沙芥乳酸菌發(fā)酵飲料的工藝優(yōu)化

馬程，烏云達(dá)來(lái)，王莉梅，康連和，李星云，白烏日力嘎，閆小杰

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.呼和浩特民族學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

沙芥[Pugionium cornutum（L.）Gacrtn.]，十字花科植物，又名沙蘿卜、沙蓋，二年生植物。蒙藥中沙芥以根入藥，莖葉無(wú)明確利用方式，但是沙芥莖葉占總株比例較大，占全株的2/3，莖葉一年可多次刈割，產(chǎn)量大，成本低。隨著內(nèi)蒙古地區(qū)蒙藥植物種植規(guī)?；l(fā)展，對(duì)莖葉的利用不足不僅會(huì)導(dǎo)致其生物活性資源浪費(fèi)，還會(huì)降低當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民種植沙芥的積極性。沙芥防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，能改善當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)，被稱作“沙漠英雄”。

沙芥具有鎮(zhèn)痛止咳、消食解毒、提高機(jī)體免疫力等功效[1-3]，被廣泛應(yīng)用于蒙藥中。沙芥具有很高的價(jià)值[4-5]，既可以當(dāng)做日常食品來(lái)食用，也可以作為中藥材達(dá)到防病治病的目的，是沙區(qū)牧民的重要蔬菜之一。沙芥不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有黃酮、生物堿、甾醇等化學(xué)物質(zhì)[6-8]，多數(shù)在草原地帶與沙區(qū)地帶生長(zhǎng)[9]。內(nèi)蒙古沙漠戈壁地區(qū)分布較多，少水多干旱、植被覆蓋較少、不適宜居住和畜牧，在沙漠中少有植物生長(zhǎng)，而沙芥屬于其中分布最廣的植物之一[10]。

益生菌是一種能改善和增強(qiáng)人體腸道菌群平衡的活性微生物，對(duì)人體整體健康和生理機(jī)制的發(fā)展具有良好的影響和促進(jìn)作用[11]。使用益生菌等生物發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)和多功能發(fā)酵果蔬汁飲料，不僅可以延長(zhǎng)果蔬汁的保質(zhì)期還能抑制其他真菌的生長(zhǎng)，也能使飲料獲得更好的發(fā)酵風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]。同時(shí)，利用益生菌乳酸菌微生物發(fā)酵技術(shù)，不僅可以優(yōu)化果蔬汁的風(fēng)味，還具有改良果蔬汁風(fēng)味[13-16]、促進(jìn)人體消化系統(tǒng)健康、提高果蔬汁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[17-20]。本文利用3 種乳酸菌發(fā)酵沙芥，改善沙芥辛辣的口味，以期為沙芥生產(chǎn)加工提供思路以及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙芥：來(lái)自內(nèi)蒙古烏審旗農(nóng)牧民家；乳酸菌（植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）：保藏于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

JL-CJ-H1B 超凈工作臺(tái)：上海靳瀾儀器制造有限公司；YXQ-50A 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：翱藝儀器（上海）有限公司；XK96-A 快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙芥青汁的制備

首先挑選無(wú)病蟲(chóng)害的沙芥，用清水清洗去掉表面污垢之后，用90 ℃以上的蒸餾水漂燙5 min，起到破酶作用。將破酶的沙芥放入冷水降溫，切段后打漿榨汁，按照沙芥漿∶水=1∶4（體積比）的比例進(jìn)行稀釋后用兩層紗布過(guò)濾，獲得沙芥青汁。

1.3.2 滅菌、接種發(fā)酵

經(jīng)115 ℃滅菌15min 后的沙芥青汁，冷卻至40 ℃，在無(wú)菌條件下，接種已經(jīng)活化好的植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌3 種菌種，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)酵后于4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 復(fù)合乳酸菌組成比例確定

將制備好且傳代至少3 代，活化后的3 種菌。植物乳桿菌（記為a 菌）、嗜熱鏈球菌（記為b 菌）、保加利亞乳桿菌（記為c 菌）按照2%的接種量分別接種到液體MRS 培養(yǎng)基中，每隔2 h，測(cè)定3 種菌的OD 值、酸度以及活菌數(shù)，以1%～7%的接種量分別接入到沙芥汁中，36 ℃條件下，培養(yǎng)16 h，測(cè)定活菌數(shù)與酸度，研究不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響。根據(jù)單菌發(fā)酵結(jié)果，以活菌數(shù)為主要指標(biāo)，酸度為次要指標(biāo)，得出最佳的菌株添加量，以最佳條件相鄰兩水平進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，通過(guò)正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)與酸度，以此得到沙芥汁發(fā)酵的最佳乳酸菌添加比例。

1.3.4 工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取適量沙芥青汁于錐形瓶，60 ℃殺菌30 min 后放置至室溫，以沙芥青汁發(fā)酵液中的活菌數(shù)與酸度作為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。單因素條件包括復(fù)合乳酸菌接種量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，發(fā)酵溫度33、36、39、42、45 ℃，發(fā)酵時(shí)間0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，蔗糖添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、復(fù)合接種量為考察因素，以酸度和活菌數(shù)為指標(biāo)，采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究沙芥汁發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)上述最佳工藝條件制備沙芥乳酸菌發(fā)酵飲料，進(jìn)行成品品質(zhì)測(cè)定。選擇10 位農(nóng)科院研發(fā)專員，其中5名男性，5 名女性，年齡為25～45 歲，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 沙芥乳酸菌發(fā)酵飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard for fermented beverages made of Pugionium cornutum lactic acid bacteria

1.4 數(shù)據(jù)處理

將每次試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以平均值表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵菌配比

2.1.1 3 種菌的生長(zhǎng)曲線

不同發(fā)酵時(shí)間條件下3 種菌菌濃度的變化情況見(jiàn)圖1。不同發(fā)酵時(shí)間條件下3 種菌活菌數(shù)的變化情況見(jiàn)圖2。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間3 種菌菌濃度的變化Fig.1 Changes in the concentrations of three kinds of bacteria at different time

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間3 種菌活菌數(shù)的變化Fig.2 Changes in the viable bacteria counts of three kinds of bacteria at different time

由圖1～圖2 可知，3 種菌符合微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。通過(guò)對(duì)3 種菌OD 值以及菌濃度的分析，明確了3 種菌在不同時(shí)期的不同發(fā)酵特性，3 種菌在16 h 時(shí)均處于穩(wěn)定期，初步可以擬定穩(wěn)定的發(fā)酵時(shí)間為16 h。b 菌OD 值在12 h 后基本趨于穩(wěn)定，但是活菌數(shù)在相同發(fā)酵時(shí)間卻呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明菌濃度雖然小幅度增大或者基本不變，但其中一部分菌已經(jīng)失去活性，導(dǎo)致活菌數(shù)呈下降的趨勢(shì)。

不同發(fā)酵時(shí)間條件下3 種菌pH 值與酸度的變化見(jiàn)圖3～圖4。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間3 種菌pH 值的變化Fig.3 Changes of pH of three kinds of bacteria at different time

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間3 種菌酸度的變化Fig.4 Changes of acidity of three kinds of bacteria at different time

由圖3 和圖4 可知，可以看出3 種菌pH 值與酸度變化的趨勢(shì)整體相似，隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，酸度上升，上升到一定程度后保持穩(wěn)定。且a 菌和c 菌在培養(yǎng)液為發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，發(fā)酵能力均高于b 菌。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，3 種菌在發(fā)酵時(shí)間14～18 h 內(nèi)產(chǎn)酸能力，活菌數(shù)較高，說(shuō)明這個(gè)發(fā)酵時(shí)間段內(nèi)，a、b、c 3 種菌的發(fā)酵能力較強(qiáng)。

2.1.2 單菌不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響

將活化后的3 種乳酸菌在無(wú)菌條件下以不同接種量（1%～7%）接種到沙芥青汁中，發(fā)酵溫度36 ℃于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，測(cè)定活菌數(shù)與酸度，結(jié)果如圖5 所示。

一般條件下，益生菌活菌數(shù)越多，發(fā)酵能力越強(qiáng)。適量地增加接種量會(huì)加快乳酸菌的生長(zhǎng)，節(jié)省發(fā)酵時(shí)間，但是當(dāng)接種量過(guò)大，又會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致活菌數(shù)數(shù)量下降。由圖5 可知，當(dāng)3 種菌在接種量為3%～5%時(shí)，活菌數(shù)和酸度表現(xiàn)較好。選取接種量3%、4%、5%3 個(gè)水平參加正交試驗(yàn)，從而確定3 種菌復(fù)合的比例。

2.1.3 復(fù)合菌發(fā)酵試驗(yàn)

2.1.3.1 復(fù)合乳酸菌接種比例的確定

復(fù)合乳酸菌接種比例的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2 所示。

表2 復(fù)合乳酸菌接種比例的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results of the inoculation ratio of composite lactic acid bacteria

由表2 可知，以活菌數(shù)為指標(biāo)時(shí)，3 種乳酸菌對(duì)于沙芥汁發(fā)酵的影響大小分別為a＞b＞c，即影響活菌數(shù)的主要因素為a 菌，其次是b 菌和c 菌，3 種菌復(fù)合的最佳比例為a1b1c1，從另一輔助指標(biāo)酸度來(lái)看，根據(jù)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析，3 種乳酸菌對(duì)于酸度的影響大小分別為c＞b＞a，即影響酸度的主要因素為c 菌，其他次要因素為b 菌和a 菌，綜合分析，選取3 種菌復(fù)合的比例a2b3c1為最佳。

根據(jù)人體胃酸環(huán)境要求，選取3 個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 3 Validation experiment

根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，根據(jù)試驗(yàn)主要指標(biāo)為活菌數(shù)來(lái)看，a2b2c1活菌數(shù)最高，且酸度最高。因此3 種菌復(fù)合的最佳比例確定為a 菌∶b 菌∶c 菌=4∶4∶3（質(zhì)量比）。

2.1.3.2 復(fù)合乳酸菌接種量的確定

復(fù)合菌接種量對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)合菌接種量對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響Fig.6 Effect of compound bacteria inoculation amount on the number of viable bacteria and acidity

由圖6 可知，不同接種量的復(fù)合乳酸菌在相同的發(fā)酵條件下，沙芥汁發(fā)酵液的活菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，在接種量達(dá)到5%時(shí)，酸度與活菌數(shù)均達(dá)到最高，此時(shí)，酸度為0.87 °T，活菌數(shù)為1.26×109CFU/mL；當(dāng)接種量為5%時(shí)，活菌數(shù)與其他組有明顯差異，酸度與其他組差異不大；當(dāng)繼續(xù)增加接種量，活菌數(shù)和酸度開(kāi)始下降，說(shuō)明當(dāng)接種量達(dá)到了一定程度，反而不利于乳酸菌的發(fā)酵，抑制了乳酸菌的發(fā)酵。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，選擇最佳條件相鄰兩水平，即復(fù)合菌接種量為4%、5%、6% 3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 沙芥青汁發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)沙芥汁發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 不同發(fā)酵溫度對(duì)對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperatures on the number of viable bacteria and acidity

適宜的發(fā)酵溫度可以促進(jìn)乳酸菌的發(fā)酵，過(guò)高或者過(guò)低的發(fā)酵溫度都會(huì)抑制乳酸菌的發(fā)酵活性。由圖7 可知，發(fā)酵溫度為33、36、39 ℃時(shí)，酸度變化不大，無(wú)明顯差異，39 ℃時(shí)，酸度達(dá)到最高，為0.79°T，活菌數(shù)隨著發(fā)酵溫度遞增而增加，39 ℃達(dá)到最高，為0.94×109CFU/mL。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)39 ℃，達(dá)到42 ℃及以上時(shí)，活菌數(shù)急速下降，說(shuō)明發(fā)酵溫度過(guò)高，抑制了乳酸菌的發(fā)酵，導(dǎo)致活菌數(shù)小于1×107CFU/mL。同樣地，酸度也有明顯下降。發(fā)酵溫度過(guò)高，不僅影響乳酸菌的發(fā)酵活菌數(shù)，也同樣影響沙芥發(fā)酵液的酸度，從而改變了乳酸菌的發(fā)酵環(huán)境，使得沙芥發(fā)酵液活菌數(shù)急劇減少。分析數(shù)據(jù)可知，33、36、39 ℃時(shí)，活菌數(shù)均大于108CFU/mL。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取33、36、39 ℃3 個(gè)發(fā)酵溫度參與后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙芥汁發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響見(jiàn)圖8。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on the number of viable bacteria and acidity

乳酸菌的發(fā)酵過(guò)程是利用原料產(chǎn)生乳酸等產(chǎn)物的過(guò)程，在不同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，沙芥汁發(fā)酵液產(chǎn)生的乳酸產(chǎn)物量不同，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，乳酸產(chǎn)物會(huì)不斷積累，從而影響沙芥青汁中乳酸菌的發(fā)酵。由圖8可知，在14、16、18 h 時(shí)，活菌數(shù)以及酸度結(jié)果較好。16 h 為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3 蔗糖添加量對(duì)沙芥發(fā)酵液的影響

不同蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵的影響圖9 所示。

圖9 不同蔗糖添加量對(duì)活菌數(shù)和酸度的影響Fig.9 Effect of different sucrose addition levels on the number of viable bacteria and acidity

由圖9 可知，以活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，隨著蔗糖添加量的增加，活菌數(shù)變化不顯著（p＞0.05），以酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)酸度變化同樣不顯著（p＞0.05）。說(shuō)明蔗糖添加量在沙芥青汁的發(fā)酵過(guò)程中對(duì)活菌數(shù)與酸度均無(wú)顯著影響，因此，在后續(xù)正交試驗(yàn)中，不考慮此因素。

2.2.4 最佳工藝正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量3 個(gè)因素，以活菌數(shù)作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，酸度作為次要評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用L9（33）正交試驗(yàn)表，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，篩選出最佳發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiments

由正交結(jié)果數(shù)據(jù)可知，以酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響的主次因素為A＞C＞B，說(shuō)明在沙芥發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液酸度影響較大，其次是菌種接種量，最優(yōu)水平為A3B2C3，但在試驗(yàn)組中，酸度最高的組別是A3B1C3，酸度達(dá)到了0.90 °T。以沙芥發(fā)酵液中所含的活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較R 值大小可知，發(fā)酵溫度和接種量為沙芥發(fā)酵液所含活菌數(shù)的主要影響因素，發(fā)酵時(shí)間為次要影響因素，即發(fā)酵溫度與接種量對(duì)沙芥發(fā)酵液的活菌數(shù)產(chǎn)酸影響大。根據(jù)正交得出最優(yōu)水平為A2B2C1，但是試驗(yàn)組活菌數(shù)最多的組別為A1B1C1。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

根據(jù)活菌數(shù)指標(biāo)來(lái)看，A1B1C1活菌數(shù)最高，根據(jù)酸度指標(biāo)來(lái)看，變化不明顯，所以選擇A1B1C1作為發(fā)酵的最優(yōu)工藝。即發(fā)酵14 h，發(fā)酵溫度33 ℃，接種量4%。

2.2.5 感官評(píng)價(jià)

對(duì)A1B1C1制備的飲料進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results

由表6 可知，沙芥飲料組織狀態(tài)均勻，無(wú)沉淀，色澤呈綠色，具有沙芥固有的清香氣味，微酸，微甜，口感較好。

3 結(jié)論

本研究以沙芥為單一原料，采用植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌的復(fù)合菌發(fā)酵沙芥汁制成乳酸菌飲料，以乳酸菌活菌數(shù)和酸度含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了復(fù)合菌的體積比為：植物乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=4∶4∶3（質(zhì)量比）；最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間14 h、接種量4%；此研究所用原料獨(dú)特、風(fēng)味獨(dú)特、制備工藝簡(jiǎn)單，為沙芥乳酸菌發(fā)酵飲料的生產(chǎn)和加工提供了一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)支撐。