內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用

浮鳳洲 （廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院,廣東 東莞 523320）

柚皮苷（Naringin）作為一種雙青黃酮類化合物，可在柑橘、葡萄柚果皮、酸橙果皮中進行提取[1]。隨著社會的高速發(fā)展，人們的生活方式有了很大的變化，我國糖尿病的患病人數(shù)有了大幅增加。糖尿病患者在進行代謝的過程中可能會引起血管內(nèi)皮細胞的損傷[2]，對于內(nèi)皮細胞線粒體ROS的生成具有重要的作用。有相關(guān)研究[3]證實，Naringin在糖尿病的心血管并發(fā)癥中具有一定的保護作用，主要表現(xiàn)在調(diào)控GSK3β通路、線粒體保護以及抗ERS作用，在產(chǎn)生保護作用后，會引起多種傷害的刺激，從而引發(fā)細胞損傷[4]。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β是糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞損傷的重要發(fā)病機制，可以將其當作內(nèi)皮細胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也將其當作是Naringin防治的重要靶標。近年來，糖尿病已經(jīng)成為了危害心血管疾病的獨立因素之一，成為了世界衛(wèi)生發(fā)展重要難題[5]。糖尿病產(chǎn)生的主要危害來自于并發(fā)癥，可引起視網(wǎng)膜病變、腎臟病變等[6]。本文基于此，探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 本次試驗的試劑、儀器等包括：血管內(nèi)皮細胞（上海雅吉生物科技有限公司），柚皮苷（美國Sigma公司），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑四本基乙酸（4-Pheny1 Butyrie Acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP競爭性GSK-3β抑制劑）（賽百慷生物科技股份有限公司），胎牛血清（PAN公司），培養(yǎng)基（Hycolone公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司），GSH試劑盒（武漢吉立德生物有限公司），ROS試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司），DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），細胞凋亡試劑盒（Beyotime公司），IL-6（Interleukin-6）、NF-kB（Nuclear Factor-Kappa B）、GRP78（Glucose Related Protein）、Caspase3、CHOP都購買自Abcam公司，細胞培養(yǎng)箱（力申科學(xué)儀器有限公司），Nano Drop 2000（Thermo公司），離心機（Sigma公司），40mmol/L葡萄糖（Hyclone公司）[7]。

1.2 方法

1.2.1 細胞計數(shù)測定方法 首先在孔板中將細胞懸液進行配置，并放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的多肽，因為CCK-8的量比較少，所以在孔壁上可能會帶來一定的誤差，因此在培養(yǎng)板中要進行敲擊，從而充分的混勻。在培養(yǎng)了1-4h后，就可以對其進行細胞凋亡率及細胞存活率的檢測，檢測的波長一般為450-490nm左右[8]。

1.2.2 DCFH-DA染色法檢測活性氧及GSH試劑盒檢測 用無血清培養(yǎng)基進行陽性稀釋，讓濃度達到100uM，如果刺激時間較短，還需要先裝載探針。若刺激時間較長，就后裝探針[9]。本次試驗的刺激時間較長，所以選擇后裝探針。在細胞培養(yǎng)的過程中，對細胞的狀態(tài)進行檢測，并對其進行清洗和誘導(dǎo)，于37℃環(huán)境下對細胞進行避光培養(yǎng)，離心后去除上清液，對細胞收集后即可使用熒光分光光度計進行檢測。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸所組成的，將0.05g的細胞種子放入5%的三氯乙酸中進行研磨，離心10min后取上清液，標準溶液使用5%的三氯乙酸并選用pH為7.8的PBS，充分的混勻后，在30℃的條件之下保溫5min后即可進行檢測。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測及免疫印跡法檢測 將所需的板條數(shù)放入到框架之中，建立空白孔，加入TMB顯色液及終止液，通過對照實驗畫出相應(yīng)的曲線。將濃度不同的標準品加入到孔中，使用封板膠紙封住在室溫下培養(yǎng)2h。隨后清洗板條，并在每個空白孔中加入100ul的工作液，于室溫下培養(yǎng)1h。隨后加入酶結(jié)合物[10]，培養(yǎng)20min。加入顯色劑后繼續(xù)培養(yǎng)20min，最后加入終止液充分攪拌后即可檢測IL-1β、IL-6、IL-8。

免疫印跡法需要進行細菌誘導(dǎo)和表達，借助電泳的方式將細胞裂解，在真核細胞中加入勻漿緩沖液，在室溫下加勻漿，在13000r下離心15min，取上清液進行轉(zhuǎn)膜。在免疫反應(yīng)中，選擇0.01PBS洗膜，持續(xù)時間5min[11]，加入包被液后均勻搖動，在室溫下培養(yǎng)2h。加入一抗液體，需要將膜全部覆蓋，在4℃的條件下放置12h，通過陰性對照的方式進行培養(yǎng)。最后加入顯色液，終止反應(yīng)后即可進行檢測[12]。

1.2.4 JC-1染色法測定 首先誘導(dǎo)細胞凋亡，并同時設(shè)立陰性組和陽性組，在適當?shù)臅r間之內(nèi)對其進行Caspase檢測，將細胞進行收集。使用PBS洗滌液對細胞離心5min，去細胞上清液后加入水稀釋，將其加熱到37℃。吸入500g/L的incubation Buffer，加入JC-1混勻成為JC-1工作液。將工作液放入細胞中，讓細胞懸浮，并于37℃下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。隨后在2000rpm下離心5min。最后使用流式細胞儀對數(shù)據(jù)進行檢測[13]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本次研究所涉及統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)資料均利用SPSS21.00軟件進行處理計算，其中計量資料選擇t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，當計算結(jié)果得出P＜0.05則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率檢測結(jié)果 研究結(jié)果表明，正常對照組細胞的存活率為100%，高糖組的細胞存活率為（70.36±6.31）%，柚皮苷+高糖組的細胞存活率為（86.44±5.80）%，可以看出，在不進行任何干預(yù)的情況下，細胞存活率不會受到任何影響。而柚皮苷+高糖組的細胞存活率明顯高于高糖組（P＜0.05），說明柚皮苷在高糖引起的血管內(nèi)皮損傷中具有保護作用。

2.2 氧化應(yīng)激檢測結(jié)果 氧化應(yīng)激主要測試細胞的活性氧（ROS）以及GSH水平，由于使用的DCFH-DA探針沒有熒光，所以在酯酶水解后會形成DCFH，難以透過細胞膜。研究結(jié)果表明，高糖組的ROS含量明顯高于正常對照組，且相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的柚皮苷濃度有所增加，ROS含量降低。

2.3 細胞凋亡檢測結(jié)果 在細胞凋亡中，正常對照組的細胞凋亡率最低，為（20.77±3.08）%，高糖組的細胞凋亡率為（42.71±8.12）%，明顯高于柚皮苷+高糖組的（24.01±4.22）%。這說明柚皮苷對于細胞凋亡有著保護的作用。

2.4 炎癥因子檢測結(jié)果 在炎癥因子的表達中，相較于正常對照組，高糖組的NF-kB、IL-6表達有所升高（P＜0.05）。相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的IL-6、NF-kB有所下降。如表1所示。

表1 三組炎癥因子檢測結(jié)果比較

2.5 線粒體損傷檢測結(jié)果 為了驗證線粒體損傷的檢測結(jié)果，分別加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑四苯基乙酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP競爭性GSK-3β抑制劑），觀察血管內(nèi)皮細胞毒性的作用。研究結(jié)果表明，正常對照組MMP和細胞色素C表達明顯高于高糖組（P＜0.05），而4-PBA組、TDZD-8組、4-PBA+高糖組及TDZD-8+高糖組明顯高于高糖組。這說明4-PBA、TDZD-8對血管內(nèi)皮損傷有保護作用。見表2。

表2 各組線粒體損傷檢測結(jié)果

2.6 eNOS表達及NO檢測結(jié)果 研究結(jié)果表明，相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的柚皮苷濃度增加，NO含量也在增加?？墒窍噍^于對照組，高糖組的NO含量明顯降低。

3 討論

糖尿病（Diabetes）是臨床常見的慢性疾病，受到許多外部因素的影響，導(dǎo)致患者自身的代謝處于紊亂狀態(tài)[14]。臨床上主要以高血糖為主要表現(xiàn)，還可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦的情況。糖尿病會引發(fā)許多其他的并發(fā)癥，嚴重的還有可能引發(fā)器官衰竭，是一種無法治愈的疾病[15]。在本次實驗當中，探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用。研究結(jié)果表明，在不受到任何干擾的情況下，細胞的存活率較高、凋亡率較低，建立了葡萄糖高糖模型后發(fā)現(xiàn)，高糖組的細胞存活率較低，凋亡率較高，但是發(fā)現(xiàn)柚皮苷能夠有效地對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生保護作用，有效提高細胞存活率，降低凋亡率，且降低了ROS含量。在炎癥因子檢測結(jié)果中，柚皮苷+高糖組的IL-6、NF-kB相較于高糖組有所下降。4-PBA、TDZD-8對線粒體損傷有保護作用。

綜上所述，柚皮苷在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路下對高糖引起的血管內(nèi)皮損傷具有保護作用，且4-PBA、TDZD-8可以起到抑制作用，其中的作用機制可能與炎癥因子、細胞凋亡有一定的關(guān)系，因此，臨床治療中如果有效地抑制炎癥因子釋放，可能會產(chǎn)生較好的臨床效果。