響應面法優(yōu)化花生紅衣原花青素提取工藝及抗氧化活性

夏寧，謝春陽，黃威，呂呈蔚，孫暢，李倬林，胡濟美，李鐵柱*

（1.吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，吉林 長春 130033；3.中國國際工程咨詢有限公司 石化輕紡業(yè)務部，北京 100048）

花生是我國重要的經濟和油料作物，能提供必不可少的蛋白質和優(yōu)質植物油脂，在國民經濟和社會發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[1]?；ㄉt衣又稱花生種皮、紅薄皮、落花生衣、紅衣，是豆科落花生屬植物落花生種皮，常見為紅色或粉紅色，具有抑制纖維蛋白溶解、增加血小板含量[2]、改善血小板質量、增加毛細血管收縮[3]、糾正凝血因子缺陷、促進骨髓造血功能等功效?；ㄉt衣是花生油及花生制品生產過程中的主要副產物之一，價格低廉且具有多種活性，但是大部分被當作廢棄物，只有少數得到利用[4]。花生紅衣中含有豐富的多酚類化合物，其含量達到90～125 mg/g[5]，包含原花青素、白藜蘆醇、酚酸等[6]。原花青素是其主要功能成分之一，其含量高達81.90%。

原花青素（procyanidins，PC）是一種有著特殊分子結構的生物類黃酮混合物[7]，由于它們遇到酸性介質加熱可產生花青素，因此被稱為原花青素，其主要包括原花青素二聚體、兒茶素、表兒茶素，此外還包括三聚體、四聚體直至十聚體等，廣泛存在于植物的皮、核、花、殼、籽、葉中，是植物中一種色素成分。原花青素具有優(yōu)良的生物活性和功能，可以快速清除自由基，減少自由基產生，自由基是導致機體衰老的根本原因，消除體內多余自由基，具有延長壽命的功效，原花青素清除自由基的能力比維生素C 和維生素E 更強，并且低聚原花青素是目前國際上公認的有效天然抗氧化劑，在體內多種器官和組織中有抗氧化應激反應。此外，原花青素還有預防心血管疾病、抗腫瘤[8]、皮膚保健及美容等作用。榨取花生油及花生制品會產生大量花生紅衣，目前其主要用于動物飼料，造成了資源的浪費。利用花生紅衣可用于多酚類活性物質的提取[9]或研發(fā)以原花青素為主要成分的食品[10]和藥品[11]，用低成本原料創(chuàng)造高經濟效益，是近年來研究的熱點。但由于國內對于花生紅衣原花青素的相關內容較少、技術不成熟、制備成本較高而難以實現[12]，需待進一步研究。

本文對花生紅衣原花青素的提取工藝參數進行優(yōu)化，通過比較不同花生紅衣樣品原花青素含量和DPPH 自由基、羥自由基及ABTS+自由基清除能力對其抗氧化活性進行評價，并利用液相質譜聯(lián)用法，分析花生紅衣中原花青素的組成成分，初步探究花生紅衣原花青素的活性特點，為花生紅衣中原花青素的研究提供理論和技術支持，也為其作為天然抗氧化劑的應用提供參考，并且在食品開發(fā)應用中提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試驗材料

山東“四粒紅”花生：市售；原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（25 U/mg）：上海生工生物工程公司；無水乙醇、甲醇、鹽酸（37%）、香草醛（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

電子天平（HX1002T）：慈溪市天東衡器廠；熒光分光光度計（RF-6000）：日本島津制作所；電熱鼓風干燥箱（101-2A 型）：天津天泰儀器有限公司；高速萬能粉碎機（FW100）：天津泰斯特儀器有限公司；超聲細胞破碎儀（JY92-Ⅱ）：寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2）：常州朗越儀器制造有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（XD-2000A）：上海賢德實驗儀器有限公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-D）：鞏義市予華儀器有限責任公司；高速離心機（LXJ-IIB）：上海安亭科學儀器有限公司；液相色譜質譜聯(lián)用儀（Agilent1290-6470B）、色譜柱（ZORBAX Eclipse PlusC18）：美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原花青素提取

1.2.1.1 標準曲線繪制

稱取10 mg 原花青素標準品，在10 mL 容量瓶中用乙醇定容，稀釋至0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的濃度梯度，繪制標準曲線[13]。

1.2.1.2 花生紅衣原花青素提取

稱取山東“四粒紅”花生紅衣1 g，加入纖維素酶、10 mL 蒸餾水混合，50 ℃水浴加熱酶解，然后加入10 mL乙醇進行超聲，超聲后3 000 r/min 離心10 min，取上清液定容，為花生紅衣原花青素粗提液。取粗體液5 mL，再次定容作為樣品溶液。取0.5 mL 樣品溶液依次與4%香草醛甲醇溶液3 mL、濃鹽酸1.5 mL 混勻，避光靜置20 min，于500 nm 波長下測定吸光值[14]，代入標準曲線y=0.854x+0.069 1（R2=0.994 9）并計算原花青素提取率（Y，%）。

式中：V 為原花青素提取液定容后的體積，mL；C為原花青素的含量，mg/mL；N 為稀釋倍數；m 為花生紅衣全粉樣品的質量，mg。

1.2.2 單因素試驗

固定酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min、超聲溫度40 ℃，超聲時間30 min，考察酶添加量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解溫度50 ℃、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min，考察酶解時間（30、60、90、120、150 min）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解時間90 min、酶解溫度50 ℃、超聲時間30 min，考察超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解時間90 min、酶解溫度50 ℃、超聲溫度40 ℃，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對原花青素提取率的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化

根據單因素試驗結果選取響應面試驗參數范圍。選取酶添加量A、酶解時間B 及超聲時間C 作為變量，-1、0、1 代表試驗變量的水平，以山東“四粒紅”花生紅衣原花青素提取率作為響應值進行響應面分析，得到原花青素提取的最優(yōu)工藝參數。

表1 原花青素提取響應面優(yōu)化試驗設計Table 1 Response surface design for optimization of procyanidin extraction

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除率的測定

取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液0.5 mL，加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH 溶液，混合搖勻，30 ℃反應30 min。在517 nm 處測定吸光值計算DPPH 自由基清除率（D，%）[15]。

式中：Da為DPPH 與樣品反應后的吸光值；Dc為DPPH 與溶劑混合液的吸光值；Db為樣品與溶劑混合液的吸光值。

1.2.4.2 羥自由基清除率的測定

取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液0.5 mL加入0.5 mL 硫酸亞鐵溶液和0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸，用50%乙醇配制溶液7 mL，混合均勻，加8.8 mmo/L過氧化氫0.5 mL，室溫下避光反應30 min 后，在510 nm處測定吸光值。用50%的乙醇分別替代過氧化氫、樣品，測吸光值計算羥自由基清除率（O，%）[16]。

式中：Do為樣品與FeSO4、H2O2混合液吸光值；Di為樣品與FeSO4、乙醇混合液吸光值；Dj為乙醇與Fe－SO4、H2O2混合液吸光值。

1.2.4.3 ABTS+自由基清除率的測定

稱取0.192 0 g ABTS 試劑、0.0331 g K2S2O8，用去離子水定容至50 mL，將該溶液于室溫下暗處靜置過夜。將生成的ABTS 溶液用無水乙醇稀釋至734 nm 處吸光值為0.70。反應體系中，取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液20 μL，加入2 mL ABTS 反應液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定反應液在734 nm 處的吸光值[17]，計算ABTS+自由基清除率（A，%）。

式中：D1為樣品管的吸光值；D2為對照管的吸光值。

1.2.5 花生紅衣原花青素組分分析

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A 為0.1%甲酸，B 為甲醇；洗脫條件：0～1 min，12%B；1.0～2.5 min，12%～95%B；2.5～7.0 min，95%B；7.0～7.5 min，95%～12%B；7～10 min，12%B。進樣量1 μL、流速0.15 mL/min、柱溫30 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源（負離子掃描模式）、電噴霧離子源的溫度最高至100℃、錐體氣體量為0.83L/min。離子質量掃描范圍m/z 100～1 200。解吸氣體的溫度為400 ℃，解吸氣體的流量為11.67 L/min[18]。毛細管電壓設定為3 kV，錐體電壓最高為40 V。

1.3 數據處理與分析

每個樣品測定3 次，結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 20.0 軟件對數據進行分析，并使用Origin 9.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果如圖1 所示。

圖1 酶添加量、酶解時間、超聲溫度、超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.1 Effects of enzyme addition amount，digestion time，ultrasound treatment temperature and time on the yield of procyanidins

如圖1a 所示，在山東“四粒紅”花生紅衣樣品中，加入5.0%的纖維素酶明顯提高PC 的提取率，最高達到10.68%。這是因為細胞壁中纖維素被纖維素酶催化水解，細胞壁裂解，膜的滲透性增加，細胞內PC 浸出，而且細胞壁破損也為后續(xù)超聲提取創(chuàng)造有利條件，協(xié)同超聲介導的提取起到良好的協(xié)同作用。但繼續(xù)添加纖維素酶，PC 提取率下降，這可能是由于纖維素酶催化作用受到抑制，因為纖維素酶添加量增加，底物沒有通過纖維素酶的結合達到飽和[19]。

如圖1b 所示，當酶解時間至90 min 時PC 提取率達到最高，為8.31%?？赡苁怯捎诶w維素酶與花生紅衣充分接觸，膜的滲透性增加[20]，促進細胞內PC 的溶出，而當酶解時間過長，超過一定的閾值，大部分花生紅衣已與纖維素酶充分反應完全，反而會破壞已經提取出的原花青素穩(wěn)定性，活性物質被分解，導致提取率降低，同時也造成了資源的浪費。

如圖1c 所示，參考黃武等[21]的方法并結合纖維素酶最適溫度確定超聲溫度范圍，當超聲溫度在30 ℃時PC 提取率最高，達到9.03%。這可能是由于分子運動、滲透、擴散和溶解的加速，且高溫會引起細胞膜結構的變化，PC 從花生紅衣轉移到溶劑中，但在超過一定的閾值溫度時可能會破壞PC 結構，同時更高的溫度會破壞纖維素酶的活性，最終導致提取率下降。

如圖1d 所示，超聲時間20 min 時提取率達到最高，為12.02%。超聲波使分子的運動加劇，與花生紅衣粉更充分接觸，細胞壁被破壞，花生紅衣內的PC 被快速分離浸提出來，再增加超聲處理時間，反而會因為大部分原花青素已被浸出而降低提取率，如果還繼續(xù)超聲處理來幫助提取，會破壞已經提取的原花青素的穩(wěn)定性。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗優(yōu)化結果

原花青素提取率的大小可以體現出其提取的工藝是否為最優(yōu)參數條件，在提取過程中能夠減少能源的損耗，以最大的效率提取更多物質中的原花青素。選定酶添加量A、酶解時間B 及超聲時間C 這3 個因素作為試驗變量，以山東“四粒紅”花生紅衣原花青素提取率為響應值，采用Design Expert 8.0.6 設計三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗來獲得最佳試驗條件。響應面優(yōu)化試驗數據結果見表2。

表2 原花青素提取響應面結果分析Table 2 Response surface-optimized extraction results of procyanidins

2.2.2 響應面試驗方差分析

響應面方差分析結果如表3 所示。

表3 原花青素提取響應面方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface-optimized extraction results of procyanidins

從表3 可知，對于此模型的純誤差來說，失擬誤差的F 值為2.99，P＞0.05（該模型中的失擬誤差為0.158 5）這說明失擬誤差小，試驗數據與此模型的擬合程度較好。R2為0.993 5，而校正后的R2Adj為0.985 2，這表明該試驗模型的誤差較小，結果均在合理范圍內。因此原花青素提取率的試驗結果可以采用此模型進一步分析試驗數據。

從該表可以得出，3 個因素對原花青素提取率的影響由大到小排列為B>C>A；根據該試驗模型得出的最優(yōu)條件組合進行試驗，其條件為酶添加量5.34%、酶解時間96.30 min 及超聲時間22.31 min，原花青素提取率的理論值10.14%?？紤]到實際的可操作性，選擇酶添加量5.00%、酶解時間90.00 min、超聲時間20.00 min驗證該工藝參數組合得到的原花青素提取率為10.07%，與此模型得出的預測值接近，證明此提取工藝條件可靠。相比于傳統(tǒng)的超聲提取方法，纖維素酶法可以使細胞壁及細胞質中的纖維素降解，破壞細胞壁結構，提高有效成分的提取率[22]。

2.2.3 響應面試驗模型中兩兩因素交互的等高線圖和3D 圖

響應面等高線圖和3D 圖如圖2 所示。

圖2 響應面試驗模型中兩兩因素交互的等高線圖和3D 圖Fig.2 Contour and 3D plots of effects of factor interactions on the yield of procyanidins

由圖2 可以看出，隨著酶添加量和酶解時間的增加，原花青素的提取率先增加后減少。這表明酶添加量和酶解時間存在交互作用，且作用顯著，會影響PC的提取率。酶解時間與超聲時間這兩個因素之間的交互作用極顯著，其坡面幅度較大，隨著酶解時間與超聲時間的增加，原花青素提取率先上升再下降。根據酶添加量與超聲時間的增加，PC 的提取率先平緩上升后下降，由3D 圖可以看出其坡面較為平緩，該試驗結果與方差分析結果相符。

2.3 抗氧化活性測定結果

由于不同的生長時期對花生紅衣原花青素提取率影響較大[23]，因此本試驗選擇5 種產量較高且為同生長時期采摘的吉林本土花生紅衣進行抗氧化試驗。不同品種花生紅衣原花青素的抗氧化活性測定結果如圖3 所示。

圖3 不同品種花生紅衣原花青素的抗氧化活性測定Fig.3 Antioxidant activities of procyanidins in red coat samples of different peanut cultivars

由圖3 可知，清除DPPH 自由基、羥自由基及ABTS+自由基能力最強的均是“吉花27” 花生紅衣PC 提取液，其自由基清除能力分別為91.04%、76.64%、87.11%。最弱的均是“吉花25”花生紅衣PC 提取液，其自由基清除能力分別為62.58%、49.30%、57.29%。試驗結論與宋昱等[24]對花生紅衣原花青素抗氧化活性的研究結論相似。因此，后續(xù)選擇“吉花27”花生進行HPLC-MS 試驗，分析其組成成分。

2.4 液相質譜聯(lián)用法結果分析

低聚原花青素通常為二聚體到四聚體，由于其分子量小，細胞膜通過性強，生物活性突出，具有廣泛的開發(fā)價值。本文選用原花青素主要單體及二聚體對花生紅衣進行分析。

圖4 為7 種主要原花青素標準品的HPLC-MS 色譜圖，分別原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素、表沒食子酸兒茶素。

圖5 為“吉花27”花生紅衣原花青素提取液中各個峰的HPLC-MS 色譜圖。

圖5 花生紅衣中原花青素樣品的HPLC-MS 色譜圖Fig.5 HPLC-MS chromatograms of procyanidins in peanut red coat samples

由圖4、圖5 對比發(fā)現，其中存在原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素，未檢出表沒食子酸兒茶素[25]。根據峰面積計算得出含量分別為1.522、5.333、1.321、0.408、1.515、0.187 mg/g。表明“吉花27”中以原花青素A2為主。

圖6 為原花青素提純樣品中各個峰的最強峰離子m/z 質譜分析圖。

圖6 原花青素樣品的離子碎片圖Fig.6 Ion fragmentation of procyanidin samples

通過與標準品出峰時間和質譜圖對比，在3.29 min和3.54 min 峰的母離子m/z 為576，負離子模式下，最強峰離子m/z 為451，可能是原花青素A1，A2在T-unit進行了裂解[26]，失去一個間苯三酚分子（C6H6O3），產生m/z 451 碎片離子。在3.15 min 和3.43 min 峰的母離子m/z 為578，子離子為125、245、290、407、425 和451，最強峰離子m/z 為290。這可能是由于母離子Q M cleavage 分子間的一個單位斷裂[27]，失去C15H12O6而產生的，與原花青素B1和B2相吻合。在3.35、3.52 min 的兩個峰，母離子m/z 289，子離子為179、205、245，其中，最強峰離子m/z 為245，為母離子丟掉1 分子CO2后得到的離子[28]，分別與兒茶素和表兒茶素吻合。

3 結論

本文采用單因素和響應面法對超聲波輔助酶法提取花生紅衣原花青素的提取工藝參數進行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為酶添加量5.00%、發(fā)酵時間90.00 min、超聲時間20.00 min，花生紅衣中原花青素的提取率為10.0658%。不同花生紅衣原花青素提取液清除自由基的能力比較結果表明，“吉花27”花生紅衣原花青素抗氧化活性最強，“吉花25”最弱。通過HPLC-MS 法分析“吉花27”中含有兒茶素、表兒茶素、原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2，其含量分別為1.515、0.187、1.522、5.333、1.321、0.408 mg/g。本研究為花生紅衣原花青素的研究提供參考。