李穎,王長(zhǎng)遠(yuǎn)
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)
小米屬于我國(guó)主要糧食作物之一,被譽(yù)為“五谷之首”,具有高產(chǎn)、高抗逆性、適口性好等特點(diǎn)[1]。小米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,富含蛋白質(zhì)、淀粉、礦物質(zhì)、多酚及維生素[2-3],具有調(diào)理腸胃、降血壓等生理功能[4],深受消費(fèi)者的青睞。小米谷糠是小米加工中的副產(chǎn)物,含量約占10%[5],含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分[6]。目前,已有研究證明從小米谷糠中提取的功能成分可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[7-8]。但其附加值的持續(xù)性開(kāi)發(fā)和功能性的開(kāi)發(fā),尤其在食品領(lǐng)域產(chǎn)品的應(yīng)用仍處于起步階段。
人體如果常年處于亞健康狀態(tài),則會(huì)造成人體免疫力低下并引起各種疾病。免疫力低下的主要原因?yàn)闄C(jī)體氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基等強(qiáng)氧化性有害物質(zhì)摧毀細(xì)胞膜,使細(xì)胞不能吸收外界營(yíng)養(yǎng)成分,并喪失對(duì)細(xì)菌、病毒的抵御能力,因此引起疾病[9-10]。尋找一種抗氧化營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑清除機(jī)體自由基,增加機(jī)體免疫力,改善人體亞健康狀態(tài)為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)。
天然多糖因其低毒性等生物活性被廣泛用于功能食品或制藥原料,在降血糖、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等臨床治療中發(fā)揮重要作用[11-14]。葡萄糖、阿拉伯木聚糖等單糖是小米谷糠多糖的主要成分,研究證實(shí)小米糠水溶性非淀粉多糖中包含的多酚、黃酮物質(zhì),可清除自由基、改善腸道環(huán)境[7,15],但關(guān)于小米多糖抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力的相關(guān)研究鮮有報(bào)道,并且其在天然多糖活性物質(zhì)用于調(diào)控巨噬細(xì)胞活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促使免疫系統(tǒng)高效應(yīng)答領(lǐng)域的相關(guān)研究仍處于基礎(chǔ)階段。本試驗(yàn)以小米谷糠多糖為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)小米谷糠多糖的分離純化,并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證小米谷糠多糖的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)能力,以期為小米谷糠多糖的高值開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考。
紅谷小米谷糠:黑龍江省大慶市肇州托古小米廠;WST-1 試劑:北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司;1,1-二苯基-2 - 三硝基苯肼(1,1 -diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine,DPPH)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA) 試劑盒、腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6):南京建成生物工程研究所;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)、胎牛血清(fetal calf serum,F(xiàn)BS)、RPMI-1640 培養(yǎng)基、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS):青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;抗體:北京天根生化科技有限公司;RAW246.7細(xì)胞:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);抗壞血酸、α-淀粉酶(5 U/mg)、葡萄糖淀粉酶(2×104U/mL)、蛋白酶(1 500 U/mg)、Griess 試劑、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]:上海源葉生物科技有限公司;DEAE-52 纖維素層析柱:北京百奧萊博科技有限公司;總RNA 抽提試劑(total RNA extraction reagent,Trizol)試劑:上海麥克林生化科技有限公司。
AR2140 型分析天平、BIO-RAD 550 型微孔板檢測(cè)器:瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL16B 型臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;DGG-9053A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;MJ-10A 型磨粉機(jī):上海市浦恒信息科技有限公司;SP-2000UV 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;D9000型96 孔熒光定量PCR 儀:蘇州北科震澤生物科技有限公司;CLM-170B-8-NF 型二氧化碳培養(yǎng)箱:新加坡ESCO 公司。
1.3.1 小米谷糠多糖的提取、分離與純化
1.3.1.1 小米谷糠多糖的提取
參考文獻(xiàn)[14]和[16],利用水提醇沉的方法進(jìn)行小米谷糠多糖的提取。將采集后的小米谷糠干燥、粉碎、過(guò)篩(80 目),稱取200 g 的小米谷糠粉,100 ℃熱水浸提1 h 后[料液比1∶10(g/mL)],3 000 r/min 離心15 min,收集上清液;雙酶法去除淀粉和蛋白質(zhì)(α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶);滅酶離心后,加入4 倍體積的85%乙醇,醇析溶液在室溫(28±2)℃條件下于攪拌器上攪拌過(guò)夜,8 000 r/min 離心10 min,收集沉淀后用95%濃度乙醇洗滌,真空濃縮后,40 ℃進(jìn)行干燥,得到沉淀為小米谷糠多糖(millet polysaccharide,MP)。
1.3.1.2 小米谷糠多糖的分離純化
稱取200 mg MP,溶于10 mL 蒸餾水中,以0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl 為洗脫液,經(jīng)DEAE-52 纖維素層析分離純化得到兩種小米谷糠多糖組分MP-1 和MP-2。
1.3.1.3 小米谷糠多糖含量的測(cè)定
將提取的小米谷糠多糖溶于1 mL 水中,采用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖含量[17]。以葡萄糖為標(biāo)品,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,最后得到的擬合線性回歸方程為Y=0.014 8X-0.003 6,決定系數(shù)r2=0.998 9,按照如下公式計(jì)算小米谷糠多糖含量(W,mg/g)。
式中:C 為提取液中多糖含量,mg/mL;D 為稀釋倍數(shù);V 為定容總體積,mL;m 為小米谷糠質(zhì)量,g。
1.3.1.4 洗脫蛋白含量
以胎牛血清蛋白為標(biāo)品,蛋白質(zhì)含量采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定[18]。以K2SO4為標(biāo)品,使用0.5 mol/L HCl 水解小米谷糠粗多糖后,通過(guò)BaCl2-明膠法測(cè)定硫酸鹽含量[19]。
1.3.2 小米谷糠多糖分子量的測(cè)定
小米谷糠多糖的相對(duì)分子量采用體積排阻色譜-示差檢測(cè)器-激光光散射聯(lián)用技術(shù)(size-exclusion chromatography-differential refractive index-multi-angle laser light scattering,SEC-RI-MALLS)檢測(cè),采用Aglient PL aquagel-OH 凝膠色譜柱,0.2 mol/L 醋酸銨作為流動(dòng)相,柱溫控制在30 ℃,每次進(jìn)樣量為20 μL,洗脫液流速為0.7 mL/min[20]。
1.3.3 小米谷糠多糖體外抗氧化活性分析
1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定
參考Abu Bakar 等[21]的方法,分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖(MP、MP-1 和MP-2) 和VC溶液各1 mL,加入至2 mL 2×10-4mol/L DPPH 標(biāo)準(zhǔn)液和無(wú)水乙醇溶液中,避光靜置30 min,在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下。
式中:X 為DPPH 自由基清除率,%;Am為樣品吸光度;AT為對(duì)照吸光度;A0為空白吸光度。
1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定
參考王蘭英等[22]的方法,分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL小米谷糠多糖(MP、MP-1 和MP-2)和VC溶液各1 mL,加入至3 mL ABTS 溶液和無(wú)水乙醇溶液中,黑暗條件下放置1 h,測(cè)定734 nm 處的吸光度。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。
式中:Y 為ABTS+自由基清除率,%;Am為樣品吸光度;A0為空白吸光度。
1.3.3.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定
參照李蘭[1]的方法,分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖(MP、MP-1 和MP-2)和VC溶液各1 mL,加入到反應(yīng)體系(6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2)中,在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,乙醇代替樣品做空白組,于510 nm 處測(cè)定吸光度。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。
式中:Z 為羥基自由基清除率,%;Am為樣品吸光度;A0為空白吸光度。
1.3.3.4 總抗氧化能力的測(cè)定
小米谷糠多糖的總抗氧化能力測(cè)定采用T-AOC檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖(MP、MP-1 和MP-2)和VC溶液各1 mL,操作方法嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行測(cè)定。
1.3.4 小米谷糠多糖免疫活性能力測(cè)定
1.3.4.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)
巨噬細(xì)胞RAW246.7 培養(yǎng)于添加了10% FBS 的RPMI 培養(yǎng)基中,在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[23]。
1.3.4.2 小米谷糠多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 的影響
RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板(1×106/mL)中,并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,去除培養(yǎng)基加入200 μL含有不同濃度(25、50、100 μg/mL) 的小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2 和LPS(1 μg/mL)的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育24 h 后,吸取上清液,分別使用Griess 試劑和MTT 試劑測(cè)定細(xì)胞NO 產(chǎn)量和細(xì)胞增殖情況[24-25],在550 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。
1.3.4.3 RAW264.7 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的定量分析
分別用小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2(25、50、100 μg/mL)和LPS(1 μg/mL)處理RAW264.7 細(xì)胞(1×106/mL)24 h。使用Trizol 試劑提取總RNA,測(cè)定RNA濃度后使用oligo -dT20 引物和Superscript III RT Takara 構(gòu)建cDNA。β-actin 用作內(nèi)標(biāo),所用引物詳情見(jiàn)表1。TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌量采用ELISA 試劑盒測(cè)定。
表1 實(shí)時(shí)定量PCR 分析中使用引物信息Table 1 Primer information used in RT-PCR
1.3.4.4 小米谷糠多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞特異性受體的影響
RAW264.7 細(xì)胞(1×106個(gè)/mL) 通過(guò)TLR4、TLR2或CR3 單克隆抗體(10 μg/mL)預(yù)培養(yǎng)2 h,然后通過(guò)MP-1(100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL)刺激RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO,其NO 檢測(cè)方法同1.3.5.2。
采用Excel 2017、SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用Origin 軟件進(jìn)行繪圖處理,每次試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
小米谷糠多糖梯度洗脫結(jié)果見(jiàn)圖1,多糖含量和化學(xué)成分見(jiàn)表2。
圖1 小米谷糠多糖梯度洗脫Fig.1 Elution gradient for millet bran polysaccharide
表2 小米谷糠多糖化學(xué)成分分析Table 2 Chemical composition of millet bran polysaccharide%
如圖1 所示,經(jīng)過(guò)凝膠柱洗脫后的小米谷糠多糖,洗脫峰較為單一且對(duì)稱。小米谷糠經(jīng)過(guò)水提醇沉后得到小米谷糠多糖,其含量為11.27%,且主要含有59.78% 多 糖、12.58% 蛋白質(zhì)及少量硫酸鹽。經(jīng)過(guò)DEAE-52 纖維素層析分離純化得到兩個(gè)組分MP-1(蒸餾水洗脫)和MP-2(0.5 mol/L NaCl 洗脫),含量分別是53.14%和41.29%,由表2 可知各純化組分主要由多糖(78.58%和45.78%)、蛋白質(zhì)(9.78%和7.63%)和少量硫酸鹽(7.42%和8.47%)組成。以上結(jié)果表明,小米谷糠多糖MP 為硫酸化多糖,且經(jīng)過(guò)分離純化后得到化學(xué)成分比例有所不同。
對(duì)純化后小米谷糠多糖各組分的分子量進(jìn)行檢測(cè),組分的分子量分布如圖2 和表3 所示。
圖2 小米谷糠多糖分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of millet bran polysaccharide
表3 小米谷糠多糖分子量Table 3 Molecular weight of millet bran polysaccharide
由圖2 和表3 可知,MP、MP-1 和MP-2 的分子量分別為16.4、14.1、13.9 kDa,多糖保留時(shí)間約為50 min,其中小米谷糠多糖MP 具有較高的分子量,而純化后的小米谷糠多糖MP-1 和MP-2 分子量逐漸降低。這可能是因?yàn)榧兓チ瞬糠址嵌嗵穷惖男》肿游镔|(zhì),從而降低MP-1 和MP-2 多糖的分子量[26-27]。
機(jī)體在進(jìn)行一系列的生命活動(dòng)時(shí),不可避免會(huì)產(chǎn)生自由基,對(duì)人體造成嚴(yán)重的氧化損傷,威脅機(jī)體健康。因此機(jī)體需要大量能抵抗自由基的抗氧化物質(zhì),消除自由基對(duì)細(xì)胞的氧化攻擊[28]。本試驗(yàn)采用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小米谷糠多糖的自由基清除能力及總抗氧能力的影響。小米谷糠多糖的體外抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 小米谷糠多糖體外抗氧化活性分析Fig.3 Antioxidant activity of millet bran polysaccharide in vitro
由圖3 可知,在小米谷糠多糖濃度為0.5~2.5 mg/mL時(shí),DPPH 自由基清除率呈上升趨勢(shì),且當(dāng)濃度為2.5 mg/mL 時(shí),MP-1 中DPPH 自由基清除率高達(dá)63.45%。與對(duì)照組相比,小米谷糠多糖中ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率的變化趨勢(shì)同DPPH 自由基清除率變化趨勢(shì)一致,MP-1 的自由基清除能力最強(qiáng),最高清除率分別為64.12%和54.26%。機(jī)體對(duì)外界的防御能力與抗氧化能力有關(guān),并與人體健康存在密切的聯(lián)系,因此檢測(cè)小米谷糠多糖的總抗氧化能力可以代表小米多糖的抗氧化能力的強(qiáng)弱[29-30]。由總抗氧化能力結(jié)果可知小米谷糠多糖的抗氧化活性呈劑量依賴性,當(dāng)多糖濃度在2.5 mg/mL 時(shí),MP-1 的抗氧化能力優(yōu)于MP-2 和MP。因此,MP-1 具有較好的抗氧化活性。
免疫系統(tǒng)主要通過(guò)識(shí)別和消滅外來(lái)有害物質(zhì)來(lái)預(yù)防各種疾病的發(fā)生,因此免疫系統(tǒng)對(duì)機(jī)體健康起到至關(guān)重要的作用[31]。本研究采用RAW264.7 巨噬細(xì)胞來(lái)驗(yàn)證小米谷糠多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。NO 作為一種重要的炎癥因子,可由經(jīng)多糖等物質(zhì)刺激活化后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,具有殺死腫瘤細(xì)胞和致病微生物等作用[32],因此NO 可以作為小米谷糠多糖對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)效果的重要指標(biāo)。RAW264.7 細(xì)胞NO 產(chǎn)量及細(xì)胞增殖見(jiàn)圖4。
圖4 RAW264.7 細(xì)胞NO 產(chǎn)量及細(xì)胞增殖Fig.4 NO production and proliferation of RAW264.7 cells
由圖4 可知,濃度為25~100 μg/mL 的小米谷糠多糖及其純化組分均能顯著刺激RAW264.7 細(xì)胞NO 的產(chǎn)生,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,其中相同藥物計(jì)量濃度下,MP-1 的NO 產(chǎn)量高于MP 和MP-2,且當(dāng)小米谷糠多糖MP-1 濃度為100 μg/mL 時(shí),NO 產(chǎn)量與LPS(1 μg/mL)刺激得到的NO 產(chǎn)量相近。而通過(guò)RAW264.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,與RPMI 對(duì)照組相比,小米谷糠多糖及其純化組分均對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用,并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果,由此說(shuō)明小米谷糠多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的效果,其中MP-1 效果最顯著。
研究表明調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的NO 主要由3 種形式的一氧化碳合成酶(carbon monoxide synthetase,NOS)產(chǎn)生,其中誘導(dǎo)型一氧化碳合成酶(inducible carbon monoxide synthetase,iNOS)為其中的主要形式,其能夠在癌癥治療、腫瘤細(xì)胞凋亡及活菌抑制中大量產(chǎn)生[24]。因此本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR 技術(shù)來(lái)驗(yàn)證NO 產(chǎn)量最高的小米谷糠多糖純化組分MP-1 對(duì)iNOS mRNA 的相對(duì)表達(dá)量的影響,結(jié)果如圖5 所示。
圖5 RAW264.7 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of mRNA expression in RAW264.7 cells
由圖5 可知,隨著MP-1 濃度的增加,RT-PCR 電泳檢查得到的iNOS mRNA 表達(dá)水平隨之增加,但與LPS 存在一定差異。表明iNOS 能夠促進(jìn)NO 的產(chǎn)生,從而驗(yàn)證MP-1 對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的激活作用。通過(guò)檢測(cè)促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 的基因表達(dá)量,結(jié)果表明熒光條帶的強(qiáng)度隨著多糖濃度的增加而增加,而相關(guān)研究表明炎癥因子的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副作用,而IL-10炎癥因子能夠激活反饋抑制作用,其顯著的熒光強(qiáng)度表明IL-10 能夠進(jìn)行反向調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生[33]。綜上,小米谷糠多糖MP-1 能夠激活巨噬細(xì)胞進(jìn)而正向調(diào)節(jié)其免疫活性。
研究表明巨噬細(xì)胞會(huì)通過(guò)其細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別病原體并發(fā)揮免疫作用,因此多糖等刺激物需要與相關(guān)受體特異性結(jié)合進(jìn)而刺激免疫細(xì)胞活化從而產(chǎn)生促炎因子[34]。因此本試驗(yàn)在確定MP-1 能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化并正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的基礎(chǔ)上,利用TLR4、TLR2 及CR3 特異性抗體來(lái)探討RAW264.7巨噬細(xì)胞與MP-1 谷糠多糖分子的相互作用機(jī)制,結(jié)果如圖6 所示。
圖6 RAW264.7 細(xì)胞特異性受體的分析Fig.6 Specific receptor of RAW264.7 cells
由圖6 可知, 在TLR4 抗體的存在情況下,RAW264.7 的NO 產(chǎn)量顯著降低并與MP-1 單獨(dú)存在條件下的NO 產(chǎn)量存在顯著差異,但TLR2 及CR3 抗體對(duì)于MP-1 激活RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 的抑制效果不顯著,因此可以得出MP-1 多糖與巨噬細(xì)胞的相互作用的主要受體為TLR4。
本試驗(yàn)通過(guò)水提醇沉法得到小米谷糠多糖MP 并經(jīng)過(guò)分離純化得到兩種純化多糖(MP-1 和MP-2),分子量分別為16.4、14.1 kDa 和13.9 kDa,其中MP-1 的多糖得率和含量最高,分別為53.14%和78.58%。通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)證明,小米谷糠多糖具有較強(qiáng)的DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS+自由基清除率,有望作為一種潛在的天然、易得的抗氧化劑資源。此外,小米谷糠多糖可通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞釋放NO 和細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β),進(jìn)而增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性而且對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無(wú)毒性,其中MP-1 具有顯著促進(jìn)NO產(chǎn)生及細(xì)胞增殖的能力,從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力。因此,小米谷糠多糖可以作為新型的抗氧化及免疫調(diào)劑補(bǔ)充劑用于功能性食品的生產(chǎn)和加工。