糯紅高粱苗期的內(nèi)生酵母菌多樣性分析

劉雯雯 胡連清 周萬(wàn)海 ， 魏 琴馮瑞章 趙 鑫 蒙昌廷 張淑瑤

（1宜賓學(xué)院，四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644007；2宜賓學(xué)院，農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川 宜賓 644007）

糯性高粱主要栽培于我國(guó)西南地區(qū)（四川、貴州和重慶）［1］，其中四川宜賓的糯紅高梁屬國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品，在釀酒逆反應(yīng)中具有易糊化和易發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，這一釀造原料品質(zhì)形成可能與其內(nèi)部微生物組成有著密不可分的關(guān)系［2］。但目前關(guān)于高粱的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分分析和對(duì)白酒品質(zhì)的影響等，極少關(guān)注影響植株生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成的內(nèi)生菌，特別是內(nèi)生酵母菌的組成和功能。

近年來(lái)，在冰川［3］、湖泊［4］及昆蟲(chóng)［5］等中相繼發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生酵母新種，許多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注內(nèi)生酵母并開(kāi)展相關(guān)研究。植物內(nèi)生酵母是定殖于健康植物組織細(xì)胞中，不會(huì)對(duì)宿主植物造成任何損害且形成互惠互利關(guān)系的微生物［6］。宿主植物為內(nèi)生酵母提供營(yíng)養(yǎng)且穩(wěn)定的環(huán)境條件，而內(nèi)生酵母通過(guò)分泌代謝產(chǎn)物增強(qiáng)植物對(duì)不利條件的抵抗能力，保護(hù)植物免受病原體的侵襲、維持植株健康狀態(tài)［7］。同一植物中內(nèi)生酵母菌的數(shù)量和多樣性相對(duì)內(nèi)生細(xì)菌均較少，但酵母菌更易分離培養(yǎng)且長(zhǎng)期儲(chǔ)存，在抵抗植物病原體、促進(jìn)作物生長(zhǎng)方面更具優(yōu)勢(shì)［8］。植物組織、品種和外部自然環(huán)境等是影響內(nèi)生酵母菌數(shù)量和菌屬組成的關(guān)鍵因素［9］，且已有研究證明，內(nèi)生酵母可生產(chǎn)抗菌劑和生物催化劑等生物化學(xué)品，也影響著決定白酒風(fēng)味和特色的原料品質(zhì)［10］。因此，對(duì)植物內(nèi)生酵母展開(kāi)研究具有較大應(yīng)用價(jià)值。雖然目前關(guān)于內(nèi)生微生物的研究呈熱門趨勢(shì)，但有關(guān)植物內(nèi)生酵母菌的相關(guān)報(bào)道仍較少，且在已有研究中，多為冬季小麥［11］、煙草植物［7］、奇異果［12］等物種的報(bào)道，而高粱微生物探究更多側(cè)重于環(huán)境、根際土和內(nèi)生細(xì)菌等［13-14］。微生物種類研究中的純培養(yǎng)法不能完整揭示內(nèi)部微生物群落組成，但可獲得純菌株用于微生物生理和代謝研究［15］。而高通量測(cè)序技術(shù)能更全面且準(zhǔn)確地反映微生物群落構(gòu)成和多樣性，從而檢測(cè)到難以培養(yǎng)的微生物［16］。

基于此，本試驗(yàn)借助傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)宜賓地區(qū)五糧濃香型白酒釀造專用糧—糯紅高粱（雜交種金糯粱1 號(hào)和地方種青殼洋）苗期不同組織內(nèi)生酵母菌種類、群落多樣性展開(kāi)研究，并對(duì)分離菌株產(chǎn)酶功能進(jìn)行初篩，旨在揭示糯紅高梁中內(nèi)生酵母菌群落組成，挖掘潛在具有較高生產(chǎn)價(jià)值的內(nèi)生菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糯紅高粱品種：雜交種金糯粱1號(hào)（A）和地方種青殼洋（B），種植于四川省宜賓市宜賓學(xué)院川茶學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（東經(jīng)104°36′33″，北緯28°47′41″），種植和栽培管理技術(shù)采用當(dāng)?shù)嘏醇t高粱常規(guī)方法，待植株長(zhǎng)出2 葉后（即苗期），分別采集2 個(gè)品種健康的根（R）、莖（S）、葉（L）組織于無(wú)菌自封袋中，冷鏈運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)將植物組織取出，根部按照下述步驟完成表面無(wú)菌化處理：流水60 min，無(wú)菌水2 次，75%乙醇1 min，無(wú)菌水1次，5% NaClO 3 min，75%乙醇1 min；莖部為：流水60 min，無(wú)菌水2次，75%乙醇0.5 min，無(wú)菌水1 次，4% NaClO 4 min，75%乙醇20 s；葉部為：流水60 min，無(wú)菌水2 次，75%乙醇20 s，無(wú)菌水1 次，3%NaClO 3 min，75%乙醇20 s。將材料分成2 等份，1 份4 ℃條件下保存，用于純培養(yǎng)法分離菌株；1份勻漿后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于基因組DNA 提取和高通量測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糯紅高梁可培養(yǎng)內(nèi)生酵母菌的分離與鑒定無(wú)菌條件下用手術(shù)刀分別將金糯粱1號(hào)和青殼洋的根、莖、葉組織切成長(zhǎng)約1 cm 小段、1 cm 小段和0.5 cm×0.5 cm 小片，接種至酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrosem，YPD）瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)平板5個(gè)樣品，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，挑選單菌落進(jìn)行分離純化，直至獲得純凈菌株。同時(shí)采用顯微鏡檢法剔除部分菌株，記錄數(shù)量。

形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》［17］，將純化菌株劃線接種于Wallerstein Laboratory 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（wallerstein laboratory nutrient，WLN）上，28 ℃倒置培養(yǎng)10 d。記錄酵母菌落在WLN平板上的顏色、形態(tài)、透明度、質(zhì)地、隆起狀態(tài)，完成形態(tài)類型分類。根據(jù)《微生物分類學(xué)》［18］中酵母菌鑒定項(xiàng)目測(cè)定菌株的生理生化指標(biāo)。

26SrDNA D1/D2 區(qū)序列擴(kuò)增分析：取50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（TaKaRa，日本）裂解液于無(wú)菌離心管中，用接種環(huán)挑取少量單菌落到離心管中輕輕攪拌搖勻。80 ℃水浴加熱15 min，低速離心，取上清液進(jìn)行基因序列PCR 擴(kuò)增。引物為NL1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）、NL4（5′-CTTCCGTC AATTCCTTTAAG-3′）。PCR體系為50 μL：10 mmol·L-1引物NL1 和NL4 各1 μL，DNA 模板5 μL，Premix Taq（Ex Taq Version 2.0） 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR 程序：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物后，送上海生工生物公司測(cè)序。在NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)DNA 序列，選取同源性較高的相關(guān)菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列作為參比分析對(duì)象［19］。

1.2.2 糯紅高梁可培養(yǎng)內(nèi)生酵母產(chǎn)酶特性測(cè)定 純化好的菌株接種于待測(cè)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。淀粉酶篩選需用0.1%碘液染色，5 min 內(nèi)觀察菌落周圍透明圈情況；蛋白酶、脂肪酶篩選直接通過(guò)觀察菌落周圍是否存在透明圈；果膠酶篩選用10 g·L-1的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）溶液淹沒(méi)培養(yǎng)皿，觀察菌落周圍的光暈；纖維素酶篩選用0.3 g·L-1剛果紅染色后觀察菌落周圍是否有透明圈；酯酶篩選通過(guò)觀察菌落周圍的沉淀物（不透明的暈）；以上情況若存在透明圈或不透明暈則為陽(yáng)性［20］。

1.2.3 糯紅高梁內(nèi)生酵母DNA 提取與PCR 擴(kuò)增、測(cè)序 內(nèi)生酵母總DNA 使用E.Z.N.A.@ Soil DNA Kit試劑盒（Omega Bio-Tek，Inc.，美國(guó)）進(jìn)行提取，使用GeneAmp?9700 型PCR 儀（ABI，美國(guó)）進(jìn)行DNA 擴(kuò)增試驗(yàn)。對(duì)酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為NL1F（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）、NL2R（5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′）。體系共20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH20 補(bǔ)至20 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序工作由上海美吉公司完成。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 基于上海美吉生物I-Sanger云平臺(tái)完成生物信息學(xué)分析。使用fastp（v 0.19.6）對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控，F(xiàn)lash（v 1.2.11）通過(guò)重疊拼接樣品pairend 雙端序列。Uparse（v 11）根據(jù)97%相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體。通過(guò)Mothur（v 1.30.2）和Qiime（v 1.9.1）計(jì)算Alpha 多樣性和Beta 多樣性距離矩陣，在ANOSIM 組間差異檢驗(yàn)下進(jìn)行非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析。使用LEfSe 分析確定引起微生物群落結(jié)構(gòu)組間差異的指示菌。利用FUNGuild（v 1.0）對(duì)內(nèi)生酵母菌分類進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯紅高粱可培養(yǎng)內(nèi)生酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 內(nèi)生酵母菌的分離純化 從2 個(gè)糯紅高梁品種不同組織中共分離到36 株酵母菌（電子附表1），其中金糯粱1 號(hào)27 株，青殼洋9 株。按照組織劃分，根、莖、葉分別分離到6、7、23 株酵母菌。不同酵母菌在WLN培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差異明顯（圖1）。根據(jù)菌落差異性又可將36 株酵母菌初步分為9 類（Ⅰ～Ⅸ），菌落呈粉色、白色、黃色、綠色等（表1），Ⅲ類菌株數(shù)目最多。利用不同類型酵母菌對(duì)不同碳源分解能力的不同進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)生氣體和菌液渾濁程度進(jìn)行區(qū)別（電子附表2），可知GA6、GA7、GA8等22 株菌在有氧條件下可同化半乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、木糖醇、松三糖等碳源，而不能利用葡萄糖和乳糖。GA40和GA50表現(xiàn)的生理生化結(jié)果相同，GB95和GB105 菌株結(jié)果相同，其他菌株同化特征具有獨(dú)特性。Ⅲ和Ⅳ類酵母菌在WLN 培養(yǎng)基上顏色相同，形態(tài)略有差異，形態(tài)Ⅲ表面光滑，而形態(tài)Ⅳ表面褶皺，但屬于此2 類菌株的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果一致，可能為相同屬。

圖1 內(nèi)生酵母菌在WLN培養(yǎng)基上的形態(tài)（標(biāo)尺=5 mm）Fig.1 Colony morphology of endophytic yeasts isolated on WLN medium（Scale bar=5 mm）

表2 內(nèi)生酵母菌的26S rDNA D1/D2序列分析結(jié)果Table 2 Analysis results of 26S rDNA D1/D2 sequence of the endophytic yeasts

2.1.2 內(nèi)生酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析 通過(guò)對(duì)36 株內(nèi)生酵母菌26S rDNA D1/D2 序列測(cè)序比對(duì)及前期的菌株形態(tài)學(xué)、生理生化結(jié)果可知（表2），形態(tài)Ⅰ的分子鑒定結(jié)果為紅酵母菌屬（Rhodotorula）、Symmetrospora、囊擔(dān)菌屬（Cystobasidium），形態(tài)Ⅲ的分子鑒定結(jié)果為隱球菌屬（Cryptococcus）、漢納酵母菌屬（Hannaella），形態(tài)Ⅴ的分子鑒定結(jié)果為Naganishia和囊擔(dān)菌屬。鑒定為淺黃隱球酵母的形態(tài)分布于Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ類。36株內(nèi)生酵母菌隸屬于1 門3 綱5 目6 科7 屬10 種，分別為紅酵母菌屬（2 種）、Symmetrospora（1 種）、囊擔(dān)菌屬（2 種）、擲孢酵母菌屬（Sporobolomyces）（1 種）、隱球菌屬（2 種）、漢納酵母菌屬（1 種）和Naganishia（1 種），其中優(yōu)勢(shì)門為擔(dān)子菌門，優(yōu)勢(shì)種為淺黃隱球酵母。金糯粱1 號(hào)27 株菌株隸屬于1 門3 綱3 目4 科5 屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、紅酵母菌屬、擲孢酵母菌屬、囊擔(dān)菌屬；青殼洋9 株菌株隸屬于1 門3 綱4 目4 科4 屬，屬類包括Symmetrospora、紅酵母菌屬、Naganishia、隱球菌屬，兩個(gè)品種共有屬為隱球菌屬、紅酵母屬。按照組織分類，高粱根部6 株酵母菌均為隱球菌屬；莖部7 株酵母菌隸屬于1 門3 綱4 目5 科6屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、Naganishia、囊擔(dān)菌屬、紅酵母屬、擲孢酵母菌屬；葉部23 株酵母菌隸屬于1門3綱4目5科5屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、紅酵母菌屬、囊擔(dān)菌屬、Symmetrospora，隱球菌屬為根莖葉共有屬。

2.1.3 可培養(yǎng)內(nèi)生酵母菌產(chǎn)酶特性測(cè)定 36 株內(nèi)生酵母菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶和酯酶功能特性測(cè)定結(jié)果如表3 和電子附圖2 所示，GA1、GB4、GB13、GA21、GB46和GA78產(chǎn)酶功能最多，均能產(chǎn)生4種酶，前5株菌能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、果膠酶和纖維素酶，GA78能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和酯酶，隱球菌屬菌株在產(chǎn)酶功能菌株中占比最多，為58.82%。

圖2 糯紅高粱不同品種和不同組織內(nèi)生酵母菌群Alpha多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis of endophytic yeasts in different varieties and tissues of waxy sorghum

表3 內(nèi)生酵母菌產(chǎn)功能酶特性Table 3 endophytic yeasts with functional enzyme activities

2.2 糯紅高粱內(nèi)生酵母菌高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 樣品分類操作單元（operational taxonomic units,OTU）分析 對(duì)糯紅高粱不同品種和組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，原始序列經(jīng)序列質(zhì)量控制后共得到380 602條高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽（clean tags），序列平均長(zhǎng)度269 bp。根據(jù)97%相似性聚類，共獲得111 個(gè)非重復(fù)OTU，隸屬于2門83屬。其中，金糯粱1號(hào)48個(gè)OTU，隸屬于2 門36屬，青殼洋99 個(gè)OTU，隸屬于2 門76 屬，兩者共有OTU 36 個(gè)，特有的OTU 分別為12 和63 個(gè)。按照組織分類，根、莖、葉各有OTU 數(shù)為59、75、29 個(gè)，其三者共有OTU 8個(gè)，特有OTU分別為30、34、3個(gè)。

2.2.2 糯紅高粱內(nèi)生酵母菌Alpha 和Beta 多樣性分析 Alpha 多樣性分析表明，不同糯紅高粱品種和不同組織的酵母菌群落存在差異（圖2）。在品種方面，菌群豐富度Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)及菌群多樣性Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均無(wú)顯著性差異，且青殼洋Chao 指數(shù)和Sobs 指數(shù)大于金糯粱1 號(hào)，說(shuō)明青殼洋物種總數(shù)相對(duì)較多。就組織而言，Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)和Shannon 指數(shù)在根莖葉間無(wú)顯著性差異，但根部Simpson 指數(shù)顯著大于莖部（P=0.020）。Beta多樣性基于ANOSIM組間差異檢驗(yàn)下的NMDS 分析（圖3），發(fā)現(xiàn)品種間內(nèi)生酵母菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異（R=0.026 2，P=0.356），但不顯著，組織間內(nèi)生酵母菌菌群結(jié)構(gòu)存在顯著性差異（R=0.386 0，P=0.001）。品種分組和組織分組對(duì)內(nèi)生酵母菌菌群結(jié)構(gòu)的差異均具有一定的解釋意義（stress=0.146、0.149）。

2.2.3 糯紅高粱內(nèi)生酵母菌群落結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)圖4可知，在門分類水平上，金糯粱1 號(hào)中豐度最高門類為未分類菌門（93.71%），青殼洋中豐度最高門類為子囊菌門（Ascomycota，42.42%）和擔(dān)子菌門（26.82%）。從組織分析，根部豐度最高門類為未分類菌門（74.32%），莖部和葉部豐度最高門類分別為擔(dān)子菌門（52.50%）和子囊菌門（54.01%）。在屬分類水平上，金糯粱1號(hào)中相對(duì)豐度最高的屬為未分類菌屬（93.41%）；青殼洋中相對(duì)豐度占比大于4%的菌屬依次為未分類菌屬（30.73%）、鐮刀菌屬（Fusarium，19.39%）、絲孢酵母菌屬（Trichosporon，14.43%）和籃狀菌屬（Talaromyces，4.50%）；2個(gè)品種共有內(nèi)生酵母屬為29個(gè)。按照組織而言，根中優(yōu)勢(shì)屬為未分類菌屬（74.32%），絲孢酵母菌屬（27.62%）是莖部?jī)?yōu)勢(shì)屬，刺盾炱目未分類屬（unclassified Chaetothyriales，27.27%）是葉部?jī)?yōu)勢(shì)屬。3個(gè)組織共有內(nèi)生酵母屬為枝孢菌屬（Cladosporium）、Cutaneotrichosporon、Pseudozyma、小球腔菌屬（Leptosphaeria）、Microsphaeropsis、Plectosphaerella、鐮刀菌屬、子囊菌門未分類屬和未分類菌屬。因此，苗期糯紅高粱內(nèi)生酵母的群落組成和相對(duì)豐度在品種和組織間存在明顯差異。

圖4 基于門（A、B）和屬（C、D）水平的糯紅高粱不同品種和不同組織內(nèi)生酵母菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Endophytic yeasts community structure analysis in different varieties and tissues of waxy sorghum based on phylum（A，B） and genus（C，D） level

2.2.4 糯紅高粱內(nèi)生酵母菌菌群差異分析 LEfSe多級(jí)物種層級(jí)分析結(jié)果顯示（圖5），刺盾炱目未分類科和屬在金糯粱1 號(hào)中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)；微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）在青殼洋中具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。按照組織分類，根中糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、Nectriaceae 等12 個(gè)菌類占相對(duì)優(yōu)勢(shì)；Pichiaceae、擔(dān)子菌門和Pichia等8個(gè)菌類在莖部樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)；Tremellales、Rhynchogastremataceae、囊擔(dān)菌屬等6 個(gè)菌類在葉部樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)，且這26 個(gè)菌類在不同組織間存在明顯差異。

圖5 糯紅高粱不同品種（A）和不同組織（B）內(nèi)生酵母菌菌群差異分析Fig.5 Microbial community difference analysis of endophytic yeasts in different varieties（A）and tissues（B） of waxy sorghum

2.2.5 糯紅高粱內(nèi)生酵母菌菌群功能差異分析 基于FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)解析高粱2個(gè)品種和3個(gè)組織內(nèi)生酵母菌的營(yíng)養(yǎng)型和生態(tài)功能類別，僅選擇可信等級(jí)為“可能”和“極可能”的OTU 和分類單元進(jìn)行分析。由表4 可知，內(nèi)生酵母菌營(yíng)養(yǎng)模式可分為6 種，分別為病理型、腐生型、共生型、病理-腐生型、病理-共生型和腐生-共生型。同時(shí)可分為16 個(gè)生態(tài)功能群，金糯粱1 號(hào)和青殼洋共有營(yíng)養(yǎng)型5 種，共有生態(tài)功能群5 種，其中青殼洋獨(dú)有功能群相對(duì)多。按照組織分類，根、莖、葉共有營(yíng)養(yǎng)型2 個(gè)，共有生態(tài)功能群2 個(gè)。不同組織樣本獨(dú)有功能群存在差異，其中莖獨(dú)有功能群最多，葉獨(dú)有功能群最少，僅有“植物病理菌群”的Eballistra、“真菌寄生菌群”的囊擔(dān)菌屬。

表4 糯紅高粱不同品種和不同組織內(nèi)生酵母菌菌群功能結(jié)構(gòu)Table 4 Functional structure of endophytic yeasts in different varieties and tissues of waxy sorghum

3 討論

本研究基于純培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)，首次對(duì)苗期的糯紅高粱內(nèi)生酵母菌群展開(kāi)分析和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法僅分離到36株內(nèi)生酵母菌，優(yōu)勢(shì)屬為隱球菌屬，分離結(jié)果受品種和組織影響，相對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)，純培養(yǎng)方法具有一定局限性［21］。高通量測(cè)序雖檢測(cè)到隱球菌屬，但豐度較低，且發(fā)現(xiàn)存在大量未在純培養(yǎng)方法中獲得的內(nèi)生酵母菌。本研究通過(guò)2 種技術(shù)均顯示金糯粱1 號(hào)內(nèi)生酵母菌群落多樣性小于青殼洋，高粱莖部?jī)?nèi)生酵母菌群落多樣性大于根部和葉部，莖部與根部差異顯著，但韓毅強(qiáng)等［14］研究表明寒區(qū)高粱根部的內(nèi)生真菌群落豐富度和多樣性最高，這可能與研究材料和生長(zhǎng)環(huán)境差異有關(guān)。隸屬于擔(dān)子菌門和子囊菌門的酵母菌可棲居在多種極端環(huán)境中，許多純培養(yǎng)相關(guān)報(bào)道獲得的內(nèi)生酵母菌屬于這兩大門類［22］，本研究也顯示類似結(jié)果。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同組織擔(dān)子菌門和子囊菌門酵母菌數(shù)量存在差異，如葉部純培養(yǎng)內(nèi)生酵母中擔(dān)子菌門菌株數(shù)多于子囊菌門菌株，與Khunnamwong 等［23］和Into 等［24］研究一致，但高通量測(cè)序結(jié)果顯示，葉部擔(dān)子菌門酵母菌株數(shù)略低于子囊菌門，可能與分離培養(yǎng)設(shè)置條件較少有關(guān)，后續(xù)還應(yīng)展開(kāi)探討。糯紅高粱中還發(fā)現(xiàn)了隱球菌屬、擲孢酵母菌屬和紅酵母屬、Saccharomyces和Pichia等較為常見(jiàn)且研究相對(duì)多的內(nèi)生酵母屬［25］，紅酵母屬能通過(guò)產(chǎn)生大量類胡蘿卜素抵抗外界不良環(huán)境［6］。Saccharomyces可直接影響酒類產(chǎn)量和風(fēng)味［26］，被應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、生物能源等領(lǐng)域。Pichia能利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乙酸、乙酸乙酯及高級(jí)醇等風(fēng)味物質(zhì)［27］。羅方雯等［28］通過(guò)純培養(yǎng)法和高通量技術(shù)從茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造大曲和環(huán)境中篩選到紅酵母屬、隱球菌屬、Saccharomyces和Pichia等酵母菌，與本研究獲得的菌株有相同之處。高通量測(cè)序分析菌群結(jié)構(gòu)可知，金糯粱1 號(hào)和根部未知類占比較大，說(shuō)明該品種和根部有較多未知內(nèi)生酵母菌資源有待深入挖掘，部分未能清晰定性到屬種的酵母菌，將展開(kāi)深入解析研究。

FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，不同品種和不同組織間獨(dú)有功能群數(shù)差異較大。借助生物多樣性保險(xiǎn)效應(yīng)理論［29］，內(nèi)生酵母營(yíng)養(yǎng)型功能為宿主適應(yīng)外界不良環(huán)境和形成特異品質(zhì)提供可能［30］。青殼洋獨(dú)有功能群多于金糯粱1 號(hào)，莖獨(dú)有功能群最多，這與被研究品種特征差異較大是相一致的，但相關(guān)機(jī)制還需深入探討。值得注意的是，F(xiàn)UNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)僅將絲孢酵母菌屬和Beauveria2 個(gè)屬定義為動(dòng)物病原菌。已有研究顯示某些動(dòng)物病原菌可跨界侵染不同生物寄主，如高通量分析測(cè)定的籃狀菌屬，它可引起人類出現(xiàn)暗色絲孢霉?。?1］，因此該菌株應(yīng)被定義為動(dòng)物病原菌群。擲孢酵母菌屬被定義為病原-腐生菌，存在于葉和莖中，部分研究表明擲孢酵母菌屬可從蘋果、葡萄等植株的葉片、花和果實(shí)中分離得到，造成植物出現(xiàn)病變，但又是促進(jìn)生物體抗性增加的調(diào)控因子［32］。病理型功能群在高粱組織中菌株數(shù)排序?yàn)榍o＞葉＞根，表明病理型功能群在生長(zhǎng)旺盛的組織中菌株數(shù)較多，可能因莖和葉片具有較高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)［33］。腐生型功能菌群在根部占比較高，推測(cè)可能由于土壤中腐生菌群種類繁多，根長(zhǎng)期直接接觸土壤引起腐生型功能菌群的轉(zhuǎn)移［34］，且腐生型真菌可產(chǎn)生一系列水解酶和氧化酶，有助于碳水化合物的分解，與有機(jī)物分解和養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)密切，后續(xù)可隨著純培養(yǎng)功能菌株的深入發(fā)掘，進(jìn)一步明確糯紅高粱內(nèi)生酵母菌的功能。

內(nèi)生酵母主要依靠新陳代謝與分泌胞外酶等方式適應(yīng)宿主環(huán)境［35］，同時(shí)胞外酶能穩(wěn)定存在于常溫環(huán)境中，具有較高催化能力。目前，已有研究對(duì)產(chǎn)不同胞外酶的內(nèi)生酵母菌進(jìn)行分離純化并投入應(yīng)用［36］。本試驗(yàn)中，36 株酵母菌有17 株至少產(chǎn)生1 種及1 種以上的胞外酶，其中金糯粱1 號(hào)株數(shù)明顯多于青殼洋株數(shù)，具有產(chǎn)胞外脂肪酶功能的菌株最多，產(chǎn)淀粉酶、果膠酶和纖維素酶的菌株數(shù)最少。這與李治瀅等［37］對(duì)云南異龍湖中酵母菌篩選產(chǎn)胞外酶活性結(jié)果部分相似，該研究也發(fā)現(xiàn)82 株具有產(chǎn)胞外酶功能的菌株中產(chǎn)脂肪酶的最多，說(shuō)明糯紅高粱中存在可水解脂類、淀粉、果膠、纖維素、蛋白質(zhì)等天然化合物的酵母菌，參與植株?duì)I養(yǎng)吸收和有機(jī)物循環(huán)，具有重要的生態(tài)功能。

4 結(jié)論

采用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)法和高通量測(cè)序法研究了宜賓地區(qū)釀酒專用糯紅高粱不同品種和不同組織中內(nèi)生酵母菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明，不同品種和組織中蘊(yùn)含豐富的內(nèi)生酵母菌資源，具有極大的功能多樣性。不同品種和不同組織的酵母菌群落多樣性和組成存在差異和共性，其中雜交種金糯粱1 號(hào)群落多樣性小于地方種青殼洋，莖部?jī)?nèi)生酵母菌群落多樣性大于根部和葉部，但金糯粱1 號(hào)和根部存在更多未知和不可培養(yǎng)菌種。后續(xù)應(yīng)加大測(cè)序深度和優(yōu)化可培養(yǎng)條件獲得更多有利微生物資源，并對(duì)功能性菌株開(kāi)展應(yīng)用研究。