蒙藥額爾敦-烏日勒非靶向代謝組學研究*

高 娃，包斯琴，王青亮，都格爾，錫林其其格，烏漢其木格,

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065）

蒙藥額爾敦-烏日勒，又名“桑培奴布日布”[1]、欽達穆尼組方[2]、珍寶丸[3]等，由制珍珠、沉香、訶子、紅花等29味蒙藥材組成[4]。其可改善血液濃度，疏通經(jīng)絡，修復陳舊組織的神經(jīng)血管損傷[5]，具有清熱安神、舒筋活絡、去黃水、化痰活血、醒腦開竅、消瘀止痛、扶正固本之功效[6-7]。額爾敦-烏日勒是蒙醫(yī)治療白脈病、腦出血、腦血栓、神經(jīng)損傷、神經(jīng)根炎等疾病的首選藥物[8-9]，在臨床上應用廣泛。如額爾敦-烏日勒與奧拉西坦聯(lián)合治療血管性癡呆效果顯著[10]；額爾敦-烏日勒結(jié)合西醫(yī)治療老年2型糖尿病合并高血壓有明顯療效[11-12]；額爾敦-烏日勒在腦出血治療中有顯著的增益作用[13-15]，可促進微血管增生，保護和改善受損神經(jīng)功能，改善腦缺血及腦梗死[16-18]；額爾敦-烏日勒還可有效預防和治療神經(jīng)源炎性痛敏性偏頭痛[19]，但有關其活性成分和作用機理研究相當缺乏。已報道的神經(jīng)保護活性成分有紅花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、梔子、土木香、木香、蓽茇和黑種草所含16種小分子化合物[20]，但其作用機理尚不明確。揭示其藥效作用機理，明確其入血成分是首要條件。

本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）鑒定額爾敦-烏日勒大鼠灌胃給藥后的入血成分，并分析差異代謝物及相關通路，旨在為明確額爾敦-烏日勒的活性成分及作用機理提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠6只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。大鼠購回后，第一時間按雌雄分開飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院標準動物實驗房。飼養(yǎng)條件：室溫（23±3）℃，相對濕度為40%～60%，明暗周期12 h，大鼠自由攝取動物飼料和飲用純凈水，隔1 d換清潔級墊料。本研究所有程序都是在實驗動物的指導原則下進行的，并得到內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院倫理委員會的批準（批準號：2022-004）。

1.2 藥物與試劑 額爾敦-烏日勒（批號：20190828，規(guī)格：60丸/盒）由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心提供；LC-MS級甲醇（批號：A456-4）、LC-MS級甲酸（批號：A117-50）、色譜級醋酸銨（批號：A114-50）均購于美國Thermo Fisher公司；LC-MS級水（批號：1.15333.2500）購于美國Merck公司。

1.3 主要儀器 Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀（德國賽默飛世爾公司）；Vanquish UHPLC色譜儀（德國賽默飛世爾公司）；Hypesil Gold column色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）（德國賽默飛世爾公司）；D3024R低溫離心機（美國賽洛捷克公司）。

2 方法

2.1 分組和給藥 將6只SD大鼠隨機分為空白組（KB）和給藥組（ED），每組3只。將大鼠適應性飼養(yǎng)14 d后禁食、不禁水12 h，給藥組大鼠按0.54 g/kg劑量灌胃給予額爾敦-烏日勒，空白組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為1 mL/100 g。給藥90 min后腹主動脈采血，血液收集在普通采血管中，于室溫靜置1 h進行凝固分層，于室溫下1 610×g離心10 min，取上清液分裝到1.5 mL離心管中，用于后續(xù)實驗。

2.2 樣本處理 取100 μL血清樣本置于離心管中，加入400 μL質(zhì)譜級甲醇，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，于4 ℃條件下15 000×g，離心10 min，取一定量的上清液加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中再次于4 ℃條件下，以15 000×g，離心10 min，收集上清液，進行LC-MS分析。

2.3 儀器參數(shù)

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Hyperil Gold column（C18）（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為10 μL；正模式：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇；負模式：流動相A為5 mmol/L醋酸銨，流動相B為甲醇[21]。色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件 掃描范圍選擇（m/z）100～1 500；ESI源的設置如下：噴霧電壓為3 200 V；鞘氣流速為40 arb；輔助氣流速為10 arb；離子傳輸管溫度為320 ℃。極性為正極、負極；MS/MS二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。

2.4 數(shù)據(jù)處理 將LC-MS原始數(shù)據(jù)導入Compound Discoverer3.1（CD3.1,Thermo Fisher）搜庫軟件中，進行保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡單篩選，然后對不同樣品根據(jù)保留時間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm進行峰對齊，使鑒定更準確，隨后根據(jù)設置的質(zhì)量偏差為5 ppm、信號強度偏差為30%、信噪比為3、最小信號強度為100 000、加合離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量，再整合目標離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進行比對，用blank樣本去除背景離子，并對定量結(jié)果進行歸一化，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）和脂質(zhì)代謝途徑研究計劃（Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS）數(shù)據(jù)庫對定量結(jié)果進行分類注釋分析。差異代謝產(chǎn)物篩選基于給藥組與空白組比較，以P＜0.05，且log2FC＞0（log2FC＞0為上調(diào)、log2FC＜0為下調(diào)）為篩選條件納入差異有統(tǒng)計學意義的代謝產(chǎn)物。相關差異代謝通路圖通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行搜索和分析。代謝途徑分析使用MetaboAnalyst 5.0。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料服從正態(tài)分布，采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 為了對實驗數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，取所有大鼠個體的血清樣品少量，等體積混合均勻后制得質(zhì)控（quality control，QC）樣本，用于平衡LC-MS系統(tǒng)和監(jiān)測儀器狀態(tài)。通過QC樣品的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性評估儀器狀態(tài)，方法及數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)果正、負離子模式下的R2均大于0.98接近于1，說明數(shù)據(jù)具有良好的可靠性。（見圖1）

圖1 QC 樣本相關性分析

3.2 小分子化合物的非靶向分析 對空白組與給藥組血液成分分別在Compound Discoverer 3.1進行分子式預測并對mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫同時進行搜庫，鑒定到777個小分子化合物。在正離子模式下，給藥組與空白組大鼠血清中共檢測到491小分子化合物；在負離子模式下，給藥組與空白組血清中共檢測到286個小分子化合物。將上述777個小分子化合物在HMDB數(shù)據(jù)庫中進行搜索，共發(fā)現(xiàn)297個小分子化合物，其中正離子模式下178個、負離子模式下119個?？梢娬撾x子模式下，脂類及非脂類化合物最多。（見圖2）

圖2 HMDB 分類注釋統(tǒng)計圖

基于LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫共鑒定出186個小分子化合物，其中正離子模式下鑒定出78個小分子化合物，負離子模式下鑒定出108個小分子化合物。在HMDB和LIPID MAPS兩個數(shù)據(jù)庫中同時鑒定到的有73個小分子化合物，其中正離子模式下有37個，負離子模式下有36個，可見甘油磷酰膽堿化合物最多。（見圖3）

圖3 LIPID MAPS 分類注釋統(tǒng)計圖

3.3 差異代謝產(chǎn)物的分析 相對含量分析結(jié)果顯示，給藥組與空白組大鼠血清有67個代謝物具有明顯差異，即給藥組有55個代謝物上調(diào)，12個代謝物下調(diào)。（見表2）由圖4可知，上述67個差異代謝物中大部分化合物的相對含量升高，少數(shù)化合物的相對含量降低，差異明顯。（見圖4）

圖4 給藥組與空白組大鼠差異代謝物熱圖

表2 給藥組與空白組大鼠血清差異代謝物（排名前10）

3.4 差異代謝物通路分析 對額爾敦-烏日勒給藥組和空白組篩選的67個差異代謝物進行進一步的KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物共參與11條通路，分別是核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、甾類激素生物合成代謝（Steroid hormone biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、視黃醇的代謝（Retinol metabolism）、檸檬酸循環(huán)代謝（Citrate cycle，TCA cycle）、藥物代謝-細胞色素P450（Drug metabolismcytochrome P450）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（Glycine, serine and threonine metabolism）、不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism），其中富集最多的是核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環(huán)代謝、乙醛酸和二羧酸代謝。（見圖5）

圖5 給藥組與空白組大鼠差異代謝物KEGG 通路富集圖

3.5 額爾敦-烏日勒入血成分的分析 通過對空白組與給藥組血液成分進行單獨搜庫分析對比，結(jié)果顯示給藥組血清中鑒定出入血成分共237個小分子化合物，正離子模式下152個，負離子模式下85個。其中，51個是額爾敦-烏日勒原型成分（展示20個成分），如肉豆蔻酸、牛黃熊去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、雄酮、沒食子酸酯、甘草次酸等，其余186個是額爾敦-烏日勒復方中沉香、牛黃、麝香、丁香、甘草等單藥所含成分產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。（見圖6、表3）

圖6 給藥組大鼠血清中檢測到的小分子化合物分類

表3 額爾敦-烏日勒入血原型成分

4 討論

蒙藥額爾敦-烏日勒是預防和治療心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用藥物，并具有神經(jīng)保護作用，療效顯著。目前，關于額爾敦-烏日勒的有效成分、作用機制及入血成分仍不明確。本研究基于LC-MS非靶向代謝組學方法分析了額爾敦-烏日勒入血成分及潛在作用機制，發(fā)現(xiàn)額爾敦-烏日勒給藥后可對多個代謝通路進行干預和調(diào)整，如核黃素、膽堿、乙酰膽堿、睪酮等對機體有益的差異代謝物含量升高，給藥后的差異代謝物主要富集于核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環(huán)代謝和乙醛酸和二羧酸代謝等代謝通路。

核黃素又稱維生素B2，是體內(nèi)黃酶類輔基的重要組成部分[22]。核黃素因其抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等特性而被廣泛研究[23]。有研究表明，核黃素可以預防偏頭痛，減輕局灶性腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用，具有良好的神經(jīng)保護作用[24-26]。此外，核黃素與其他化合物或藥物的組合可以具有多種作用和保護特性，并在治療中可以減少藥物的毒性作用[23]。本研究結(jié)果表明額爾敦-烏日勒對體內(nèi)核黃素代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。而這一作用可能與其神經(jīng)保護作用密切相關。

其次是甘油磷脂代謝，該代謝的紊亂可引起炎癥反應，導致神經(jīng)元不可逆的損傷。膽堿和乙酰膽堿是甘油磷脂代謝的2個內(nèi)源性化合物。人的腦組織有大量乙酰膽堿，這是一種重要的中樞膽堿神經(jīng)遞質(zhì)，能維持膽堿能系統(tǒng)正常運行和長期記憶的生理基礎，起著神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的作用[27]。但乙酰膽堿的含量會隨著人年齡的增長而下降。膽堿是合成乙酰膽堿的前體之一。有研究報道，提高神經(jīng)突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平，能夠增強神經(jīng)突觸傳遞效果，改善阿爾茨海默病患者的認知障礙[28-29]。

此外，甾體激素，雄激素和雌激素對認知功能具有重要的影響，可促進學習記憶等認知功能，并降低淀粉樣蛋白在人腦的聚集，可調(diào)節(jié)海馬未成熟神經(jīng)元的數(shù)量及海馬棘突觸密度，對腦功能具有保護作用[29-30]。檸檬酸循環(huán)是糖類、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝和能量代謝的樞紐，乙醛酸和二羧酸代謝可看作檸檬酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補給途徑[31-32]。這些途徑直接或間接參與體內(nèi)氧化還原反應和能量代謝等調(diào)節(jié)?？梢婎~爾敦-烏日勒可對多個代謝通路同時參與和調(diào)節(jié)，在多個靶點發(fā)揮藥效。本研究結(jié)果表明，額爾敦-烏日勒可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物的平衡，發(fā)揮調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原平衡及能量代謝的作用。

5 結(jié)論

本研究采用LC-MS非靶向代謝組學方法在額爾敦-烏日勒給藥血清中共鑒定出777個小分子化合物，67個差異代謝物。差異代謝物主要富集在核黃素代謝、檸檬酸循環(huán)代謝、甘油磷脂代謝等11個相關代謝通路。同時，額爾敦-烏日勒的入血成分有237個，其中代謝產(chǎn)物有186個、入血原型成分有51個。結(jié)果可為蒙藥額爾敦-烏日勒的質(zhì)量控制、潛在活性成分的篩選及作用機理的研究提供重要依據(jù)。