型毒株的流行[11]。值得注意的是禽源TMUV 3型最早在鴨群中被分離鑒定,但并未在鴨群中廣泛流行。本研究以鴨源TMUV-JM株[12]為對照,評估引起雞產(chǎn)蛋下降的雞源TMUV-GX株對雛鴨的感染性和致病性,以期為坦布蘇病毒病流行趨勢預(yù)測及防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞及試驗動物 TMUV-JM株分離自患病鴨,TMUV-GX株分離自產(chǎn)蛋下降蛋雞,所用病毒均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所分離、鑒定和保存;DF-1細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所保存;試驗用SPF級雛麻鴨購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus試劑盒(9109),寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品,pMD18-T載體由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所保存;HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(Q221-01),HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit(P611-01),諾唯贊生物科技(南京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LightCycler?96實(shí)時定量PCR儀(LC96),德國羅氏診斷有限公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)箱(370),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;PCR基因擴(kuò)增儀(T100),德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品;生物安全柜(1300),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;負(fù)壓隔離器(HT-1501),泓騰生物科技(深圳)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考NCBI中TMUV-GX株、TMUV-JM株的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A區(qū)域以及TMUV E基因序列(MN649262.1,JQ920421.1,KT824876.1,MZ031023.1,AB917089.1,AB917090.1,KP742476.1,JN811559.1,KP096415.1,KC990545.1,KX686574.1,KX686578.1,KX686571.1),利用Primer 5軟件,分別設(shè)計引物qGX-NS2A-F/R、qJM-NS2A-F/R、TMUV-E-F/R,用于標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增,以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 TMUV-GX株E基因序列分析 用TMUV E基因的引物擴(kuò)增TMUV-GX株E基因,將擴(kuò)增的目的片段克隆至pMD18-T載體,并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。用MEGA v7.0軟件對TMUV-GX株和GenBank上已發(fā)表的參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。

1.2.3 TMUV RT-PCR檢測方法建立 以TMUV-GX株、TMUV-JM株的RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增目的片段,將片段分別克隆至pMD18-T制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒p-JM-NS2A、p-GX-NS2A并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 TMUV-GX株對雛鴨的感染性和致病性研究 為了研究TMUV-GX株對雛鴨的感染性和致病性,本研究同時用TMUV-JM株及TMUV-GX株對7日齡SPF雛鴨進(jìn)行攻毒試驗,試驗持續(xù)期為18 d。將60只7日齡SPF雛鴨隨機(jī)分為3組,每組20只。第1組和第2組分別進(jìn)行腿部肌肉注射接種TMUV-JM株、TMUV-GX株,每只雛鴨接種劑量為0.1 mL 10-5TCID50/mL,第3組腿部肌肉注射同體積的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為對照。每天觀察并記錄各組雛鴨的精神狀態(tài)、臨床癥狀及體重;于攻毒后2 d、4 d 、6 d每次每組隨機(jī)取3只雛鴨進(jìn)行剖檢并采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦于-80℃凍存,用于提取總RNA,同時用4%多聚甲醛固定,委托武漢賽維爾生物科技有限公司制作病理切片并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察;攻毒后每隔2 d采集一次肛門拭子及喉咽拭子,采用RT-qPCR方法進(jìn)行樣品TMUV RNA檢測。

1.2.5 ISGs表達(dá)水平檢測 研究表明,鴨在感染TMUV后干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)OASL、Mx、IFIT5、Viperin轉(zhuǎn)錄水平會顯著上調(diào)[13]。本研究用相對RT-qPCR方法對攻毒2 d的組織中的ISGs表達(dá)水平進(jìn)行檢測,比較TMUV-JM株和TMUV-GX株誘導(dǎo)雛鴨ISGs表達(dá)水平上調(diào)的差異。

2 結(jié)果

2.1 TMUV-GX株E基因序列分析

將TMUV-GX株E基因進(jìn)行克隆測序,與GenBank中已公布的部分參考序列進(jìn)行比對及分析,發(fā)現(xiàn)TMUV-GX株處于TMUV 3型分支,與我國禽中主要流行的TMUV 2型毒株處于不同分支。同處TMUV 3型分支的還有2012年云南分離的蚊源TMUV YN12193株和YN12115株、2014年山東分離的鴨源TMUV SD14株、2016年泰國分離的鴨源TMUV DK/TH/CU-56株和2020年分離的雞源TMUV CTLN株。

2.2 TMUV-GX株對雛鴨的感染性和致病性

攻毒后臨床觀察結(jié)果顯示,攻毒后1 d開始,攻毒組雛鴨均出現(xiàn)拉綠色稀糞、采食量下降及精神沉郁等癥狀;統(tǒng)計攻毒后體重變化發(fā)現(xiàn),攻毒組雛鴨體重日增重明顯下降,且TMUV-JM攻毒組下降幅度顯著大TMUV-GX攻毒組。試驗期間,各組雛鴨均未出現(xiàn)死亡。

攻毒后2 d、4 d、6 d每次每組隨機(jī)取3只雛鴨進(jìn)行剖檢,剖檢結(jié)果顯示,各組雛鴨肝、脾、肺、腎和腦組織均未出現(xiàn)明顯可見病變。病理組織切片結(jié)果顯示,TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組肝臟組織均可見彌漫性肝細(xì)胞水樣變性,胞質(zhì)疏松淡染,偶見中央靜脈周圍少量淋巴細(xì)胞浸潤(圖1a;圖1e);脾臟組織未見明顯病變;TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組腎臟均可見多量腎小管萎縮,管腔狹窄或消失,少量上皮細(xì)胞壞死,核固縮,伴少量淋巴細(xì)胞浸潤,腔內(nèi)可見壞死細(xì)胞團(tuán)(圖1c;圖1g),其中TMUV-GX攻毒組腎臟少量腎小管上皮細(xì)胞水樣變性,胞質(zhì)疏松淡染(圖1g);TMUV-GX攻毒組腦組織可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞增多(圖1h)。

a.TMUV-JM組的肝臟;b.TMUV-JM組的脾臟;c.TMUV-JM組的腎臟;d.TMUV-JM組的腦;e.TMUV-GX組的肝臟;f.TMUV-GX組的脾臟;g.TMUV-GX組的腎臟;h.TMUV-GX組的腦;i.空白對照組的肝臟;j.空白對照組的脾臟;k.空白對照組的腎臟;l.空白對照組的腦a.Liver of TMUV-JM group;b.Spleen of TMUV-JM group ;c.Kideny of TMUV-JM group;d.Brain of TMUV-JM group;e.Liver of TMUV-GX group;f.Spleen of TMUV-GX group;g.Kidney of TMUV-GX group;h.Brain of TMUV-GX group;i.Liver of blank control group;j.Spleen of blank control group;k.Kidney of blank control group;l.Brain of blank control group圖1 各組雛鴨臟器病理組織切片F(xiàn)ig.1 Histopathological sections of the ducking tissues in each group

利用本研究建立的TMUV-GX株和TMUV-JM株RT-qPCR方法對攻毒后2 d、4 d、6 d采集的組織樣品進(jìn)行病毒載量測定。結(jié)果顯示,TMUV-GX攻毒組和TMUV-JM攻毒組的雛鴨在攻毒后均能在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腦都檢出高病毒載量,TMUV-GX攻毒組和TMUV-JM攻毒組在攻毒后2 d各組織中病毒載量最高,隨后呈下降趨勢,攻毒組間各時間點(diǎn)病毒載量均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2),表明兩種毒株在雛鴨各個臟器中的增殖無統(tǒng)計學(xué)差異。

a.攻毒后2 d;b.攻毒后4 d;c.攻毒后6 da.2 days after the challenge;b.4 days after the challenge;c.6 days after the challenge圖2 各組雛鴨臟器組織病毒載量Fig.2 Viral load in each group of the duckings tissues

2.3 體外排毒測定

采集TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、18 d雛鴨的咽拭子、肛拭子,然后用實(shí)時熒光定量檢測兩組各個天數(shù)的排毒量,用CT值表示。結(jié)果顯示,TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組雛鴨在攻毒后18 d,咽拭子、肛拭子仍呈病毒核酸陽性(CT值36為陽性)(表2)。表明TMUV-GX株感染雛鴨后的排毒能力與TMUV-JM株無明顯差異。

表2 咽拭子和肛拭子各個天數(shù)排毒量Table 2 Virus loads of throat swabs and anal swabs in different days

2.4 ISGs轉(zhuǎn)錄水平檢測

采用相對實(shí)時熒光定量法檢測攻毒后2 d雛鴨肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織中ISGs,Viperin、IFIT5、MX和OASL的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,TMUV-JM株和TMUV-GX株感染均能在各組織臟器中誘導(dǎo)較高水平的ISGs轉(zhuǎn)錄,但不同毒株有所差異(圖3)。Viperin在TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組的肝臟、肺臟、腎臟、腦中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(P<0.05);IFIT5在TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(P<0.05);Mx在TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組的的肝臟和腦中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(P<0.05);OASL在TMUV-JM攻毒組和TMUV-GX攻毒組的脾臟、肺臟、腎臟、腦中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(P<0.05)。

a.肝臟;b.脾臟;c.肺臟;d.腎臟;e.腦a.Liver;b.Spleen;c.Lung;d.Kidney;e.Brain圖3 肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織中ISGs轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05,**P<0.01)Fig.3 Transcription levels of ISGs in liver,spleen,lung,kidney and brain tissues(*P<0.05,**P<0.01)

3 討論

TMUV 3型在我國最早于2012年從蚊子中分離得到[14],2014年研究人員從鴨中分離到第1株禽源TMUV 3型毒株,此后未有禽感染TMUV 3型毒株的報道。至2020年,我國多地蛋雞出現(xiàn)了TMUV感染引起的產(chǎn)蛋下降,病原分子生物學(xué)研究表明其為TMUV 3型毒株,隨后研究人員對雞源TMUV 3型毒株對產(chǎn)蛋雞的致病性進(jìn)行了研究[10]。由于禽源TMUV 3型最早從鴨中分離到,因此,研究雞源TMUV 3型對鴨的致病性對TMUV的跨物種傳播有重要意義。本研究中,TMUV-GX株感染7日齡雛鴨后,臨床表現(xiàn)為采食量下降、精神沉郁、生長阻滯、拉綠色稀糞等;TMUV-GX株感染組和TMUV-JM株感染組雛鴨肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均表現(xiàn)出相同的病理變化,不同的是,TMUV-GX株感染組腦組織可見小膠質(zhì)細(xì)胞增多,提示可能出現(xiàn)腦部炎癥;各感染組雛鴨臟器病毒核酸拷貝數(shù)和排毒持續(xù)時間未見明顯差異,表明TMUV-GX株對雛鴨具有和TMUV-JM株相似的感染性和致病性。

機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng)在抵抗病毒的感染中發(fā)揮著重要作用[15]。研究顯示,鴨源TMUV感染鴨會誘導(dǎo)高水平的ISGs表達(dá),為了解雞源TMUV-GX株與鴨源TMUV-JM株感染雛鴨激活的先天性免疫反應(yīng)的是否存在差異,本研究對感染后2 d組織樣品中Viperin、IFIT5、MX和OASL的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示TMUV-GX株和TMUV-JM株感染雛鴨后誘導(dǎo)的ISGs轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異,表明TMUV-GX株感染雛鴨引起的先天性免疫反應(yīng)與TMUV-JM株有所不同,其中的機(jī)制有待深入研究。

本研究對雞源TMUV 3型GX株與鴨源TMUV 2型JM株對雛鴨的感染性和致病性進(jìn)行了比較性研究,對比我國鴨群主要流行的TMUV 2型毒株,TMUV 3型對雛鴨具有相似的感染特點(diǎn),表明TMUV 3型毒株有在鴨群中廣泛流行的可能,我國坦布蘇病毒病的流行形式將更為復(fù)雜,也將給該病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。