絞股藍茯磚茶代謝物特征及其體外降血脂作用

鄔培鴻，曹時玲，高悅華，成欣，夏飛

（陜西科技大學 食品科學與工程學院，陜西 西安 710021）

茯磚茶是以黑毛茶為原料，經過篩選、拼配、汽蒸、渥堆、壓制定型、發(fā)花、干燥和成品檢驗等工序制成的后發(fā)酵茶[1-3]。在茯磚茶加工過程中，通過水熱和茯磚茶特有的冠突曲霉（Aspergillus cristatus）的作用，可將黑毛茶中大分子物質逐步轉化為小分子物質，進而形成茯磚茶醇厚滋味的物質基礎。研究發(fā)現，茯磚茶具有降血糖[4]、抗氧化[5]、促進腸道健康[6]等功能。隨著人們對自身健康的關注，茯磚茶越來越受到關注。目前有關茯磚茶的研究主要集中在微生物群落分析[2]、代謝物組成[3]、茯磚茶品質形成機制研究[7]以及新產品開發(fā)[8-10]等方面。市場上茯磚茶種類較為單一，主要以傳統(tǒng)茯磚茶為主。為豐富茯磚茶產品種類，推動茯磚茶產業(yè)快速發(fā)展，有必要開發(fā)多樣化功能茯磚茶產品。

絞股藍是一種葫蘆科草質藤本植物，又稱小苦藥、七葉膽等，具有顯著的調節(jié)血脂的功能[11-13]。目前已有一些功能性的絞股藍茶、絞股藍酒、絞股藍口服液等產品[14]，其中以絞股藍茶所占比例較高。然而絞股藍茶口感苦澀，不利于大眾接受。利用茯磚茶中關鍵微生物A.cristatus 對絞股藍進行發(fā)酵，有望改善絞股藍苦澀的口感，同時獲得具有降血脂作用的功能性茯磚茶。目前，已有報道的復配型茯磚茶有杜仲茯茶[8]、桑葉茯茶[9]、羅布麻茯茶[9]等，而有關絞股藍茯磚茶及其調節(jié)血脂功能的報道還較少。

為改善絞股藍茶口感，開發(fā)具有多種功能的茯磚茶品類，本研究制備絞股藍茯磚茶，進而對絞股藍茯磚茶主要物質成分進行探究；并利用液相色譜質譜聯(lián)用儀對絞股藍茯磚茶代謝產物以及其形成的代謝通路進行分析；最后通過體外試驗評估絞股藍茯磚茶的降脂功效，以期為功能性茯磚茶的開發(fā)和應用提供依據，為豐富茯磚茶產品市場提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三四級黑毛茶、絞股藍：市售；98%濃硫酸（分析純）：西安化學試劑廠；95%乙醇、無水乙醇、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、醋酸鉀、碳酸鈉（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；水合茚三酮（分析純）、蘆?。藴势罚]食子酸（標準品）、福林酚（分析純）、胰酶（生物試劑）、辛伐他?。?7%）、甘胺膽酸鈉（98%）、膽酸鈉（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（分析純）：天津市登峰化學試劑廠；蒽酮（分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；甲醇、甲酸、丙醇（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛磺膽酸鈉（95%）、阿卡波糖水合物（98%）、α-淀粉酶（50 U/mg）；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

人工氣候培養(yǎng)箱（LRH-400-GS）：廣東省醫(yī)療器械有限公司；紫外可見分光光度計（SP-756PC）：上海光譜儀器有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-F160A）：上海一恒科技有限公司；電熱鼓風干燥箱（101-2 型）：北京科偉永興儀器有限公司；電子天平（BS2245）：德國賽多利斯公司；電熱恒溫水浴鍋（8002 型）：北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；組織研磨儀（CBGT-48）、酶標儀（Multiskan GO）、超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UHPLC-Q Exactive）：賽默飛世爾科技公司；色譜柱（HSS T3）：美國Waters 公司；氮氣吹掃儀（JXDC-20）：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 絞股藍茯磚茶的制備

將絞股藍與黑毛茶以10%原料比拼配，調整水分含量為22%左右，汽蒸15 min，渥堆發(fā)酵16 h，發(fā)花13 d，制備絞股藍茯磚茶（gynostemma pentaphyllum Fu brick tea，GFT），同時制備傳統(tǒng)茯磚茶（Fu brick tea，FT）作為對照，每種茯磚茶樣品平行6 組。

1.3.2 絞股藍茯磚茶中活性成分測定

絞股藍茯磚茶的水浸出物含量參照GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》進行測定；茶多糖采用蒽酮-硫酸比色法[15]；茶多酚總量參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行測定；金花菌數量參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行測定。

1.3.3 基于液相色譜質譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS） 對絞股藍茯磚茶與茯茶的代謝產物分析

1.3.3.1 代謝物提取

分別取10 mg 的絞股藍茯磚茶（GFT）和茯磚茶（FT）樣本于2 mL 離心管中，加入一顆直徑6 mm 的研磨珠，400 μL 甲醇∶水=4∶1（體積比）進行代謝產物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀研磨6 min（-10 ℃，50 Hz），然后低溫超聲輔助提取30 min（5 ℃，40 kHz）。將樣品于-20 ℃下靜置30 min，隨后離心15 min（4 ℃，13 000×g），移取上清液上機分析。另取等量樣品混合成質量控制樣（quality control sample，QC）上機檢測。

1.3.3.2 LC-MS 分析

色譜條件：2 μL 樣本經高速液相色譜T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分離后進入質譜檢測。流動相A 為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。分離梯度：0～0.1 min，流動相B 0%～5%；0.1～2 min，流動相B 5%～25%；2～9 min，流動相B 25%～100%；9～13 min，流動相B 維持100%；13.0～13.1 min，流動相B 線性從100%降至0%；13.1～16 min，流動相B 維持0%。流速設置為0.40 mL/min，柱溫40 ℃。

質譜條件：樣品質譜信號采集采用正負離子掃描模式，質量掃描范圍m/z 70～1 050。離子噴霧電壓，正離子電壓3 500 V，負離子電壓2 800 V，鞘氣275.79 kPa，輔助加熱氣68.95 kPa，離子源加熱溫度400 ℃，一級質譜（mass spectrometry 1，MS1）分辨率70 000，二級質譜（mass spectrometry 2，MS2）分辨率17 500。

1.3.3.3 數據預處理

將LC-MS 原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI（waters corporation，milford，USA）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣。同時將質譜（mass spectrometry，MS） 和串聯(lián)質譜（tandemmass spectrometry，MS/MS） 信息與代謝公共數據庫（http：//www.hmdb.ca/）進行匹配，得到代謝物信息。

1.3.3.4 差異代謝物分析

對預處理后的矩陣文件進行差異分析。利用主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交最小偏二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），并使用7 次循環(huán)交互驗證評估模型的穩(wěn)定性。此外，進行Student’s T 檢驗和差異倍數分析。差異代謝物的選擇基于OPLS-DA模型得到的變量權重值（variable important in projection，VIP）和Student’s T 檢驗P 值來確定，VIP＞2.0，P＜0.05 的代謝物為差異代謝物。差異代謝物通過KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。

1.3.4 絞股藍茯磚茶體外降血脂活性測定

1.3.4.1 GFT 茶湯濃縮液制備

取100 g 絞股藍茯磚茶，加入1 L 90 ℃的水浸泡30 min。將浸提的1 L 茶湯旋轉蒸發(fā)濃縮至0.2 L，隨后將濃縮液冷凍干燥，得絞股藍茯磚茶茶湯凍干粉[16-17]。稱取2 g 茶湯凍干粉加入200 mL 蒸餾水中制備10 mg/mL的GFT 茶湯濃縮液母液，備用。

1.3.4.2 茶湯濃縮液體外降血脂活性

參照文獻[18]的方法略作修改。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的GFT 茶湯濃縮液1.0 mL 于10 mL具塞試管中，分別加入1.0 mL 0.01 mol/L 的鹽酸溶液，在37 ℃恒溫振蕩消化30 min，以0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 值至6.24，隨后分別加入4.0 mL 10 mg/mL胰酶，再37 ℃恒溫振蕩消化30 min。分別向每個樣品中加入4 mL 1.0 mmol/mL 的?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉溶液（均以pH6.24 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），每種膽酸鈉鹽重復3 次，37 ℃恒溫振蕩1 h 后將混合物轉入離心管，4 000 r/min 離心20 min。對上清液中的膽酸鹽含量進行分析[18-20]，以辛伐他汀代替膽酸鈉鹽作為陽性對照。

1.3.5 絞股藍茯磚茶體外降血糖活性測定

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照阿卡波糖比色法[21]測定，依次加入40 μL 不同濃度GFT 茶湯濃縮液、80 μL 10 mmol/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液于96 孔板中，37 ℃孵育5 min，隨后加入40 μL 對硝基苯β-D-葡萄糖苷溶液（2 mmol/L），37 ℃反應30 min，隨后加入80 μL Na2CO3溶液，終止反應，于酶標儀中檢測405 nm 處的吸光度。

1.3.5.2 α-淀粉酶抑制活性的測定

參照阿卡波糖比色法[21-22]測定，將0.5 mL 濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的GFT 茶湯濃縮液分別與0.5 mL α-淀粉酶溶液（0.5 mg/mL）和0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.8 且含有0.006 mol/L NaCI）混勻。將溶液室溫下反應10 min 后添加0.01 g/mL 淀粉溶液，室溫下反應10 min，再加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色，沸水浴中反應5 min，冰水浴冷卻，加入10 mL 去離子水后，于540 nm 波長處測定吸光度。以阿卡波糖作為陽性對照，同時進行分析。

1.4 數據處理

采用Origin 2021 軟件作圖，SPSS 27 軟件對試驗數據進行顯著性分析。數值采用平均值±標準差表示。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 絞股藍茯磚茶的活性成分

絞股藍茯磚茶和茯磚茶中活性成分如表1 所示。

表1 絞股藍茯磚茶和茯磚茶的各物質含量Table 1 The content of each substance of GFT and FT

由表1 可知，絞股藍茯磚茶與茯磚茶相比，茶多糖增加了143.17 mg/g，茶多酚增加了131.58 mg/g，絞股藍茯磚茶中茶多糖、茶多酚以及游離氨基酸含量均顯著高于傳統(tǒng)茯磚茶（P＜0.05）。這可能是由于鮮嫩的絞股藍葉中多糖類、多酚類物質含量高，這為絞股藍茯磚茶的茶湯具有抗氧化和養(yǎng)生功效提供物質基礎[23-24]。而茯磚茶和絞股藍茯磚茶中干物質含量，可以提升茶湯的口感和香氣[25]。

2.2 絞股藍茯磚茶和茯磚茶代謝組分析

2.2.1 絞股藍茯磚茶和茯磚茶代謝物組成分析

絞股藍茯磚茶和茯磚茶代謝物組成分析如圖1所示。

圖1 絞股藍茯磚茶和茯磚茶樣本正離子模式的主成分得分圖和OPLS-DA 模型得分圖Fig.1 Principal component score diagram and OPLS-DA model score diagram of positive ion mode of GFT and FT samples

由圖1a 可知，PC1 和PC2 解釋量之和為74.70%；負離子模式下，數據結果的PCA 分析的PC1 和PC2解釋量之和為76.9%（數據未展示）。表明兩種模式采集的代謝組數據通過PCA 分析均能較好說明數據的整體情況。PCA 圖譜中，QC 聚集度較高，FT 和GFT 的6 個平行重復良好，表明代謝組檢測方法以及系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。GFT 和FT 的6 個平行各自聚集且相互明顯分開，表明絞股藍茯磚茶和茯磚茶樣品中代謝產物存在明顯的差異性。

由圖1b 可知，正離子模式下的OPLS-DA 模型對絞股藍茯磚茶和茯磚茶代謝組數據集的解釋度為70.11%，負離子模式下OPLS-DA 模型對絞股藍茯磚茶和茯茶代謝組數據集的解釋度為76.20%（數據未展示）。GFT 和FT 樣品區(qū)分非常顯著，樣本全部處于95%置信區(qū)間內，表明絞股藍茯磚茶與茯磚茶的代謝物存在明顯差異，可用于后續(xù)差異成分分析。

2.2.2 絞股藍茯磚茶和茯磚茶的差異性代謝物篩選及分析

對絞股藍茯磚茶和茯磚茶的代謝產物進行比較，共檢測出顯著差異代謝物10 類142 種（VIP＞2.0 且P＜0.05），絞股藍茯磚茶和茯磚茶的差異代謝物種類如表2 所示。然后選取絞股藍茯磚茶（GFT）和茯磚茶（FT）之間差異明顯的前30 種代謝產物（VIP＞3.2，P＜0.05），進行差異代謝的熱圖分析，絞股藍茯磚茶和茯磚茶的差異代謝物如圖2 所示。

圖2 絞股藍茯磚茶和茯磚茶差異代謝的熱圖Fig.2 Heat map of differential metabolism of GFT and FT

表2 絞股藍茯磚茶較茯磚茶差異性代謝物種類與變化情況Table 2 Differential metabolic species and changes of GFT and FT

由表2 可知，這些差異代謝物主要包括脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環(huán)化合物、苯丙烷和聚酮類、有機氧化合物、苯環(huán)型化合物、核苷酸和類似物、生物堿及其衍生物、有機氮化合物10 個類別。GFT 與FT 相比，其中顯著上調的差異代謝物有90種，顯著下調的差異代謝物有52 種，且脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物等物質占有較高比例。

由圖2 可知，前30 種差異明顯的代謝產物中，與FT 相比，GFT 中顯著上調的代謝物包括4-香豆酰氯（4-coumaroylputrescine，VIP=4.13）、黃綠青霉素（citreoviridin，VIP =3.43）、 洛 加諾 西 甙（loganoside，VIP =3.44）、全反式-13，14-二氫視黃醇（all-trans-13，14-dihydroretinol，VIP=3.93）、越南參皂苷R12（vinaginsenoside R12，VIP=3.3）、N-羥基-L-酪氨酸（n-hydroxy-L-tyrosine，VIP=3.98）、脫氫丁烯（dehydrotremetone，VIP=3.58）、肉桂萜醇D1（cinncassiol D1，VIP=3.75）、吡拉西坦（piracetam，VIP=4.43），人參皂苷Rh8（ginsenoside Rh8，VIP=3.35）、二甲醚（dimethisterone，VIP=3.31）、N-乙酰-D-半胱氨酸（n-acetyl-D-cysteine，VIP=3.41）、去氫大豆皂甙I（dehydrosoyasaponin I，VIP=3.83）等。這些代謝物可能是絞股藍茯磚茶中特有的代謝產物，為絞股藍茯磚茶的特殊功能奠定物質基礎。

2.2.3 差異性代謝物的通路分析

為確定GFT 與FT 差異代謝物的產生代謝途徑，對表2 中的差異代謝物根據KEGG 數據庫進行通路富集分析，通路富集結果如圖3、表3 所示。

圖3 絞股藍茯磚茶差異性代謝產物的KEGG 富集氣泡圖Fig.3 Bubble diagram of KEGG enrichment of differential metabolism from GFT and FT

表3 絞股藍茯磚茶特征性代謝產物形成通路Table 3 Characteristic metabolite formation pathway of GFT

由圖3 可知，GFT 與FT 的差異性代謝物主要集中在脂類代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等方面。圖3 中Y 軸代表GFT 與FT 差異代謝物的通路富集，X 軸代表通路影響。富集氣泡尺寸越大和顏色越深分別代表GFT 和FT 中更大的通路富集和更高的通路影響值。其中，孕烯醇酮、2-羥基雌酮等是絞股藍茯磚茶中重要脂類的差異性代謝產物，具有重要影響。石膽酸葡糖苷酸（lithocholic acid glucuronide）、D-葡萄糖酸（D-glucuronic acid 1-phosphate）、反式烏頭酸（trans-aconitic acid） 等是絞股藍茯磚茶中重要的碳水化合物類差異性代謝產物。氨基酸代謝通路中，L-組氨酸（Lhistidine）、L-喹啉酯（L-quinate）、5'-甲基硫代腺苷（5'-methylthioadenosine）是絞股藍茯磚茶中重要的氨基酸類代謝產物（表3）。整體上，氨基酸代謝和碳水化合物代謝對絞股藍茯磚茶中代謝產物的形成影響較大。

2.3 絞股藍茯磚茶體外降血脂、降血糖體外活性測定結果

2.3.1 GFT 茶湯濃縮液體外降血脂測定結果

GFT 茶湯濃縮液對?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉活性的影響如圖4 所示。

圖4 GFT 茶湯濃縮液的體外降血脂活性Fig 4 In vitro hypolipidemic activity of GFT tea soup concentrate

由圖4 可知，隨著濃度的增加，GFT 茶湯濃縮液與?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉的結合率也在增加。0.2 mg/mL GFT 茶湯濃縮液與?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的結合率分別是陽性對照（辛伐他?。┑?8.06%、18.05%、30.56%。0.6 mg/mL GFT 茶湯濃縮液與?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的結合率分別是陽性對照的17.67%、17.67%、31.26%。GFT 茶湯濃縮溶液的濃度為1.0 mg/mL 時，其對?；悄懰徕c的結合率為14.65%，對甘氨膽酸鈉的結合率為17.43%，對膽酸鈉的結合率為34.1%。1.0 mg/mL GFT 茶湯濃縮液與?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的結合率是陽性對照的17.88%、17.88%、36.52%。GFT 茶湯濃縮液與3 種膽酸鈉的結合量越高，說明其降膽固醇效果越好，降血脂活性越強。本研究中GFT 茶湯濃縮液的體外降脂效果是辛伐他汀藥物的17.88%～36.52%。然而，絞股藍茯磚茶作為一種茶飲品，在安全性等方面具有明顯優(yōu)勢，可長期飲用此類茶來調節(jié)血脂。

2.3.2 GFT 茶湯濃縮液體外降血糖測定結果

GFT 茶湯濃縮液對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的影響如圖5 所示。

圖5 GFT 茶湯濃縮液的體外降血糖活性Fig.5 In vitro hypoglycemic activity of GFT tea soup concentrate

由圖5 可知，GFT 茶湯濃縮液具有α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，隨著茶湯凍干粉濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率也在增加。0.6 mg/mL GFT 茶湯濃縮液對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率是陽性對照（阿卡波糖） 的12.31%、44.54%。1.0 mg/mL GFT 茶湯濃縮液對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分別為8.23%和42.64%，分別是陽性對照的13.63%、58.18%。絞股藍茯磚茶具有長期用于食療調整高血糖癥的潛力。

3 結論

本研究對絞股藍茯磚茶中的代謝產物特征進行分析，探討差異性代謝產物的形成代謝通路，并初步揭示了絞股藍茯磚茶的體外降血脂和降血糖活性。與傳統(tǒng)茯磚茶相比，絞股藍茯磚茶中共有10 類142 種顯著性差異代謝產物，包括38 種脂質和類脂分子、29 種有機酸及其衍生物、19 種有機雜環(huán)化合物和15 種苯丙烷和聚酮類等。絞股藍茯磚茶差異性代謝物主要集中在脂類代謝通路、碳水化合物代謝通路、氨基酸代謝通路等方面。絞股藍茯磚茶具有一定的體外降血脂和降血糖活性，可長期用于食療調整高血脂、高血糖癥。本研究旨在開發(fā)功能性茯磚茶產品，以期為茯茶產業(yè)多元化發(fā)展提供理論基礎。