電子加速器源射線對小麥根尖染色體及生理特性的影響

管翊君 王 浩 呂美澄 白俊青 唐 燕 周春菊李 奎， 呂金印，

（1西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100；2楊凌核盛輻照技術(shù)有限公司，陜西 楊凌 712100）

小麥是我國第二大谷類作物，隨著全球氣候和環(huán)境變化，提高小麥產(chǎn)量對我國保障糧食安全及社會穩(wěn)定有重要意義［1］。在小麥新品種培育過程中，傳統(tǒng)育種方式突變率低，而人工誘變將植物的突變率提高了10～1 000 倍［2］，其中輻射育種周期短、突變率較高、擴大突變譜同時能夠突破原有基因庫的限制，產(chǎn)生更多樣的突變表型［3-4］。因此，利用輻射誘變育種創(chuàng)制作物新品種的優(yōu)勢明顯［5］，育種進程加快，開啟了作物改良的新紀元［6］。

輻射誘變育種是指利用物理輻射源處理植物材料，誘導植物的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，直接或間接地育成可供生產(chǎn)利用的新品種。輻射誘變包括電離輻射（γ、β、X 射線等）和非電離輻射（激光、紫外線等）。目前，應(yīng)用較廣的是γ射線［7］，王澤港等［8］采用γ射線輻射處理小麥種子，結(jié)果表明劑量越大，苗高越低、生長受抑制的程度越明顯；陳金躍等［9］采用137Cs-γ 處理玉米種子，其苗高和根系的生長受到抑制，并且發(fā)現(xiàn)玉米的半致死劑量小于450 Gy；李春牛等［10］采用60Co-γ 處理茉莉花果實，發(fā)現(xiàn)高劑量輻射可使茉莉花葉片中抗氧化酶活性下降。除此之外，紫外線、激光和混合離子場等誘變源的研究也有報導［11-13］。劉瑞媛等［14］研究表明，高能重離子束能夠沿著粒子路徑緊密地形成在局部區(qū)域，能量傳遞線密度較高，對目標生物的DNA 和蛋白質(zhì)等分子造成嚴重破壞；譚瑗瑗等［15］利用高能碳離子束輻射水稻發(fā)現(xiàn)并獲得粳稻兩系不育系江79S；王雪等［16］采用碳離子束輻射處理大豆，結(jié)果表明大豆M1代葉綠素及丙二醛含量低于M2代；王鵬［17］采用紫外線處理小麥種子，發(fā)現(xiàn)處理后的小麥生長發(fā)育遲緩，具有“翹根”現(xiàn)象；崔玲艷等［18］利用紫外線輻射處理馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)低劑量的輻射對馬鈴薯的生長不會產(chǎn)生危害，適當增加輻射劑量能夠提高植株抗氧化酶活性及次生代謝產(chǎn)物。

電子加速器的射線主要包括電子束、電子照射在傳輸鏈及貨物后發(fā)生韌致輻射產(chǎn)生的X 射線和光中子［19］。電子加速器所產(chǎn)生的射線作為輻射源用于誘變育種，可通過調(diào)節(jié)與射線源距離控制劑量率，調(diào)整輻射時間控制輻射總劑量，射線利用率更高，成本更低，安全性更強，不產(chǎn)生放射性廢物［20-22］。楊震等［23］采用電子束輻射處理水稻，并與傳統(tǒng)60Co-γ 輻射進行比較，結(jié)果表明兩種輻射方法對水稻的影響接近，而電子束輻射易于控制，可重復性更強。

目前，電子束輻射在植物育種中的研究相對較少，對不同輻射劑量處理下小麥的生長發(fā)育過程的影響機理以及輻照適宜劑量仍不明確。鑒于此，本研究采用電子加速器所產(chǎn)生的源射線輻射處理小麥種子，分析不同劑量輻射處理下水培小麥幼苗葉片抗氧化酶活性等生理與生長特性，觀察根尖染色體形態(tài)變化，篩選合適的輻射劑量，以期為闡明電子束輻射誘變機理、拓寬小麥育種途徑及農(nóng)作物物理誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 輻射處理 試驗選用小麥品種為普冰151，由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院張正茂教授提供。挑選籽粒飽滿、大小均勻的的小麥種子分為3 組，每組500 g，對照組未輻射，處理組使用DZ 型10 MeV 電子直線加速器（中廣核輻照技術(shù)有限公司）進行輻射處理，輻射劑量分別為0、200、400 Gy，劑量率為1 Gy·min-1。

1.1.2 水培小麥幼苗 輻射處理后的小麥種子在75%酒精溶液中消毒10 min 后用蒸餾水沖洗5～8 次，擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，用紗布覆蓋，使培養(yǎng)皿保持濕潤狀態(tài)，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)。萌發(fā)3 d 后，將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中進行光照培養(yǎng)，每隔2 d更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)箱條件：光照強度為80 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度為22 ℃，光照周期為光/暗：16 h/8 h。待小麥長至兩葉一心期時取樣用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗生長特性的測定 將消毒后的種子轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，每日觀察種子的發(fā)芽情況，7 d后按照公式計算種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=第7 天種子正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢=每一天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

萌發(fā)3 d后的種子移至培養(yǎng)液中，水培10 d后利用直尺測量法測量小麥的株高和根長；利用天平稱量法測量鮮重；利用烘箱將幼苗烘至恒重后使用天平對地上和地下生物量進行稱重，其中地上生物量為小麥葉片，地下生物量包括種子內(nèi)未被完全降解、利用的儲藏物質(zhì)及小麥根部。每個指標隨機選取10 株幼苗用于統(tǒng)計分析。

1.2.2 生理指標的測定 葉綠素含量（chlorophyl，Chl）測定采用80%丙酮提取比色法。稱取小麥新鮮葉片0.2 g，用剪刀剪成細絲狀后放入裝有15 mL 80%的丙酮的具塞試管中，黑暗處過夜提取至葉片變?yōu)榘咨?，隨后過濾。以80%丙酮為空白對照，分別在663 和645 nm 下測定過濾后得到的葉綠素提取液吸光值。每個處理設(shè)3個生物學重復。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。稱取小麥新鮮葉片0.3 g，在預(yù)冷過的研缽中加入適量石英砂和2 mL 0.05 mol·L-1pH值7.8 的磷酸緩沖液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加入5 mL 0.5% 硫代巴比妥酸溶液搖勻。沸水浴10 min 后迅速冷卻，3 000 r·min-1離心15 min，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白，測定上清液在532、600、450 nm處的吸光值。每個處理設(shè)3個生物學重復。

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250 法。稱取小麥新鮮葉片0.2 g，以2 mL 0.05 mol·L-1pH 值7.8 的磷酸緩沖液為提取液在研缽中研磨至勻漿，5 000 r·min-1離心10 min。取0.9 mL 上清液加入考馬斯亮藍G-250 溶液2.5 mL，充分混勻后靜置2 min，在595 nm 下測量吸光值，空白對照為加入考馬斯亮藍G-250的磷酸緩沖液。每個處理設(shè)3個生物學重復。

超氧陰離子測定采用NBT 染色法。取5片新鮮小麥葉片，用蒸餾水沖洗干凈，擦干放入裝有氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）染液的具塞試管中，22 ℃條件下避光染色9 h，至陽性部位出現(xiàn)深藍色，其他部位為淡藍色或不變色。將染色葉片浸入95%乙醇制成的脫色液中，95 ℃中將未染色部分脫色至白色，蒸餾水沖洗干凈后拍照。

抗氧化酶活性測定：稱取小麥新鮮葉片0.3 g，在預(yù)冷過的研缽中加入適量石英砂和2 mL 0.05 mol·L-1pH 值7.8 的磷酸緩沖液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r·min-1離心10 min，上清即為酶液。采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，取0.2 mL 上清液加入2 mL 磷酸緩沖液、0.5 mL 愈創(chuàng)木酚溶液、0.2 mL 30%的H2O2溶液于試管中，每隔1 min 測定470 nm 下吸光值，共測3 次；采用氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，取0.2 mL 上清液加入2.7 mL 甲硫氨酸溶液、0.6 mL 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液、0.1 mL核黃素溶液于試管中，在5 000 lux 的光照培養(yǎng)箱中光照20 min 后，遮光保存，測量560 nm 下吸光值；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，取0.2 mL 上清液加入2 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液、0.3 mL 30%的H2O2于試管中，每隔1 min 測定240 nm 下吸光值，共測3 次。每個處理設(shè)3個生物學重復。

以上測定方法均參照《植物生理學實驗指導》［24］，并稍有改進。

1.2.3 小麥根尖細胞染色體觀察 小麥根尖臨時裝片的制備方法參考王明玉等［25］的方法并有所改進。萌發(fā)的小麥根長至約2.0 cm 時切下約1.0 cm 根尖，在95%乙醇和冰乙酸以3∶1 比例配成的卡諾固定液中4 ℃下固定24 h后取出。蒸餾水洗滌3次，轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的酸解液（1 mol·L-1HCl），60 ℃條件下酸解8～10 min。蒸餾水洗滌3 次，吸干根尖表面水分，在石碳酸復紅染液中染色10 min，切取根尖分生組織，放置于載玻片上，蓋上蓋玻片，用鑷子敲至霧狀后鏡檢。每個劑量觀察14 個根尖，每個根尖選取70 個細胞進行統(tǒng)計，每個處理選取根尖細胞1 000 個。按下列公式計算有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率和微核率：

有絲分裂指數(shù)=有絲分裂細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100%

染色體畸變率=染色體畸變細胞數(shù)/有絲分裂細胞數(shù)×100%

微核率=微核細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)首先使用Excel 2013 進行分析，用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001和P＜0.000 1水平的t檢驗方法進行顯著性分析，采用Graphpad Prism 7.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子加速器源射線對小麥生長特性的影響

不同輻射劑量處理下小麥種子發(fā)芽率無顯著差異（圖1-A）。開始萌發(fā)時，與對照相比，輻射處理種子發(fā)芽勢較低，隨著輻射處理劑量的增加，萌發(fā)第1 天發(fā)芽勢分別下降49.0 和60.06 個百分點；萌發(fā)第2 天發(fā)芽勢分別下降16.88 和27.54 個百分點；第3 天后各輻射劑量下發(fā)芽勢無明顯差異（圖1-B）。表明開始時種子的生活力隨輻射劑量增加而減弱，即高劑量的輻射處理可以延緩小麥種子的發(fā)芽。

隨著輻射劑量的增加，小麥幼苗株高和根長顯著降低（P＜0.000 1，圖2），200 Gy處理下小麥幼苗株高和根長與對照組相比分別降低49.67%和74.79%；400 Gy處理下分別降低了81.32%和89.67%說明輻射處理對小麥的生長有抑制作用，其中400 Gy 嚴重影響小麥幼苗的正常生長。

圖2 不同劑量輻射處理對小麥幼苗株高與根長的影響Fig.2 Effects of different doses of irradiation on plant height and root length of wheat seedlings

輻射處理后，水培10 d 小麥的鮮重和地上生物量與對照組相比均有降低（圖3）。200 Gy 處理下，小麥幼苗的鮮重和地上生物量分別降低50.93%和59.27%；400 Gy 處理下小麥幼苗的鮮重和地上生物量分別降低62.01%和75.26%。表明隨著輻射劑量的增加，小麥幼苗的生長隨之減緩，而地下生物量與對照組相比有小幅上升，分別升高12.89% 和23.22%。表明高劑量輻射處理下小麥種子的營養(yǎng)物質(zhì)向地上的轉(zhuǎn)化和運輸受到明顯抑制，因而表現(xiàn)在影響生長。

圖3 不同劑量輻射處理對小麥幼苗生物量的影響Fig.3 Effects of different doses of irradiation on the biomass of wheat seedlings

2.2 電子加速器源射線對小麥生理特性的影響

輻射處理下小麥葉片中SOD活性隨輻射劑量增加而降低，POD 活性和CAT 活性隨輻射劑量增加呈先升后降趨勢（圖4）。與對照組相比，200 Gy 處理下葉片中POD活性和CAT活性分別升高89.77%和171.01%，SOD活性降低34.91%；400 Gy處理下POD活性和CAT活性分別升高59.74% 和37.69%，SOD 活性降低45.45%。由此可見，POD、CAT 為輻射處理后小麥幼苗清除活性氧的主要要抗氧化酶。

圖4 不同劑量輻射處理對小麥葉片抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of different doses of irradiation on antioxidant enzyme activity in wheat leaves

隨著輻射劑量增大，葉綠素a和葉綠素b含量均呈降低趨勢（圖5）。與對照組相比，200 Gy 處理下小麥葉片中葉綠素a 與葉綠素b 含量分別降低42.55%和28.03%；400 Gy 處理下小麥葉片葉綠素a 與葉綠素b含量分別降低54.69%和54.44%。與200 Gy 處理相比，400 Gy處理下小麥葉片中葉綠素a與葉綠素b含量分別降低21.13%和36.70%。

圖5 不同劑量輻射處理對小麥葉片葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of different doses of irradiation on chlorophyll content of wheat leaves

隨著輻射劑量的增大，小麥葉片中可溶性蛋白、MDA 和H2O2含量呈上升趨勢（圖6）。與對照相比，200 Gy 處理下小麥葉片中可溶性蛋白、MDA、H2O2含量分別升高63.20%、44.85%和120.64%；400 Gy處理下小麥葉片中可溶性蛋白、MDA、H2O2含量分別升高102.45%、75.36%和175.78%。

圖6 不同劑量輻射處理對小麥幼苗生理特性變化的影響Fig.6 Effects of different doses of irradiation on physiological characteristics of wheat seedlings

隨輻射劑量的增加，葉片超氧陰離子劑量升高（圖7）。對照組中超氧陰離子含量較低，未發(fā)現(xiàn)明顯染色部分，但200與400 Gy處理下可見藍色色斑明顯增大、增多。說明高劑量的輻射導致超氧陰離子積累。

圖7 不同劑量輻射處理對小麥葉片超氧陰離子含量的影響Fig.7 Effects of different doses of irradiation on the content of superoxide anion in wheat leaves

2.3 電子加速器源射線對小麥根尖細胞染色體的影響

輻射處理下小麥根尖細胞染色體發(fā)生斷裂、染色體未排列在赤道板、染色體滯后、染色體橋、多極分裂及微核等突變現(xiàn)象（圖8）。

圖8 不同劑量輻射處理對小麥根尖染色體畸變的影響Fig.8 Effects of different doses of irradiation on chromosome aberration of wheat root tip

與對照組相比，隨著輻射劑量增加，200 Gy處理下小麥根尖細胞染色體畸變率、微核率分別升高6.80 和6.02 個百分點，有絲分裂指數(shù)降低4.37 個百分點；400 Gy 處理下小麥根尖細胞染色體畸變率、微核率分別升高16.19 和14.22 個百分點，有絲分裂指數(shù)降低6.00 個百分點。表明輻射對染色體根尖有絲分裂有抑制作用，對染色體畸變有促進作用，通過影響根尖細胞正常分裂，抑制小麥幼苗正常生長。

3 討論

植物的遺傳變異特性最終通過植株的表型生長性狀體現(xiàn)。本研究中電子加速器源射線對小麥種子的發(fā)芽率影響不明顯，但隨著輻射處理劑量的增加，小麥發(fā)芽及生長減緩，幼苗株高、根長、地上生物量及鮮重均呈現(xiàn)下降趨勢，而地下生物量略有上升，表明高劑量（400 Gy）輻照處理下小麥幼苗的生長受到抑制，可能是萌發(fā)過程中種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)向外轉(zhuǎn)運減少，胚芽生長延緩。

植物細胞中丙二醛（MDA）含量可反映細胞膜受傷害程度，葉綠素和可溶性蛋白含量則分別是反映光合與滲透調(diào)節(jié)代謝的重要指標。本試驗中隨著輻射劑量的增加，小麥幼苗MDA 和可溶性蛋白含量增加，葉綠素和含量降低，這與李永鋒［26］和韓榕等［27］輻射處理小麥的研究結(jié)果一致，說明電子束輻射處理小麥后引起細胞膜損傷及代謝紊亂，導致細胞中由多種酶系構(gòu)成的非膜結(jié)合蛋白合成體系被激活，葉綠素合成受阻，對植物光合作用產(chǎn)生了不利影響。

正常生長的植物細胞體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，而逆境下這種平衡被打破。本研究中隨著輻射劑量的增加，小麥幼苗細胞中H2O2和超氧陰離子含量升高，表明輻射導致體內(nèi)大量活性氧積累，細胞膜產(chǎn)生不可逆的氧化損傷。此外，隨著輻射劑量的增加，SOD 活性持續(xù)降低；在200 Gy 輻射下CAT 和POD活性呈現(xiàn)上升趨勢，400 Gy輻射下該酶活性略降，但仍大于對照組。說明低劑量（200 Gy）輻射處理下，細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧主要通過刺激CAT 和POD 活性來清除，以提高自身防御能力，保護細胞膜的完整性和正常代謝；但高劑量（400 Gy）輻射處理下，小麥葉片細胞膜損傷加劇，影響正常的生理代謝，導致抗氧化酶活性降低。綜上所述，相對而言，200 Gy可作為為電子加速器源射線處理小麥的的參考劑量。

細胞染色體是遺傳物質(zhì)的載體，植物的遺傳變異也體現(xiàn)在染色體的形態(tài)變化。本研究中在觀察小麥根尖染色體時發(fā)現(xiàn)，200、400 Gy處理下，細胞有絲分裂指數(shù)分別下降4.37 和6.00 個百分點，畸變率分別升高6.80和16.19個百分點，微核率分別升高6.02和14.22個百分點，表明電子束輻射不僅能提高染色體畸變的頻率，同時也可獲得大量染色體畸變的類型，輻射劑量越大，對根尖細胞染色體的損傷越大。陸璃等［28］在γ輻射小麥的研究中指出，γ 輻射能夠誘變小麥根尖染色體畸變，微核率也隨輻射劑量增加而升高，與本研究結(jié)果相符。由此可見，高劑量輻射處理小麥種子抑制小麥生長，對小麥根尖細胞染色體造成了損傷，表明尖有絲分裂、提高染色體畸變率從而提高小麥的突變頻率。綜上所述，眾多的變異類型則為品種選育增加新材料和新的遺傳資源，為創(chuàng)制新品種提供可能。

本試驗僅限于實驗室水培植株，處理劑量有限，而在后續(xù)的研究中還應(yīng)結(jié)合大田小區(qū)試驗，通過觀察小麥的生長表型，篩選有益突變體，縮短育種周期，提高育種效率。

4 結(jié)論

隨著輻射劑量的增加，突變一代（M1）代小麥幼苗生長發(fā)育在一定程度上受到抑制和損傷，生長發(fā)育減慢，葉綠素含量降低，MDA 含量增高。輻射處理減少了小麥根尖細胞有絲分裂指數(shù)，減緩小麥根尖增長速率，增加小麥根尖細胞畸變率及微核率。本試驗選取的輻射劑量中，200 Gy 可作為電子加速器源射線輻射小麥誘變育種的參考劑量。