寬皮柑橘褐斑病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

楊勝男，程莉，談月霞，朱延松，江東

寬皮柑橘褐斑病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

楊勝男，程莉，談月霞，朱延松，江東

西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712

【目的】挖掘?qū)捚じ涕俸职卟】剐曰蚣翱共≠Y源中的相關(guān)基因型，為柑橘品種抗褐斑病改良提供依據(jù)?！痉椒ā吭谙那飪杉緦?duì)136份寬皮柑橘離體葉片進(jìn)行褐斑病病菌接種試驗(yàn)，將兩次試驗(yàn)結(jié)果取交集，得到121份寬皮柑橘的褐斑病感抗結(jié)果。用121份寬皮柑橘表型對(duì)前人開發(fā)的CAPS進(jìn)行驗(yàn)證，再對(duì)這121份寬皮柑橘的表型結(jié)果與利用簡(jiǎn)化基因組獲得的SNP基因型結(jié)果進(jìn)行主成分分析、GWAS分析和Fst分析，獲得寬皮柑橘褐斑病抗性相關(guān)SNP位點(diǎn)。對(duì)通過(guò)GWAS獲得的SNP進(jìn)行基因型分析，在所有候選SNP的上下游25 kb范圍內(nèi)選取候選基因，根據(jù)phytozome注釋對(duì)候選基因進(jìn)行篩選。在感病資源‘秤砣紅橘’和抗病資源‘新克里曼丁’接種褐斑病病菌24、48和72 h后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選出的基因進(jìn)行表達(dá)量分析?！窘Y(jié)果】發(fā)現(xiàn)在121份寬皮柑橘中，溫州蜜柑和克里曼丁類等67份資源表現(xiàn)抗褐斑病，大部分紅橘和椪柑等54份資源感褐斑病。本研究發(fā)現(xiàn)前人開發(fā)的CAPS準(zhǔn)確率為76.86%，其相關(guān)性為中等程度相關(guān)。以-log10(P)＞4.5為標(biāo)準(zhǔn)，GWAS篩選出6個(gè)強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNP；以Fst＞0.38為標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)st篩選出8個(gè)SNP。GWAS篩選出的6個(gè)SNP的基因型與寬皮柑橘抗褐斑病表現(xiàn)為強(qiáng)相關(guān)，其中位于3號(hào)染色體上24 838 146 bp位置處的SNP1基因型對(duì)寬皮柑橘抗褐斑病區(qū)分能力最強(qiáng)。從14個(gè)SNP中篩選出、、、和等5個(gè)基因。這5個(gè)基因在‘秤砣紅橘’接種病原菌后表達(dá)量上調(diào)，且都在48 h后表達(dá)量達(dá)到最高，上調(diào)倍數(shù)高達(dá)90倍。【結(jié)論】通過(guò)GWAS挖掘出3號(hào)染色體上24 838 146 bp位置的SNP與寬皮柑橘褐斑病抗病性相關(guān)性最顯著，相關(guān)系數(shù)為0.641。并且該位置的基因型能比較有效地將抗性資源和感病資源進(jìn)行區(qū)分。挖掘到、、、、等5個(gè)調(diào)控寬皮柑橘抗褐斑病的候選基因。

寬皮柑橘；褐斑病；分子標(biāo)記；全基因組關(guān)聯(lián)分析；群體遺傳分化指數(shù)分析

0 引言

【研究意義】柑橘作為世界第一大水果，在農(nóng)業(yè)中占據(jù)不可替代的作用。許多柑橘品種尤其是寬皮柑橘類品種在栽培過(guò)程中易受褐斑病的危害，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致葉片和果實(shí)的脫落以及樹枝枯死，影響果實(shí)品質(zhì)和樹體生長(zhǎng)[1-2]。因此，開發(fā)柑橘褐斑病抗性相關(guān)分子標(biāo)記以及挖掘相關(guān)基因，對(duì)于培育抗褐斑病柑橘品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】柑橘褐斑病于1903年首次在澳大利亞的皇帝柑上被發(fā)現(xiàn)，之后陸續(xù)在多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)[3]。我國(guó)于2010年首次報(bào)道，之后在各個(gè)產(chǎn)區(qū)陸續(xù)有褐斑病的爆發(fā)，對(duì)當(dāng)?shù)馗涕佼a(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響[4]。已有不少研究者對(duì)柑橘抗褐斑病進(jìn)行了研究。在柑橘品種抗性評(píng)價(jià)方面，國(guó)外的研究表明，‘諾瓦橘’‘默科特’‘明尼奧拉’‘Idith’等都是易感品種，克里曼丁和溫州蜜柑等屬于抗性品種[5-6]。符雨詩(shī)等[7]發(fā)現(xiàn)‘南豐蜜橘’‘418紅橘’‘滿頭紅’‘無(wú)核早橘’等都高度感病，而‘愛倫達(dá)爾’‘紅玉柑’‘清見’‘不知火’‘南香’等則對(duì)褐斑病免疫。在柑橘對(duì)褐斑病抗性的分子標(biāo)記以及抗性基因發(fā)掘方面，2005年DALKILIC等[8]發(fā)現(xiàn)柑橘對(duì)褐斑病的抗性由一個(gè)隱性等位基因控制，只有這個(gè)位點(diǎn)為隱性純合子才表現(xiàn)為抗病。2013年CUENCA等[9]在3號(hào)染色體的著絲粒附近定位到與柑橘褐斑病抗性相關(guān)的3.3 Mb基因組區(qū)域。2016年對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)一步開展精細(xì)定位，將含有柑橘褐斑病的抗性基因限制在366 kb的區(qū)域內(nèi)，兩側(cè)分別有0.4和0.7 cM的標(biāo)記。該區(qū)域包含9個(gè)與病原菌抗性相關(guān)的基因，在3號(hào)染色體25 862 085 bp處的SNP能夠?qū)⒏胁∑贩N和抗病品種進(jìn)行區(qū)分[10]。2020年ARLOTTA等[11]針對(duì)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)了CAPS標(biāo)記，該CAPS能將柑橘抗病品種和感病品種分開。唐科志等[12]通過(guò)對(duì)紅橘感染褐斑病前后轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)紅橘在受到褐斑病脅迫時(shí)，LRR類受體基因、LRK受體激酶基因等能夠響應(yīng)柑橘褐斑病的侵染?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)對(duì)于寬皮柑橘抗褐斑病的基因定位研究較少，本研究基于前人開發(fā)的CAPS標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該CAPS的準(zhǔn)確率并未達(dá)到100%，目前利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）和群體遺傳分化指數(shù)（fixation index）分析（Fst）來(lái)挖掘抗病候選基因的應(yīng)用非常廣泛[13-14]，但對(duì)于柑橘褐斑病抗性的GWAS分析和Fst分析還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究旨在評(píng)估不同寬皮柑橘對(duì)于褐斑病的抗性，并利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)合GWAS和Fst分析，以尋找出更多的SNP位點(diǎn)和抗病基因來(lái)輔助柑橘抗病育種。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年在西南大學(xué)柑桔研究所資源室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所使用鏈格孢菌THJ由西南大學(xué)柑桔研究所綜防課題組提供。試驗(yàn)所用的136份寬柑橘材料，均采自西南大學(xué)國(guó)家柑桔種質(zhì)資源圃（重慶），具體材料表型及基因型見附表。

1.2 褐斑病抗性評(píng)價(jià)

夏季柑橘褐斑病抗性評(píng)價(jià)：參照唐志科等[12]，取THJ病菌于PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化，再取活化后的THJ加入PDB培養(yǎng)基，28 ℃，150 r/min搖48 h，用75%酒精將成熟度、大小一致且未感病未受損的柑橘夏季新梢進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水清洗，將葉片放入托盤中，噴灑無(wú)菌水保持濕潤(rùn)，之后取菌絲球接種于清洗后的離體葉片上，再用保鮮膜將托盤覆蓋。每個(gè)品種資源接種3片葉，并設(shè)置3份葉片不進(jìn)行接種作為對(duì)照，再將托盤放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后對(duì)感病情況進(jìn)行記錄。若無(wú)病斑則記錄為抗病，有病斑則記錄為感病[10]。

秋季柑橘褐斑病抗性評(píng)價(jià)：參照劉榮萍等[15]，取THJ病菌于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4 d，再用75%酒精對(duì)成熟度一致、未感病、未受損的柑橘秋季新梢進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水清洗，放入托盤中，再噴灑無(wú)菌水保持濕潤(rùn)，之后在離體葉片背面接種一個(gè)4 mm菌餅，用保鮮膜將托盤覆蓋，每個(gè)品種資源接種15片葉，并設(shè)置15片葉不接種作為對(duì)照。將托盤放入28 ℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后對(duì)感病情況進(jìn)行記錄，若有兩片及兩片以上的葉片出現(xiàn)明顯的感病現(xiàn)象則記錄為感病，反之則抗病。

1.3 CAPS抗性預(yù)測(cè)

將室內(nèi)接種與田間調(diào)查結(jié)果一致的寬皮柑橘作為CAPS基因型驗(yàn)證的材料。用CTAB法提取121份寬皮柑橘DNA。再用SNP08-spare-F/R（表1）對(duì)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，具體擴(kuò)增體系為：2 μL DNA模板，正、反向引物各1 μL，6 μL無(wú)菌水，10 μL 2×Hieff Canace? Gold PCR Master Mix酶。擴(kuò)增體系為98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，68 ℃延伸30 s，35次循環(huán)，72 ℃終延伸1 min。

用限制內(nèi)切酶I對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，酶切體系為：4 UI限制性內(nèi)切酶，1 μL CutSmart Buffer，6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物。置于37 ℃金屬浴90 min后65 ℃滅活20 min。酶切產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將CAPS預(yù)測(cè)表型與實(shí)際表型進(jìn)行比較，用SPSS進(jìn)行肯爾頓相關(guān)分析。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析和遺傳分化分析

以夏季接種和秋季接種結(jié)果一致的121份寬皮柑橘進(jìn)行GWAS以及Fst分析。用PLINK1.9從已進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的240份寬皮柑橘（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/11310）中提取出121份寬皮柑橘的SNP信息[16]，獲得112 768個(gè)高質(zhì)量SNP。用GEMMA通過(guò)混合線性模型進(jìn)行GWAS分析，基于R語(yǔ)言用ggplot2包繪制曼哈頓圖，用qqman繪制QQ圖。通過(guò)PLINK1.9進(jìn)行Fst分析，再基于R語(yǔ)言用ggplot2包繪制曼哈頓圖。以Bonferroni校正計(jì)算閾值，再根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，以-log10(P)＞4.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選GWAS獲得的SNP。WRIGHT研究表明Fst＞0.25群體分化極大[17]，以Fst＞0.38篩選SNP。通過(guò)PLINK1.9對(duì)GWAS獲得的顯著SNP進(jìn)行提取，再用Excel對(duì)不同基因型的表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用SPSS對(duì)基因型與表型進(jìn)行肯爾頓相關(guān)性分析。

1.5 候選基因篩選與表達(dá)分析

由于寬皮柑橘LD為25 kb[16]，根據(jù)GWAS和Fst篩選出來(lái)的SNP在其前后25 kb區(qū)域內(nèi)選擇候選基因，依據(jù)phytozome對(duì)這些基因的注釋進(jìn)行篩選，獲得5個(gè)與抗病相關(guān)基因。為了再次驗(yàn)證候選基因，取‘秤砣紅橘’和‘新克里曼丁’葉片進(jìn)行病原接種，測(cè)定接種24、48和72 h后基因的表達(dá)情況。使用Biospin總RNA提取試劑盒提取其總RNA。根據(jù)試劑盒Hifair? III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（g DNA digester plus）說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再根據(jù)Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Master Mix試劑盒對(duì)該5個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。以為內(nèi)參（表2），實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：10 μL SYBR、1 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、8.2 μL RNas-free水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，95 ℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 候選基因熒光定量引物

2 結(jié)果

2.1 不同寬皮柑橘品種資源對(duì)褐斑病的抗性評(píng)價(jià)

在136份品種資源中，有121份品種資源夏、秋鑒定結(jié)果表型一致。其中‘橘紅’‘春香’‘春見’‘扁柑’和‘聶都野橘No.1’在夏季接種時(shí)，表現(xiàn)出抗病，卻在秋季接種時(shí)表現(xiàn)為感病。而‘陳皮實(shí)生2號(hào)’‘摩克sidi’‘王柑’‘愛媛21號(hào)’‘本地廣橘’‘青島溫州’‘壽太郎溫州蜜柑’‘清見’‘帕森特’和‘油皮橘’在夏季接種表現(xiàn)出感病，卻在秋季接種時(shí)表現(xiàn)出抗病。對(duì)夏季和秋季接種結(jié)果進(jìn)行肯德爾相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.78。

在這121夏秋鑒定結(jié)果表型一致的寬皮柑橘中，有67份呈現(xiàn)出感病，如圖1中‘大香柑’在夏季和秋季接種后都表現(xiàn)為感病。有54份呈現(xiàn)出抗性，如圖1中‘桂平朱砂橘’在夏季和秋季接種后均表現(xiàn)為抗病。其中大部分的溫州蜜柑（‘宮川溫州’‘久能溫州’‘石川溫州蜜橘’‘國(guó)慶一號(hào)溫州’‘松山’）和克里曼丁類（‘克里曼丁×本地早’‘新克里曼丁’‘克里曼?。ú萐.R.A 65）’）都呈現(xiàn)出抗病。此外還有像‘南香’‘無(wú)核沃柑’‘金橘’‘永順蜜橘’‘愛媛30’等資源對(duì)褐斑病表現(xiàn)出抗性，而大部分椪柑品種，如‘興春椪柑’‘尼8013’‘尼8010’‘尼8005’‘蜂洞橘’‘新生系三號(hào)椪柑’‘烏干達(dá)橘’等，大部分的紅橘如‘418紅橘’‘秤砣紅橘’‘和平92號(hào)紅橘’‘興義大紅袍’等都呈現(xiàn)出感病。這也符合前人研究結(jié)果[5,7]。

A：‘大香柑’夏季接種結(jié)果；B：‘桂平朱砂橘’夏季接種結(jié)果；C：‘大香柑’秋季接種結(jié)果；D：‘桂平朱砂橘’秋季接種結(jié)果。圖A和圖B左3片葉片為接種葉片，右3片葉片為對(duì)照葉片；圖C和圖D前15片葉片為接種葉片，后15片葉片為對(duì)照葉片

2.2 CAPS抗性預(yù)測(cè)

CUENCA等發(fā)現(xiàn)在3號(hào)染色體的25 862 085 bp處的SNP基因型能將感病資源和抗資源進(jìn)行區(qū)分，ARLOTTA等針對(duì)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)了CAPS標(biāo)記，可以通過(guò)對(duì)特定片段酶切再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果區(qū)分感病資源和抗病資源。具體表現(xiàn)為，若在瓊脂糖凝膠電泳中產(chǎn)生一條帶，則基因型為TT，表現(xiàn)為抗性；若為2條或者3條帶則為GG或GT型，表現(xiàn)為感病（圖2）。從圖2可知，‘明尼奧拉橘柚’‘橘橙22-53’‘圓紅香柑’‘安江紅橘’‘沙柑’‘奧坦尼科’為感病資源，其余為抗病資源。

用2.1獲得的121份寬皮柑橘的抗性評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)該CAPS進(jìn)行驗(yàn)證。在這121份寬皮柑橘中，共有93份驗(yàn)證正確，準(zhǔn)確為76.86%。67份感病資源中有52份CAPS驗(yàn)證正確，準(zhǔn)確率為77.61%，而54份抗病資源中有41份驗(yàn)證正確，準(zhǔn)確率為75.93%（圖2）。用肯德爾相關(guān)分析對(duì)抗性評(píng)價(jià)結(jié)果與CAPS驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.534，表現(xiàn)為中等程度相關(guān)。表明該CAPS判斷寬皮柑橘對(duì)褐斑病是否有抗性判定有一定的參考價(jià)值，但還需要其他分子標(biāo)記輔助判斷。

A：20份寬皮柑橘CAPS酶切結(jié)果；1：2000 DNA marker；從2-21依次為：‘明尼奧拉橘柚’‘橘橙22-53’‘圓紅香柑’‘新克里曼丁’‘安江紅橘’‘金橘’‘酸柑子’‘韋爾金橘’‘阿匹熱諾’‘沙柑’‘克里曼丁×本地早’‘津之望’‘1-26’‘平陽(yáng)橘’‘清見×明尼奧拉’‘奧坦尼科’‘四季橘’‘無(wú)核w默科特’‘無(wú)核早橘’‘滑皮橘’。B：CAPS準(zhǔn)確率餅狀圖

2.3 利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析與Fst分析

通過(guò)對(duì)121份寬皮柑橘進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)在感病品種資源和抗病品種資源之間并未出現(xiàn)分層（圖3-A）。為了鑒定寬皮柑橘對(duì)于褐斑病的抗性位點(diǎn)，對(duì)前期采用GBS簡(jiǎn)化基因組測(cè)序獲得的SNP位點(diǎn)與柑橘褐斑病抗感表型進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析和Fst分析。全基因關(guān)聯(lián)分析表明顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)主要集中在2號(hào)和3號(hào)染色體上，QQ圖中曲線上翹表明GWAS結(jié)果較好（圖3-C）。GWAS分析共篩選出6個(gè)SNP。其中4個(gè)位于3號(hào)染色體上，1個(gè)位于2號(hào)染色體上；最顯著的SNP位于3號(hào)染色體24 838 146 bp處，其-log10(P)為7.74（圖3-B）。Fst分析篩選出的顯著關(guān)聯(lián)SNP主要集中在3號(hào)、2號(hào)以及5號(hào)染色體上。本研究以Fst＞0.38為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到8個(gè)SNP。其中6個(gè)位于3號(hào)染色體上，1個(gè)位于2號(hào)染色體上，1個(gè)位于5號(hào)染色體上；最顯著的SNP位于5號(hào)染色體處，其Fst值為0.42（圖3-D）（表3）。

A：121份柑橘主成分分析圖；B：褐斑病抗性性狀GWAS曼哈頓圖；C：褐斑病抗性性狀GWAS QQ圖；D：褐斑病抗性性狀Fst分析的曼哈頓圖

接著對(duì)GWAS篩選出的6個(gè)SNP（表4）進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)SNP1、SNP2、SNP4和SNP6能良好地區(qū)分出感病資源。SNP1基因型為G/G則全部為感病資源，基因型為A/A則85%的幾率為抗病資源。SNP2基因型為C/C時(shí)全部為感病資源，基因型為T/T則有75%的幾率為抗病資源。SNP4基因型為G/G時(shí)全部為感病資源，基因型為T/T則有73%的幾率為抗病資源。SNP5基因型為A/A則95%幾率為抗病資源。SNP6基因型為C/C時(shí)全部為感病資源，基因型為T/T則有74%的幾率為抗病資源。另外，這幾個(gè)SNP的基因型若為雜合型，則有更大的可能性表現(xiàn)為易感褐斑病。之后對(duì)這6個(gè)SNP基因型與表型進(jìn)行肯德爾相關(guān)性分析，SNP1表現(xiàn)為強(qiáng)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.641。其余5個(gè)表現(xiàn)為中等程度相關(guān)，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP6相關(guān)系數(shù)分別為0.572、0.583、0.564、0.45和0.549。表明這幾個(gè)SNP的基因型可以作為判斷寬皮柑橘是否感/抗褐斑病的一個(gè)參考依據(jù)。

表3 GWAS和Fst分析獲得的14個(gè)SNP的基本信息

為獲得寬皮柑橘對(duì)于褐斑病抗性的候選基因，本研究在獲得的14個(gè)SNP上下游25 kb區(qū)域內(nèi)篩選基因，總共篩選到38個(gè)基因，根據(jù)phytozome的注釋，篩選出5個(gè)和抗病相關(guān)基因（表5）。這5個(gè)基因都位于3號(hào)染色體上，均含有抗病相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。對(duì)這5個(gè)基因在感病資源‘秤砣紅橘’和抗病資源‘新克里曼丁’接種病原菌24、48和72 h后，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因在‘秤砣紅橘’接種病原菌后表達(dá)量存在顯著差異，均表達(dá)上調(diào)，且在感染48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，72 h時(shí)有所下降（圖4）。在72 h時(shí)下降幅度最低。48 h時(shí)，上調(diào)倍數(shù)最高，約是接種24 h時(shí)的97倍，上調(diào)倍數(shù)最低，約是接種24 h時(shí)的40倍。對(duì)‘新克里曼丁’而言，5個(gè)基因在接種病原菌后表達(dá)量都有所上調(diào)，但上調(diào)幅度遠(yuǎn)不如感病資源‘秤砣紅橘’，尤其是在48 h時(shí)。其中和的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最高，在感病48 h時(shí)上調(diào)倍數(shù)分別為24 h時(shí)的7倍和9倍。、和在‘新克里曼丁’接種病原菌后的24、48和72 h表達(dá)量均高于‘秤砣紅橘’接種24 h時(shí)的表達(dá)量，但是要低于‘秤砣紅橘’接種48和72 h時(shí)的表達(dá)量。的表達(dá)量在接種后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)并未發(fā)生較大的改變，表達(dá)量與‘秤砣紅橘’接種后24 h差異不大。在‘新克里曼丁’接種24、48和72 h時(shí)的表達(dá)量均低于‘秤砣紅橘’接種24 h時(shí)的表達(dá)量。

表4 GWAS 分析獲得的6個(gè)SNP基因型的基本信息

表5 5個(gè)候選基因的功能注釋

*、**和***分別表示在0.05 、0.01和0.001水平上差異顯著。CTHJ-24、CTHJ-48、CTHJ-72分別代表‘秤砣紅橘’接種后24、48和72 h。XKLMD-24、XKLMD-48、XKLMD-72分別代表‘新克里曼丁’接種后24、48和72 h

3 討論

柑橘褐斑病是柑橘中的重要病害之一，危害柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[18]。柑橘褐斑病主要發(fā)生在寬皮柑橘和葡萄柚上，而寬皮柑橘是我國(guó)的主栽柑橘類型，探究寬皮柑橘對(duì)褐斑病的抗性很有必要。

3.1 寬皮柑橘對(duì)褐斑病抗性評(píng)價(jià)分析

抗褐斑病寬皮柑橘種質(zhì)的鑒定可為育種家對(duì)于抗病親本的選擇提供重要的參考。本研究發(fā)現(xiàn)在寬皮柑橘資源中存在許多的抗性資源，有54份資源的抗性穩(wěn)定，在今后的育種工作中，這些資源可以優(yōu)先考慮作為親本。另外，這54份抗性資源中也存在品質(zhì)優(yōu)良的品種，例如‘無(wú)核沃柑’在夏、秋接種時(shí)都表現(xiàn)出對(duì)褐斑病的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)16份品種資源在夏季和秋季接種表型不一致，推測(cè)可能受到葉片成熟度影響。研究發(fā)現(xiàn)‘Clauselina IVIA-19’‘Okitsu IVIA-195’‘Unshu SRA-529’‘Saigon SRA-227’等一些資源品種在接種葉片長(zhǎng)度為2—4 cm時(shí)出現(xiàn)癥狀，而在葉片接種長(zhǎng)度為5—7 cm時(shí)卻沒(méi)有癥狀[5]?？赡苁抢先~質(zhì)地更硬，不利于菌絲入侵。本研究是采取成熟度為50%的葉片進(jìn)行接種，而葉片成熟度的具體判斷是根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，因此存在一定的誤差，上述16份品種資源可能是采摘的葉片成熟度過(guò)高，導(dǎo)致在接種后并未表現(xiàn)為感病。

3.2 寬皮柑橘抗褐斑病相關(guān)基因型分析

本研究發(fā)現(xiàn)CAPS的準(zhǔn)確率并未達(dá)到100%，ARLOTTA等[11]對(duì)其開發(fā)的CAPS進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)其準(zhǔn)確率達(dá)到100%。推測(cè)可能是因?yàn)樵贏RLOTTA的試驗(yàn)中用于驗(yàn)證的群體為雜交群體，而本研究驗(yàn)證的是一個(gè)自然群體，雜交群體的遺傳多樣性低于自然群體，所以柑橘抗褐斑病還受其他位點(diǎn)或基因的影響，可能該位點(diǎn)在ARLOTTA研究的雜交群體中并不存在多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)雖然大部分克里曼丁類和溫州蜜柑類表現(xiàn)為抗病，但是也有像‘巖崎早生溫州’‘寧紅73-19溫州’‘費(fèi)爾柴爾德’等表現(xiàn)為感病，但‘巖崎早生溫州’的6個(gè)SNP基因型與其他抗病“溫州系”一致，表明可能還存在其他基因結(jié)構(gòu)層面上或者基因表達(dá)層面上的差異導(dǎo)致其對(duì)于褐斑病感抗上的差異。對(duì)所有椪柑在SNP1位置的基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其基因型均為G/A，而紅橘的基因型均為G/G，表明在椪柑和紅橘中，該位點(diǎn)比較保守，不易發(fā)生突變。而‘費(fèi)爾柴爾德’為克里曼丁與其他柑橘的雜交種。在克里曼丁類別中，發(fā)現(xiàn)‘費(fèi)爾柴爾德’SNP1位置的基因型為G/A，其余的基因型都為A/A。所以‘費(fèi)爾柴爾德’表現(xiàn)為感病推測(cè)是由于其另外一個(gè)親本的感病基因滲入，而該感病基因可能與SNP1連鎖。

近年來(lái)，隨著測(cè)序成本的不斷降低，GWAS已廣泛且有效地應(yīng)用于植物抗病基因的定位研究，也取得了許多進(jìn)展[19-21]。本研究通過(guò)GWAS發(fā)現(xiàn)了6個(gè)SNP與寬皮柑橘褐斑病高度相關(guān)，這6個(gè)SNP中有5個(gè)位于3號(hào)染色體，其中最顯著的SNP位于3號(hào)染色體的24 838 146 bp位置，該位置距離CUENCA等[10]發(fā)現(xiàn)的SNP08相差1 023.939 kb，推測(cè)可能是因?yàn)槠淅玫氖请s交群體進(jìn)行相關(guān)SNP定位，雜交群體的多樣性更差，而本研究利用的是自然群體，多樣性更好。通過(guò)Fst篩選出的SNP也主要集中在3號(hào)染色體。這表明柑橘褐斑病抗性相關(guān)基因主要存在于3號(hào)染色體上，這與前人研究相吻合[9]。

在梨中，黑斑病也由鏈格孢菌引起，而且梨中的鏈格孢菌所產(chǎn)生的致病因子結(jié)構(gòu)與柑橘所產(chǎn)生的致病因子結(jié)構(gòu)相似。研究人員對(duì)梨的黑斑病進(jìn)行研究，提出梨對(duì)黑斑病的易感性由單個(gè)顯性基因控制，稱為A，易感品種具有雜合基因型（A/a）[22]。在蘋果中的斑點(diǎn)病也是由鏈格孢菌引起，研究發(fā)現(xiàn)蘋果對(duì)鏈格孢菌斑病的易感性由顯性基因控制，該基因定位于‘美味’的11號(hào)染色體，抗性品種為基因型/，易感品種為/或/[23]。柑橘中的研究也推測(cè)抗病品種的抗病基因座為隱性純合型，而易感品種可能是雜合型或顯性純合型[8-9]。本研究通過(guò)對(duì)SNP基因型分析，發(fā)現(xiàn)若基因型為雜合子時(shí)，其表型更有可能表現(xiàn)為感病。

3.3 寬皮柑橘抗褐斑病相關(guān)基因分析

R蛋白是植物體內(nèi)最大的抗病蛋白。R蛋白都具有一些共同的結(jié)構(gòu)域，包括富亮氨酸重復(fù)序列蛋白（leucine-rich repeat，LRR）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，S/TK）、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（coiled coil，CC）、跨膜結(jié)構(gòu)受體（transmembrane receptor，TM）、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS）和Toll/白細(xì)胞介素-1受體（toll/interleukin-1 receptor，TIR）等。這些結(jié)構(gòu)域通過(guò)不同的組合形成抗病基因參與植物抵抗病原菌[24-26]。例如LRR與S/TK以及TM組合成LRR-RLK主要參與第一層防御[27-30]，NBS與LRR以及TIR組合成TIR-NBS-LRR則主要通過(guò)識(shí)別效應(yīng)因子參與第二層防御[31-33]。本研究通過(guò)GWAS和Fst獲得的SNP對(duì)基因進(jìn)行篩選，但并未發(fā)現(xiàn)有上述傳統(tǒng)上的抗病基因，不過(guò)篩選出5個(gè)含有上述結(jié)構(gòu)域的基因。其中和都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，而、和都含有LRR結(jié)構(gòu)域。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（S/TKs）是生物酶中的一個(gè)大家族，其功能包括介導(dǎo)植物防御反應(yīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在植物與微生物相互作用過(guò)程中，S/TKs主要參與病原菌信號(hào)的識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)[34]。相較于LRR-RLK，單獨(dú)的S/TK基因參與植物抗病的報(bào)道比較少，不過(guò)GAO等[34]發(fā)現(xiàn)Nr S/TK基因能夠?qū)煵莺诎卟∫赘衅贩N產(chǎn)生抗性。在瀘定百合中，Ls S/TK經(jīng)百合鐮刀菌誘導(dǎo)后表達(dá)量會(huì)上升[35]。在大麥中，編碼含有兩個(gè)串聯(lián)激酶結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因?yàn)榇篼溓o銹病的抗性基因[36]。表明單獨(dú)的S/TK也可以參與植物的抗病過(guò)程。本研究中，2個(gè)含有S/TKs基因的表達(dá)都能被鏈格孢菌的侵染所誘導(dǎo)，而且和的表達(dá)量在感病品種‘秤砣紅橘’接種48 h后的表達(dá)量達(dá)到最高，而抗病品種‘新克里曼丁’的上調(diào)表達(dá)幅度遠(yuǎn)不如‘秤砣紅橘’，表明和在感病品種中參與了柑橘褐斑病浸染后信號(hào)的識(shí)別響應(yīng)和信號(hào)的傳導(dǎo)。而在抗病品種中24、48和72 h的表達(dá)量變幅不大，說(shuō)明其對(duì)外界鏈格孢菌病原菌的識(shí)別和信號(hào)響應(yīng)并不敏感，這可能是‘新克里曼丁’抗病的主要原因，因此，推測(cè)可能是前期參與寬皮柑橘對(duì)鏈格孢菌病原菌的識(shí)別和響應(yīng)，由于基因型的不同，表現(xiàn)出不同的感抗性。

LRR結(jié)構(gòu)域是一段含有1—47個(gè)LRR的蛋白片段，在感測(cè)各種信號(hào)以調(diào)節(jié)植物發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)方面發(fā)揮著核心作用[37-38]。為潛在病原體的存在提供預(yù)警系統(tǒng)，并激活植物中的保護(hù)性免疫信號(hào)[39]。單獨(dú)含有LRR結(jié)構(gòu)域的基因參與植物抗病報(bào)道比較少，不過(guò)之前有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中受體被鑒定為富亮氨酸重復(fù)受體樣蛋白（responsiveness to botrytis polygalacturonases1，RBPG1）能識(shí)別真菌內(nèi)分泌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase，endoPG），而endoPG能夠降解細(xì)胞壁聚合物從而滲透入細(xì)胞內(nèi)。在柑橘中，之前研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌的endoPG基因突變體會(huì)導(dǎo)致柑橘褐斑病的癥狀顯著降低[24]。本研究中，、和在‘秤砣紅橘’感病48 h時(shí)其表達(dá)量分別上調(diào)40倍、90倍和70倍，推測(cè)、和可能通過(guò)參與識(shí)別endoPG來(lái)參與褐斑病感病過(guò)程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，和的表達(dá)量上調(diào)幅度要高于和，因此推測(cè)這兩個(gè)基因可能對(duì)于褐斑病的發(fā)生更加敏感；尤其是在‘新克里曼丁’感病后的48 h，其表達(dá)量也上調(diào)了約9倍，猜測(cè)可能屬于第一層防御系統(tǒng)，通過(guò)感知鏈格孢菌入侵信號(hào)并將信號(hào)傳遞下去以激活下游基因參與病原菌的侵染過(guò)程。但本研究只針對(duì)R基因進(jìn)行了探索，之前有研究表明柑橘感染褐斑病與乙烯、類黃酮、己酸的代謝有關(guān)[2,40-41]。后續(xù)可以在3號(hào)染色體定位的褐斑病抗性基因區(qū)域挖掘與乙烯、類黃酮、己酸代謝相關(guān)的基因進(jìn)行研究，以探索出更多寬皮柑橘抗褐斑病的基因。

4 結(jié)論

136份寬皮柑橘中有121份春、秋2次接種結(jié)果一致。其中大部分克里曼丁類和溫州蜜柑類基本表現(xiàn)為抗褐斑病，而紅橘類和椪柑類都表現(xiàn)為感褐斑病。利用CAPS識(shí)別柑橘褐斑病抗感性狀的準(zhǔn)確率為76.86%，表現(xiàn)為中等程度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.534。通過(guò)GWAS共篩選出6個(gè)與褐斑病抗性相關(guān)的SNP，通過(guò)Fst共篩選出8個(gè)與褐斑病抗性相關(guān)的SNP。GWAS篩選出在3號(hào)染色體24 838 146 bp位置的SNP為最顯著的位點(diǎn)，該位置的基因型能比較有效地將抗病資源和感病資源進(jìn)行區(qū)分，表現(xiàn)為強(qiáng)相關(guān)。篩選出的候選基因、、、、在感病品種‘秤砣紅橘’接種后表達(dá)量上調(diào)，且在接種48 h后表達(dá)量最高，這5個(gè)基因?yàn)閷捚じ涕倏购职卟〉暮蜻x基因。

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YANG ShengNan, CHENG Li, TAN YueXia, ZHU YanSong, JIANG Dong

Citrus Research Institute of Southwest University, Chongqing 400712

【Objective】The study objective was to explore candidate genes associated with resistance to Alternaria brown spot disease in citrus mandarin, so as to provide the basis for developing suitable molecular markers for further citrus resistance breeding work. 【Method】In summer and autumn of 2022, the young leaves of 136 citrus mandarin accessions were picked and inoculated with the fungus mycelium ofin the laboratory. The combined results of two experiments were used to obtain the reliable results of 121 citrus mandarins responding to Alternaria brown spot. The phenotypes of 121 citrus mandarins were selected to verify the effectiveness of the CAPS marker developed in a previous study. Then, in order to obtain the candidate SNPs related to Alternaria brown spot resistance, the phenotypes of 121 citrus mandarins and corresponding SNP genotype data from GBS sequencing were analyzed with PCA, GWAS, and Fstmethods, respectively. Candidate genes had been selected from the flanking region of 25 kb sequences surrounding the candidate SNPs site, and then they were screened out according to phytozome annotations. The expressions of candidate genes were analyzed after inoculating with the pathogen fungus on leave of Chengtuo hongju and Clementina (Algeria) for 24, 48, and 72 h. 【Result】Among 121 citrus mandarins, 67 varieties such as Clementine and Satsuma were resistant to Alternaria brown spot disease, whereas 54 varieties such as Hong Ju and Ponkan were susceptible. Some varieties resistance to Alternaria brown spot disease could discriminated by CAPS, but its accuracy only accounted for 76.86% in the study. GWAS analysis identified six significant SNPs highly associated with disease resistance, among which SNP1 located inat 24 838 146 bp of chromosome 3 could be used to predicate the resistance of varieties, and their genotype showed a strong correlation with phenotype. Eight significant SNPs highly associated with disease resistance selected by Fstanalysis.Finally, five genes of,,,andwere screened out. The expression levels of these five genes in Chengtuo Hongju were up-regulated extensively after inoculating leaves with the pathogen fungus, and their expression levels reached the highest 48 hours later. 【Conclusion】Through GWAS, the SNP at 24 838 146 bp on chromosome 3 was found to be the most significant one with high resistance correlation to Alternaria brown spot disease, and the genotype at this location could be effectively used to distinguish the resistant varieties. The candidate genes responding to Alternaria brown spot disease in mandarin were discussed, i.e.,,,,, and.

citrus mandarin; Alternaria brown spot; molecular marker; genome-wide association study; fixation index

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.012

2023-02-14；

2023-05-04

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1001400）、柑橘種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定（19211142）

楊勝男，E-mail：y_sn@qq.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）