17種精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果試驗

岳治光，趙聰，溫俊奇，孫小帥，許新春，劉喜恒

（1.河南安進生物工程有限公司，河南 駐馬店 463800；2．上蔡縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，河南 駐馬店 463800）

輪蟲（Rotifer），屬水生多細胞原生動物，富含幼苗必需的氨基酸和不飽和脂肪酸，是魚、蝦、蟹類苗期的天然餌料。但輪蟲大量繁殖并攝食藻類，會導(dǎo)致水體達不到“肥、活、嫩、爽”的養(yǎng)殖標準，其代謝產(chǎn)生大量有機物，引起水中氨氮、亞硝酸鹽氮升高；輪蟲大量死亡后分解，滋生的細菌和真菌會污染水體，其泛濫極易發(fā)生翻塘事件，在我國黃河流域的精養(yǎng)塘危害比較嚴重[1]，部分魚塘因此荒廢。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要使用化學(xué)藥品防治輪蟲，但藥品往往具有廣譜性，對微藻和其他水生生物亦會產(chǎn)生毒性，不適于浮游動物污染控制[2-4]。植物成分的殺蟲劑，具有低毒、低殘留、易降解、與環(huán)境兼容性好的特點，一般被認為是化學(xué)藥品的潛在替代品[5]?，F(xiàn)以褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）（以下簡稱輪蟲）為研究對象，探究17種植物精油對其殺滅效果，篩選出安全高效、純天然的輪蟲防控藥物，為生產(chǎn)中防治輪蟲技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年8 月，試驗地位于鄭州某實驗室。

1.2 材料

1.2.1 輪蟲

試驗用輪蟲購自上海某微生物培養(yǎng)機構(gòu)，由單個孤雌生殖雌體馴化培養(yǎng)2 個月后，大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)其種群產(chǎn)生休眠卵孵化而來[6]。

1.2.2 試劑及儀器

丁香酚（98%，20220603）、檸檬醛（94.5%，20220522）、側(cè)柏酮（92%，20220603）、香葉醇（98%，20220603）、薄荷醇（20220211）購自江西新森化工有限公司；石竹烯（87%，D887045）、檸檬烯（98%，E809010）、桉葉素（96%，E879023）、百部堿（88%，B807765）、松油醇（98%，E595432）、香芹酚（99%，C234255）、肉桂醛（99%，B328976）、香茅醛（98%，B234432）、水楊酸甲酯（99%，D998355）、廣藿香醇（90%，Z228482）、姜辣素（84%，B223552）、大蒜素（Allicin）（82%，B225112）購自廣州安奈生物科技有限公司。除癩靈（含辛硫磷10%）購自河南安進生物技術(shù)股份有限公司；三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（分析純）、正丁醇（分析純）均購自天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；體式顯微鏡（ZX500TR）購自深圳市眾尋光學(xué)儀器有限公司；分析天平（AuW120D）購自日本SHIMADZU 儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 17種植物精油對輪蟲的殺滅效果預(yù)試驗

精確稱取相應(yīng)植物精油500 mg 置于100 mL容量瓶中，后加入4 mL 三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（乳化劑）及1 mL 正丁醇（助劑），加去離子水定容至100 mL，即得到5 g/L 濃度的相應(yīng)精油微乳液母液（設(shè)不添加精油成分的溶劑對照組）。取各相應(yīng)精油微乳液母液加入去離子水，將其稀釋（溶劑對照組同比例稀釋），每個處理組分別稀釋到1，10，100 和1 000 mg/L 4 個梯度。吸取1 mL 相應(yīng)梯度的精油測試液，于細胞培養(yǎng)板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內(nèi)的輪蟲幼體，每組每個濃度均設(shè)3 個重復(fù)，設(shè)置相同濃度梯度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照。試驗在（25±1）℃無光的恒溫培養(yǎng)箱中進行，24 h 后于體視顯微鏡下觀察，并記錄每孔中輪蟲死亡數(shù)，以輪蟲頭冠纖毛和個體運動停止作為死亡標準。

1.3.2 精油急性毒性試驗

根據(jù)1.3.1 預(yù)試驗中殺滅效果較好的精油，取其母液分別稀釋至0.1，0.3，0.6，1.0，2.0，6.0 和10.0 mg/L 共7 個梯度，吸取1 mL 相應(yīng)濃度梯度的精油測試液于細胞培養(yǎng)板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內(nèi)的輪蟲幼體，每組每個濃度均設(shè)3 個重復(fù)，設(shè)置相同濃度梯度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照。試驗在（25±1）℃無光的恒溫培養(yǎng)箱中進行，24 h 后于體視顯微鏡下觀察，并記錄每孔中輪蟲死亡數(shù)，采用SPSS 17.0 軟件中Probit 法，計算各精油對輪蟲24 h 的半致死濃度（LC50）。

1.3.3 復(fù)篩精油應(yīng)用后輪蟲在24 h 內(nèi)死亡情況

根據(jù)1.3.2 的試驗結(jié)果，使用相應(yīng)精油微乳液母液，將其稀釋至其絕對致死濃度（LC100），吸取1 mL 相應(yīng)濃度梯度的精油測試液于細胞培養(yǎng)板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內(nèi)的輪蟲幼體，每組每個濃度均設(shè)3 個重復(fù)，設(shè)置絕對致死濃度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照，在（25±1）℃無光的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于5 min、2 h、6 h、12 h、24 h 時，觀察輪蟲死亡情況，記錄死亡數(shù)。

1.3.4 復(fù)篩精油對輪蟲群體增長防控效果評價

取對數(shù)生長期小球藻，接種至滅菌后的培養(yǎng)基內(nèi)，接種密度為3.0×106cells/mL。用孔徑為0.075 mm篩絹過濾擴大培養(yǎng)的輪蟲，過濾水沖洗3 遍后添加至3 L 藻液中，輪蟲接種密度為3～6 尾/mL。之后于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照條件L∶D=12 h∶12 h，待輪蟲適應(yīng)2 d 后，分別添加1.3.2經(jīng)過初篩的各植物精油至有輪蟲的培養(yǎng)液中，使各精油在其培養(yǎng)液中達到LC50，設(shè)未添加精油的輪蟲培養(yǎng)液作為空白對照組，LC50的辛硫磷為化藥對照組，每個處理設(shè)3 個重復(fù)。精油添加后，分別在1、3、5、7 d 時，取供試水體1 mL，使用浮游動物計數(shù)板統(tǒng)計輪蟲密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 軟件進行方差分析（one-way ANOVA），對于有統(tǒng)計學(xué)意義組與對照組相比較，進行Dunnett’s 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種植物精油對輪蟲的殺滅活性

17種植物精油4種濃度時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性見表1。由表1 可見，隨著濃度的降低，植物精油對輪蟲的殺滅活性也出現(xiàn)了不同程度的下降。為1 000 和100 mg/L 時，除對照組外，所有處理組均表現(xiàn)出100%對輪蟲殺滅活性；為10 mg/L時，百部堿、香葉醇、石竹烯、松油醇對輪蟲的殺滅率分別為（51.1±1.1）%，（42.2±2.2）%，（36.7±3.8）%和（34.5±2.2）%，而其他13種精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果均達到100%；在1 mg/L 下，不同種類精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果存在差異。其中，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、辛硫磷、香芹酚、大蒜素、肉桂醛對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性較強，其殺滅率分別為（93.3±1.9）%，（87.8±2.2）%，（85.5±2.2）%，（78.9±2.9）%，（78.9±4.0）%，（75.6±2.9）%和（71.1±2.2）%，均達到70%以上，高于同濃度下其他處理組，存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。其次為側(cè)柏酮（44.5±4.0）%、廣藿香醇（43.3±3.3）%、水楊酸甲酯（40.0±3.3）%，而檸檬醛、桉葉素、香茅醛及姜辣素對輪蟲殺滅率較弱，均不足40%，僅高于對照組，存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。另外，香葉醇、石竹烯、百部堿、松油醇在該濃度下未表現(xiàn)出對輪蟲的殺滅活性。同時2 個對照組在試驗中，褶皺臂尾輪蟲均未出現(xiàn)死亡。因此，選取抗輪蟲效果較好的丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素進入下一步試驗。

表1 17種植物精油4種濃度時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性① %

2.2 6種精油對輪蟲的滅殺效果

在2.1 試驗結(jié)果中，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素具有較強的對輪蟲的殺滅活性，因此以該6種精油開展急性毒性試驗，結(jié)果見表2。由表2 可見，通過對6種植物精油微乳液在24 h 時的致死中濃度進行比較，發(fā)現(xiàn)丁香酚、薄荷醇精油微乳液對供試輪蟲具有較強的毒力，其LC50分別為0.462 和0.548 mg/L，其殺滅活性均超過辛硫磷，毒力分別為辛硫磷的1.294 和1.091 倍；檸檬烯、香芹酚、大蒜素、肉桂醛精油微乳液的LC50分別為0.600、0.680，0.720 和0.841 mg/L，均高于辛硫磷（0.598 mg/L），毒力分別為辛硫磷的0.997、0.879、0.831 和0.711 倍。

表2 復(fù)篩精油為0.1～10.0 g/L 時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果

2.3 6種精油應(yīng)用后輪蟲在24 h 內(nèi)死亡情況

絕對致死濃度（LC100）下植物精油微乳液在24 h內(nèi)對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果見表3。由表3 可見，不同處理組對輪蟲的殺滅率隨時間的增加而增加，在用藥后5 min 時，所有處理組供試輪蟲未發(fā)現(xiàn)死亡；到2 h 時，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、辛硫磷組輪蟲開始出現(xiàn)死亡，死亡率分別為（40.0±3.3）%，（37.8±1.1）%，（28.9±2.9）%和（17.8±2.9）%，其中丁香酚、薄荷醇對輪蟲的殺滅率高于檸檬烯和辛硫磷，存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；在6 h 時，所有處理組輪蟲均不同程度死亡，其中丁香酚、薄荷醇精油微乳液供試輪蟲死亡率達100%，殺滅率顯著大于同時期其他處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其次為檸檬烯、辛硫磷、香芹酚處理組，輪蟲死亡率分別為（84.5±2.2）%，（65.5±2.2）%和（55.6±4.8）%，高于大蒜素（43.3±3.3）%和肉桂醛（42.2±2.2）%處理組，存在顯著差異（P＜0.05）；12 h 時，檸檬烯、辛硫磷處理組的輪蟲死亡率達到100%，而其他處理組的輪蟲死亡率也均高于70%，直至24 h 時，所有處理組供試輪蟲均全部死亡。

表3 絕對致死濃度（LC100）下植物精油微乳液在24 h 內(nèi)對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果① %

2.4 6種精油對輪蟲的群體增長的防控效果

輪蟲在不同精油處理后不同時間下的種群密度變化見表4。由表4 可見，各精油在其LC50時，隨著培養(yǎng)時間的延長，其體系內(nèi)的輪蟲密度均出現(xiàn)了不同程度的增加，其中以對照組增加幅度最大，從1 d 時的（6.67±1.20）ind/mL，增加至7 d時的（144.33±12.14）ind/mL。在用藥后1 d，所有精油處理組及化藥對照的輪蟲密度均小于空白對照組，存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；除空白對照組外，其他處理組的輪蟲密度均為0.5～1.5 ind/mL，相互之間沒有顯著差異；在第3 d 時，丁香酚、薄荷醇處理組的輪蟲密度分別為（1.67±0.67）和（2.33±0.88）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組，存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在第5 d 時，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯處理組的輪蟲密度分別為（6.33±0.67），（7.33±0.88）和（8.67±0.88）ind/mL，小于大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組；在第7 d 時，丁香酚處理組的輪蟲密度最小，為（12.0±1.52）ind/mL，小于其他處理組且存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其次為薄荷醇，輪蟲密度為（19.33±1.20）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組，存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 輪蟲在不同精油處理后不同時間下的種群密度變化①

3 討論

輪蟲是單細胞藻類的重要敵害生物，由于藻細胞生長繁殖速度快，如果輪蟲的數(shù)量不多，吞食量不大，影響并不嚴重；但當輪蟲繁殖數(shù)量增多時，吞食量也增大，便會對藻類及魚蝦產(chǎn)生嚴重的危害。目前，化學(xué)防治被認為是消滅輪蟲的可行且有效的方法，一些試劑如甲苯、己烷和二甲苯，被證明對萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲有高毒性[7]，但它們具有廣譜性，也可能傷害藻類和其他水生生物；一些抗生素對輪蟲也具有一定殺滅效果。孫帆等[8]采用鹽酸四環(huán)素對萼花臂尾輪蟲進行了急性毒性試驗，將其在質(zhì)量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 和80.0 mg/L 的環(huán)境下培養(yǎng)，結(jié)果表明，鹽酸四環(huán)素的LC50為120.055 mg/L；朱韓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，畜禽常用的抗生素諾氟沙星在不同藻密度下，對萼花臂尾輪蟲表現(xiàn)出不同的殺滅活性諾氟沙星在1.0×106、2.0×106和4.0×106cells/mL 藻密度下的LC50分別為452.873，525.146 和526.650 mg/L；翟盼等[10]研究了質(zhì)量濃度為10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 和35.0 mg/L 的利福平，對萼花臂尾輪蟲的急性毒性，當藻的密度為1.0×106cells/mL 時，其LC50為18.000 mg/L。大部分抗生素本身成本較高，不適合大規(guī)模使用。合成化學(xué)農(nóng)藥如有機磷和擬除蟲菊酯，常被用來防治輪蟲，甲基對硫磷和二嗪農(nóng)可以降低輪蟲物種的種群增長率[11-14]，其他合成化學(xué)農(nóng)藥如噻吩甲甲基，甲胺磷和殺螟松對萼花臂尾輪蟲的種群生長和產(chǎn)卵則表現(xiàn)出抑制作用[15-17]?；瘜W(xué)控制劑雖然方便、成本低，但也存在弊端，所使用的化學(xué)物質(zhì)有可能被藻類吸收，同時化藥成分可持續(xù)存在于養(yǎng)殖水體中污染水體。由于化學(xué)殺蟲劑的種種局限性，從植物中尋找環(huán)境友好、安全性高、殘留量低、使用經(jīng)濟的輪蟲防控藥物的研究與開發(fā)具有廣闊前景，但目前關(guān)于植物源輪蟲殺滅藥物的研究相對較少。黃園[18]研究了苦皮藤素、印楝素、苦參堿和川楝素對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性，結(jié)果顯示，苦皮藤素和苦參堿表現(xiàn)出了對褶皺臂尾輪蟲的高毒性，其LC50分別為0.175、0.061 mg/L，而印楝素（18.386 mg/L）和川楝素（2.132 mg/L）的毒力要明顯弱于前者。

4 結(jié)論

采用不同濃度的17種植物精油，對輪蟲的殺滅活性進行了試驗。結(jié)果表明，檸檬烯、丁香酚、大蒜素、香芹酚、肉桂醛、薄荷醇對輪蟲的殺滅效果優(yōu)于其他精油，其中薄荷醇和丁香酚，對輪蟲具有急性毒性，當濃度為LC100時，可在12 h 內(nèi)殺滅全部供試輪蟲，其毒力高于辛硫磷，在實驗室條件下，可以有效抑制輪蟲的種群增長。