新疆冬小麥品種資源主要產(chǎn)量性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

馬艷明，婁鴻耀，張勝軍，王威，郭營，倪中福，劉杰

新疆冬小麥品種資源主要產(chǎn)量性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

馬艷明，婁鴻耀3，張勝軍4，王威1，郭營5，倪中福2，劉杰

1新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193；3北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所，北京 100097；4新疆伊犁哈薩克自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆伊寧 835011；5山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東泰安 271018

【目的】高產(chǎn)是小麥育種的永恒主題，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘控制小麥產(chǎn)量性狀的QTL區(qū)段及優(yōu)異基因，為小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)和標(biāo)記信息?！痉椒ā恳孕陆镜?88個冬小麥品種資源為材料，利用小麥55K SNP芯片進(jìn)行全基因組掃描，通過對6個不同環(huán)境下的株高、穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重、粒長、粒寬、籽粒長/寬比9個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行表型鑒定，利用6個環(huán)境下各性狀數(shù)據(jù)及最佳線性無偏預(yù)測（BLUP）數(shù)據(jù)，基于混合線性模型（MLM）對表型和基因型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。【結(jié)果】經(jīng)主成分分析，將188個材料分為地方品種和育成品種2個亞群；利用6個環(huán)境下各性狀數(shù)據(jù)，9個性狀共檢測到1 309個顯著性SNP標(biāo)記，其中，每個顯著性SNP位點(diǎn)可解釋7.259%—70.792%的表型變異。利用BLUP數(shù)據(jù)，9個性狀共檢測到66個顯著性位點(diǎn)，同時與2個性狀關(guān)聯(lián)的共有SNP位點(diǎn)有5個，貢獻(xiàn)率波動范圍為8.498%—21.877%。將同時與2個性狀或2個以上環(huán)境關(guān)聯(lián)到的重復(fù)位點(diǎn)作為穩(wěn)定的顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，9個性狀共檢測到38個穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，包括株高重復(fù)位點(diǎn)5個，穗長重復(fù)位點(diǎn)10個，小穗數(shù)重復(fù)位點(diǎn)10個，結(jié)實(shí)小穗數(shù)重復(fù)位點(diǎn)6個，穗粒數(shù)重復(fù)位點(diǎn)6個，千粒重重復(fù)位點(diǎn)1個，可解釋9.10%—23.81%的表型變異。將這38個位點(diǎn)與已發(fā)布小麥基因組位點(diǎn)比對，僅找到3個與本研究關(guān)聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)位置相近、且有注釋基因功能的基因，分別是：2A染色體上與株高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-108794050距離相近的，與轉(zhuǎn)錄因子bHLH71的代謝合成有關(guān)；1A染色體上與穗長關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-110689765距離相近的，與蛋白質(zhì)編碼有關(guān)；4B染色體上與千粒重關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-110399975距離相近的，與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SD1-8有關(guān)，參與對細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。【結(jié)論】檢測到38個與小麥產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)的優(yōu)良等位基因具有降低株高、增加穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重的作用。

小麥；產(chǎn)量性狀；SNP標(biāo)記；關(guān)聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】普通小麥（L.）是典型的異源多倍體口糧作物。中國是全球最大的小麥生產(chǎn)國和消費(fèi)國，其產(chǎn)量常年占全球總產(chǎn)量的17%。因此，我國小麥產(chǎn)量的持續(xù)提升對保障國家糧食安全具有非常重要的意義，同時也在一定程度上影響國際糧價的穩(wěn)定[1]。隨著耕地面積的不斷減少和全球總?cè)丝跀?shù)量的不斷增加，高產(chǎn)育種一直是小麥育種工作最為重要的內(nèi)容之一。而株高、穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重以及粒長、粒寬、籽粒長寬比等表現(xiàn)都與小麥的產(chǎn)量存在緊密的聯(lián)系。在傳統(tǒng)育種中，育種家主要依靠經(jīng)驗(yàn)對上述產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行表型選擇，其選擇效率往往較低，且容易受到環(huán)境因素的影響，造成選擇的誤差。利用分子手段，鑒定與產(chǎn)量性狀相關(guān)聯(lián)的重要遺傳位點(diǎn)，并根據(jù)這些位點(diǎn)開發(fā)出育種可用的分子標(biāo)記，可顯著提升對小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀選擇的效率和準(zhǔn)確性，大幅縮短新品種選育的周期[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘糧食作物產(chǎn)量相關(guān)QTL（quantitative trait loci）已成為作物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展和統(tǒng)計(jì)算法的革新，全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）已經(jīng)成為鑒定作物產(chǎn)量相關(guān)QTL的重要方法。該方法不僅能夠提高雙親分離群體作圖的分辨率，同時還能對多個農(nóng)藝性狀同時進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖，提高了QTL鑒定的效率[3]。作為異源多倍體作物，普通小麥基因組復(fù)雜度高，給GWAS工作帶來一定困難。盡管如此，在過去的研究中，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)利用GWAS鑒定出一些與小麥產(chǎn)量性狀相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，但在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，其關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果還存在不一致的現(xiàn)象[4]。Qaseem等[5]對12種與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行GWAS分析，共獲得114個與性狀關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP），其中21個位點(diǎn)與單株穗數(shù)相關(guān)聯(lián)，4個位點(diǎn)與單穗粒數(shù)相關(guān)聯(lián)，7個位點(diǎn)與千粒重相關(guān)聯(lián)；SUKUMARAN等[6]利用90K SNP芯片對287個小麥材料進(jìn)行全基因組掃描，檢測到與粒重、畝穗數(shù)、成熟期關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)；Chen等[7]利用SNP標(biāo)記對205份小麥品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到271個與千粒重等特征相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。Sun等[8]利用20 689個高質(zhì)量小麥90K SNP標(biāo)記，針對163個小麥品種在3個地點(diǎn)14個環(huán)境中的13個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行分析，關(guān)聯(lián)得到1 769個重要位點(diǎn)，其中有41個SNP位點(diǎn)可能對產(chǎn)量相關(guān)性狀的形成有重要貢獻(xiàn)。Wang等[9]對105個小麥品種進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀的GWAS分析，共找到24個與9種產(chǎn)量相關(guān)性狀連鎖的標(biāo)記，其中，與千粒重、籽粒形態(tài)和植株高度相關(guān)的4個位點(diǎn)在不同環(huán)境中均被檢測到，認(rèn)為這些位點(diǎn)受環(huán)境影響較小，具有重要的育種利用價值；而有效穗數(shù)、籽?？偖a(chǎn)量、葉面積等性狀受環(huán)境影響較大；染色體上的同一區(qū)域或鄰近區(qū)域可能與多個產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)，表明一因多效性。Ye等[10]利用55K SNP芯片對244個四川小麥品種（包括79個地方品種和165個審定品種）的產(chǎn)量性狀進(jìn)行分析，關(guān)聯(lián)得到6個穗長相關(guān)QTL和3個千粒重相關(guān)QTL，通過與已知QTL的物理位置進(jìn)行比較，鑒定出21個與小麥生長代謝相關(guān)的候選基因。翟俊鵬等[11]利用小麥35K SNP芯片對150份小麥品種在4個環(huán)境條件下的9個主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測得到652個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中21個位點(diǎn)在2個以上（包括2個）的環(huán)境中被重復(fù)檢測到。趙丹陽等[12]結(jié)合SSR與SNP標(biāo)記對52個黃淮麥區(qū)品種（系）材料的株高、穗長、單株穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重等6個產(chǎn)量性狀進(jìn)行標(biāo)記分析，獲得6個與產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記和7個與產(chǎn)量性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。顧晶晶等[13]以660K SNP芯片對198份河南小麥品種在4個環(huán)境下的穗粒數(shù)、穗長、總小穗數(shù)、可育小穗數(shù)和不育小穗數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到41個顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并對關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)一步分析發(fā)掘出多個與穗粒數(shù)性狀相關(guān)的優(yōu)異等位變異，其單個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率范圍為6.19%—20.83%。【本研究切入點(diǎn)】小麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀，目前，已知基因標(biāo)記資源有限，急需挖掘更多與產(chǎn)量性狀相關(guān)的優(yōu)異基因。前期利用小麥55K SNP芯片對新疆本地收集的134份冬小麥地方品種和54份育成品種進(jìn)行了基因型分析，獲得了豐富的SNP信息[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究進(jìn)一步對這些小麥材料在2年3點(diǎn)共計(jì)6個環(huán)境條件下的株高、穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重、粒長、粒寬、籽粒長/寬等9個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行系統(tǒng)表型分析，并結(jié)合芯片數(shù)據(jù)開展全基因組關(guān)聯(lián)分析，旨在發(fā)掘與小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀密切相關(guān)的QTL位點(diǎn)和基因組區(qū)段，為小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)和標(biāo)記信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及表型鑒定

供試材料為188份新疆冬小麥品種資源，包括地方品種134個，育成品種54個[14]，均為國家作物種質(zhì)資源庫（新疆分庫）收集保存。

供試材料分別于2017年、2018年2個小麥生育期種植于3個試驗(yàn)點(diǎn)，分別是新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗(yàn)場（新疆烏魯木齊市，UR；44.31°N，86.22°E）、新疆伊犁哈薩克自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（新疆伊寧市，YN；43.92°N，81.32°E）、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)站（山東泰安市，TA；36.17°N，117.17°E），共計(jì)6個環(huán)境，分別標(biāo)記為UR2017、UR2018、YN2017、YN2018、TA2017、TA2018。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)種植50個材料，每材料2行，行長1.5 m，每行點(diǎn)播30粒，3次重復(fù)，參照《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[15]規(guī)定的方法調(diào)查株高、穗長、小穗數(shù)、結(jié)實(shí)小穗數(shù)、穗粒數(shù)等性狀，利用萬深SC-G型自動種子考種分析儀測定千粒重、粒長、粒寬和籽粒長/寬，每材料重復(fù)測定2次。所有性狀均取平均值作為最終測量值。

1.2 基因組DNA提取與SNP標(biāo)記分析

全部試驗(yàn)材料采用2015年10月種植、2016年7月收獲的種子。于2016年10月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥遺傳育種溫室種植，植株長至二葉一心時，取小麥葉片，按Saghai-Maroof等[16]的CTAB法提取基因組DNA。DNA提取后質(zhì)控其純度和濃度，并將其稀釋至50 ng·μL-1備用。將制備好的188份新疆冬小麥品種基因組DNA送至博奧晶典公司進(jìn)行55K SNP全基因芯片掃描，獲得原始芯片測序數(shù)據(jù)，質(zhì)控后獲得50 743個SNP多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

群體結(jié)構(gòu)通過STRUCTURE 2.3.4軟件[17]的MCMC模型（the Bayesian Markov Chain Monte Carlo model）估算，設(shè)定群體數(shù)量為1—10，設(shè)置burn-in步長為10 000，MCMC迭代次數(shù)為100 000，對于每一個K值，分別進(jìn)行5次獨(dú)立的重復(fù)，根據(jù)數(shù)據(jù)對數(shù)概率（LnP(D)）隨連續(xù)K值的變化率計(jì)算Δ，研究材料的類群個數(shù)通過Δ確定[18]，多次運(yùn)行結(jié)果用CLUMPP軟件[19]整合。在群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和連鎖不平衡（linkage disequilibrium，）分析基礎(chǔ)上，以群體結(jié)構(gòu)作為固定效應(yīng)，個體親緣關(guān)系作為隨機(jī)效應(yīng)，校正群體結(jié)構(gòu)和個體間親緣關(guān)系的影響，采用Tassel 5.0（http://www.maizegenetics. net/）軟件中的混合線性模型（mixed linear model，MLM）進(jìn)行性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析，MLM模型同時把親緣關(guān)系與群體結(jié)構(gòu)作為協(xié)變量，具有更高的統(tǒng)計(jì)效率且降低假陽性發(fā)生率[20]，獲得可靠的與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，同時，利用多環(huán)境下各性狀數(shù)據(jù)及最佳線性無偏預(yù)測（best linear unbiased prediction，BLUP）數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并對關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行比較。BLUP對多環(huán)境數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，去除環(huán)境效應(yīng)，可以得到個體穩(wěn)定遺傳的表型。為盡可能消除關(guān)聯(lián)分析中帶來的假陽性結(jié)果，采用Bonferroni法[21]對值進(jìn)行校正。計(jì)算公式如下：

= α/N

其中，α=1，N為所用SNP標(biāo)記數(shù)目[22]。50 743個SNP標(biāo)記的值為1/50743，相當(dāng)于閾值-log10()≈5。當(dāng)SNP位點(diǎn)的＜0.00001時，視該SNP位點(diǎn)與性狀顯著關(guān)聯(lián)。把與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記定位到小麥的基因組上，確定相對應(yīng)的置信區(qū)域，在關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記連鎖不平衡衰減距離的區(qū)域范圍內(nèi)，搜尋與性狀相關(guān)的候選基因。用Structure 2.3.4軟件計(jì)算Q值，用SPAGedi軟件[23]計(jì)算品種間親緣關(guān)系的Kinship (K)值，基于公式=α+Qβ+Kμ+e（為基因型，為表型），計(jì)算最終每個SNP位點(diǎn)所對應(yīng)的關(guān)聯(lián)值，運(yùn)用R3.4.2繪制manhattan圖和quantile-quantile圖，使顯著性位點(diǎn)可視化。用2值來鑒定兩位點(diǎn)間的連鎖不平衡程度。當(dāng)2對應(yīng)＜0.01時，認(rèn)為兩位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)[24]。

2 結(jié)果

2.1 群體結(jié)構(gòu)分析

為了準(zhǔn)確估計(jì)本研究所用自然群體的群體結(jié)構(gòu)，采用K值分析法和主成分分析法進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，以確定最合適的分群數(shù)量。利用Structure2.3.4軟件對188個小麥品種的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)解析。設(shè)定類群數(shù)（K值）為1—10，對于每個指定的K值，LnP(D)值隨著K值的增加持續(xù)上升，在K=2時出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，此時值達(dá)到最大值（圖1-a和圖1-c），表明188個小麥品種可以劃分為2個亞群，一個是地方品種群，另一個是育成品種群?；赟NP，利用Tassel 5.0軟件進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA），前2個主成分PC1（25.34%）、PC2（9.22%）可解釋34.56%的群體信息，同樣證明全部材料可以分為地方品種和育成品種2個亞群（圖1-b），與所選材料一致。

a：K值對應(yīng)的ΔK值；b：主成分分析；c：基于模型的群體結(jié)構(gòu)分析 a: The ΔK statistic for each given K; b: PCA; c: Model-based ancestries

2.2 品種間的親緣關(guān)系及LD分析

利用SPAGeDi評估品種之間的相對親緣關(guān)系。親緣關(guān)系系數(shù)等于0的占54.4%，小于0.1的占31.0%（圖2-a），表明群體中大多數(shù)種質(zhì)與其他種質(zhì)的親緣關(guān)系較弱，群體材料適宜進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。將過濾后的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)用于計(jì)算連鎖不平衡（LD）。A、B和D亞基因組以及整個基因組的平均2值隨著成對標(biāo)記距離的增加而逐漸降低。當(dāng)2的臨界閾值定義為0.25時，相比之下，A基因組的LD衰減距離最?。s5 Mb），B基因組和D基因組LD衰減距離較大（>15 Mb），整個基因組LD衰減距離約為15 Mb（圖2）。

a：品種間相對親緣關(guān)系；b：A、B、D基因組LD衰減圖

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

為了獲得可靠的與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，同時，利用6個環(huán)境下各性狀數(shù)據(jù)及BLUP數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。利用6個環(huán)境下各性狀數(shù)據(jù)，9個性狀共檢測到1 309個顯著性SNP標(biāo)記，其中，每個顯著性SNP位點(diǎn)解釋的表型變異（phenotypic variation explained，）波動范圍為7.259%—70.792%。利用BLUP數(shù)據(jù)，9個性狀共檢測到66個顯著性位點(diǎn)，同時與2個性狀關(guān)聯(lián)的共有SNP有5個，貢獻(xiàn)率波動范圍為8.498%—21.877%（表1和圖3）。

株高（plant height，PH）：6個環(huán)境下共檢測到76個與株高顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布于除4D以外的其他20條染色體上，單個位點(diǎn)可解釋8.191%—29.767%的株高表型變異。上述顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中有3個位點(diǎn)同時在2個環(huán)境及BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果中被檢測到，分別是2A上的AX-108794050（為10.369%，影響效應(yīng)未知）、2A上的AX-109857508（為11.109%，正效應(yīng)）、7B上的AX-110969164（為12.632%，正效應(yīng)）；另有2個單一環(huán)境位點(diǎn)是與BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果共有的位點(diǎn)，分別是4B上的AX-108838330（為11.109%，影響效應(yīng)未知）和6A上的AX-109467555（為11.109%，正效應(yīng)）。利用BLUP值關(guān)聯(lián)分析得到的與株高顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有12個，分布在2A、3A、5A、6A、1B、3B、4B、5B和7B上，可解釋1.029%—10.143%的株高表型變異，其中2A、6A和5B上各分布了2個；12個顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)中有5個已知正效應(yīng)的關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)，效應(yīng)值為5.771—8.701，其中位于5A的AX-110101561（為10.774%，影響效應(yīng)未知）的加性效應(yīng)值最大，為8.701。

穗長（spike length，SL）：6個環(huán)境下共檢測到74個與穗長顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布于小麥21條染色體上，單個位點(diǎn)可解釋8.709%—70.792%的穗長表型變異。上述顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)均僅在單一環(huán)境或數(shù)據(jù)集中被檢測到。其中有10個單一環(huán)境位點(diǎn)是與BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果共有的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在1A、2A、5A、6A、3B、7B和2D上，位于1A的AX-111524633解釋的表型變異率最大，為36.908%，且為負(fù)效應(yīng)。BLUP值與穗長顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有22個，分布在1A、2A、3A、5A、6A、3B、5B、7B、2D、4D、5D和7D上，可解釋9.142%—21.877%的穗長表型變異；其中1A、5A、6A和4D上各有3個關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)，2A、6A和5B上各有2個關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)；有7個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在6個環(huán)境下均未被檢測到，已知具有正效應(yīng)的7個SNP位點(diǎn)的效應(yīng)值為0.043—0.207。

小穗數(shù)（spikelet number，SN）：6個環(huán)境下共檢測到157個與小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布于小麥21條染色體上，單個位點(diǎn)可解釋8.745%—31.295%的小穗數(shù)表型變異，平均為14.528%。157個顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中有10個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)是與BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果共有的位點(diǎn)，其中9個是單一環(huán)境位點(diǎn)，位于3A的AX-108977066（為13.313，負(fù)效應(yīng)）是在3個環(huán)境下檢測到的重復(fù)位點(diǎn)，而位于4D的AX-110123746的正效應(yīng)值最大，為3.110。BLUP值與小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有12個，分布在1A、3A、4A、5A、7A、6B、7B和4D上，解釋9.220%—16.138%的小穗數(shù)表型變異，其中3A上有3個，4A和7A上各有2個，其余染色體都僅有1個；有6個已知具有正效應(yīng)，效應(yīng)值為0.793—3.110，位于4D上的AX-110123746（為11.129）的正效應(yīng)值最大，為1.609，位于7A的AX-110515818（為10.816，正效應(yīng)）在6個環(huán)境下均未檢測到。

可育小穗數(shù)（fertile spikelet number per spike，F(xiàn)SN）：6個環(huán)境下共檢測到209個與可育小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布于小麥21條染色體，單個位點(diǎn)可解釋8.971%—31.127%的可育小穗數(shù)表型變異。其中，有3個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)同時在2個環(huán)境下及BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果中被檢測到，分別是位于1A的AX-111523929（為22.522，影響效應(yīng)未知）、4D的AX-110123746（為17.663，正效應(yīng)）及7A的AX-111073226（為12.027，正效應(yīng)），另有3個單一環(huán)境位點(diǎn)在BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果中也被檢測到，分別是位于2A的AX-109545508（為16.738，影響效應(yīng)未知）、6B的AX-111074553（為16.594，影響效應(yīng)未知）、7B的AX-111700650（為15.936，影響效應(yīng)未知）。BLUP值與可育小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有7個，分布在1A、2A、7A、4B、6B、7B和4D上，解釋11.009%—16.598%的可育小穗數(shù)表型變異，其中有3個已知影響效應(yīng)的位點(diǎn)，位于4D的AX-110123746（為13.514，影響效應(yīng)未知）的正效應(yīng)值最大，為1.297；位于4B的AX-111180671（為11.009，正效應(yīng)）在6個環(huán)境下均未檢測到。

穗粒數(shù)（grain number per spike，GNPS）：6個環(huán)境下共檢測到264個與穗粒數(shù)顯著性關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布于小麥21條染色體，單個位點(diǎn)可解釋8.972%—55.210%的穗粒數(shù)表型變異，有2個單一環(huán)境位點(diǎn)和2個多環(huán)境位點(diǎn)同時在BLUP值關(guān)聯(lián)結(jié)果中被檢測到。2個單一環(huán)境位點(diǎn)分別是位于4B的AX-112290916（為16.722，負(fù)效應(yīng)），位于4D的AX-110270363（為21.613，影響效應(yīng)未知）。2個多環(huán)境重復(fù)位點(diǎn)分別是位于1A的AX- 108745367（為25.771，影響效應(yīng)未知），位于6A的AX-110509054（為22.688，負(fù)效應(yīng)）。BLUP值與穗粒數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有8個，可解釋8.972%—12.915%的穗粒數(shù)表型變異，其中1個位點(diǎn)的染色體位置未知，另7個分別是位于1A的AX-108745367、5A的AX-109470031、6A的AX- 110509054、1B的AX-108786643、4B的AX-112290916、4D的AX-110270363和6D的AX-110509054； 8個位點(diǎn)中已知影響效應(yīng)的僅有3個，且均為負(fù)效應(yīng)。

千粒重（thousand kernel weight，TKW）：6個環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)到27個千粒重SNP位點(diǎn)，分布在小麥的4A、1B、3B、5B、6B、7B、1D和4D染色體，可解釋7.259%—13.687%千粒重表型變異；27個位點(diǎn)均僅在單一環(huán)境中被檢測到，僅位于3B的AX-110399975（為11.608，負(fù)效應(yīng)）與BLUP值關(guān)聯(lián)位點(diǎn)重復(fù)。BLUP值與千粒重顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有9個，分布在4A、1B、3B、6B、1D和6D上，解釋8.498%—13.687%的千粒重表型變異；其中有6個已知影響效應(yīng)的位點(diǎn)，位于4A的AX-110401690（為11.570）、6B的AX-109825047（為11.479）和1D的AX-108818349（為12.598）為正效應(yīng)，位于6B的AX-109825047的效應(yīng)值最大，為1.299。

粒長（grain length，GL）：6個環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)到438個粒長SNP位點(diǎn)，在小麥21條染色體上均有分布，可解釋9.736%—17.537%的粒長表型變異，均為單一環(huán)境下檢測到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中427個SNP位點(diǎn)是在YN2017這個環(huán)境檢測到的，占關(guān)聯(lián)位點(diǎn)總數(shù)的97.488%；已知位于7B的AX-109477546的正效應(yīng)值最大，為1.175。

粒寬（grain width，GW）：6個環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)到32個粒寬SNP位點(diǎn)，均為單一環(huán)境的獨(dú)立位點(diǎn)，解釋8.690%—15.910%的粒寬表型變異，分布在小麥除1A、1D、3D、4D之外的其他17條染色體上，已知位于6D的AX-110382864正效應(yīng)值最大，僅為0.145。

籽粒長/寬（grain length/width ratio，GL/GW）：6個環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)到32個籽粒長/寬SNP位點(diǎn)，解釋9.232%—49.896%的籽粒長/寬表型變異，均為單一環(huán)境下的獨(dú)立位點(diǎn)，其中28個SNP位點(diǎn)是在YN2017環(huán)境下檢測到的，占關(guān)聯(lián)位點(diǎn)總數(shù)的87.500%。利用BLUP值未檢測到與粒長、粒寬、籽粒長/寬顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，說明在6個環(huán)境下籽粒性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)具有假陽性。

a：株高；b：穗長；c：小穗數(shù)；d：可育小穗數(shù)；e：穗粒數(shù)；f：千粒重 a: Plant height; b: Spike length; c: Spikelet number; d: Grain number per spike; e: Fertile spikelet number per spike; f: Thousand kernel weight

2.4 多性狀重復(fù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

在6個環(huán)境下檢測到的所有顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，僅有2個SNP位點(diǎn)是2個以上性狀共有的重復(fù)位點(diǎn)，這2個SNP位點(diǎn)利用BLUP值也同樣被檢測到。一個是位于1A的AX-111523929，分別解釋小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)的為13.458%、16.598%和23.810%，另一個是位于4D的AX-110123746，分別解釋小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)的為11.129%、13.514%和22.730%。利用BLUP值檢測到的同時與2個以上性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP重復(fù)位點(diǎn)有5個，可解釋10.817%—16.598%的表型變異，其中2個SNP位點(diǎn)是小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)3個性狀的共有位點(diǎn)，即1A的AX-111523929和4D的AX-110123746，另3個SNP位點(diǎn)為小穗數(shù)和可育小穗數(shù)的共有位點(diǎn)，分別是位于6B的AX-111074553、7A的AX-111073226和7B的AX-111700650；5個位點(diǎn)中位于7A的AX-111073226對小穗數(shù)和可育小穗數(shù)的正效應(yīng)值分別為0.794和0.614，位于4D的AX-110123746對小穗數(shù)、可育小穗數(shù)和穗粒數(shù)的正效應(yīng)值分別為1.609、1.297和18.948，另3個重復(fù)位點(diǎn)的影響效應(yīng)未知。

將同時與2個性狀或2個以上環(huán)境（BLUP值作為1個環(huán)境）相關(guān)聯(lián)的重復(fù)SNP位點(diǎn)作為穩(wěn)定的顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，9個性狀共計(jì)有38個穩(wěn)定關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)，包括株高重復(fù)位點(diǎn)5個，穗長重復(fù)位點(diǎn)10個，小穗數(shù)重復(fù)位點(diǎn)10個，可育小穗數(shù)重復(fù)位點(diǎn)6個，穗粒數(shù)重復(fù)位點(diǎn)6個，千粒重重復(fù)位點(diǎn)1個，此38個BLUP值穩(wěn)定關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)可以解釋9.10%—23.81%的表型變異（表1）。

2.5 關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的驗(yàn)證

對群體中的候選重復(fù)SNP位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，不同環(huán)境下各性狀根據(jù)多態(tài)性分組的表型值差異均達(dá)到極顯著水平（＜0.01）?；诤蜻x重復(fù)SNP位點(diǎn)的成對性狀，進(jìn)行了品種數(shù)量匯總和平均值計(jì)算（表3）?？梢钥闯觯?組成對性狀的品種數(shù)分別為1—61和116—179，這與6個環(huán)境下新疆冬小麥地方品種和育成品種的性狀表現(xiàn)基本一致，即134個地方品種的株高、穗長、小穗數(shù)、結(jié)實(shí)小穗數(shù)、籽粒長寬比均大于54個育成品種，而穗粒數(shù)、千粒重、粒長、粒寬均小于育成品種，育成品種9個農(nóng)藝產(chǎn)量性狀的變異系數(shù)均高于地方品種[24]。對單個性狀相關(guān)的重復(fù)SNP進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)到的優(yōu)良等位基因具有降低株高，增加穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重的作用，如AX-108838330中含有等位基因GG的品種有降低株高的作用，AX-110956005中含有等位基因TT的品種有增加穗長的作用，AX-110270363中含有等位基因GG的品種有增加穗粒數(shù)的作用（平均為51.39粒），AX-110399975中含有等位基因GG的品種有增加千粒重的作用（平均為35.5 g）?；谂c2個以上性狀相關(guān)的多效性SNP進(jìn)行驗(yàn)證，如AX-111073226中含有等位基因TT的品種、AX-111523929中含有等位基因AA的品種、AX-111074553中含有等位基因GG的品種、AX-110123746中含有等位基因CC的品種、AX-111700650中含有等位基因CC的品種顯示具有更多的小穗數(shù)和可育小穗數(shù)。

將38個重復(fù)SNP位點(diǎn)與已發(fā)布小麥基因組（IWGSC RefSeq v1.0：https://urgi.versailles.inra.fr/ download/iwgsc/IWGSC_RefSeq_Annotations/v1.0/）（IWGSC 2018）位點(diǎn)進(jìn)行比對，僅找到3個與本研究關(guān)聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)位置相近、且有注釋基因功能的基因，一個是2A染色體與本研究株高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX- 108794050距離相近的，該基因與轉(zhuǎn)錄因子bHLH71的代謝合成有關(guān)；另一個是1A染色體與本研究穗長關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-110689765距離相近的，該基因與蛋白質(zhì)編碼有關(guān)；4B染色體上與本研究千粒重關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX- 110399975距離相近的，與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SD1-8有關(guān)，參與對細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。

3 討論

3.1 小麥農(nóng)藝產(chǎn)量性狀表型變異

小麥（L.）是我國第三大糧食作物，對保障糧食供需平衡和國家糧食安全起著至關(guān)重要的作用[1]。農(nóng)藝與產(chǎn)量性狀可以直觀地反映品種的優(yōu)劣，具有易觀察、好測量的特點(diǎn)。20世紀(jì)中葉以來，針對農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀的研究在小麥改良中發(fā)揮了重要作用。即使在分子標(biāo)記技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，對小麥種質(zhì)資源和品種農(nóng)藝性狀的考察、分類與科學(xué)評價依然是育種工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容[25]。隨著生產(chǎn)條件的不斷改善和育種水平的不斷提高，我國北部冬麥區(qū)小麥品種的組成和主要性狀發(fā)生了很大變化，主要表現(xiàn)在株高和穗下節(jié)由長變短，主穗粒數(shù)、穗粒重和千粒重由小變大。這與多年來小麥品種選育以主攻產(chǎn)量的育種目標(biāo)密切相關(guān)[26-27]。馬艷明等[28]研究表明，新疆冬小麥育成品種的株高、穗長、小穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、籽粒長寬比的變異系數(shù)均大于地方品種，而粒長、粒寬的變異系數(shù)小于地方品種，說明育成品種的產(chǎn)量性狀變異高于地方品種。由于不同品種都有其自身固有的生態(tài)適應(yīng)性，其性狀表現(xiàn)是自身遺傳因子與環(huán)境條件相互作用的結(jié)果，而小麥大多數(shù)農(nóng)藝性狀（株高、穗長、穗粒數(shù)等）均為數(shù)量性狀，更易受到外界環(huán)境條件的影響，這就造成了不同生態(tài)條件下種植的小麥品種其生長發(fā)育特性差異明顯。因此，在不同研究中檢測到的QTL在定位位置、QTL數(shù)目和遺傳效應(yīng)等方面存在較大差異，給相關(guān)研究帶來了一定的困難[8, 29-30]。對材料進(jìn)行多年多點(diǎn)試驗(yàn)可以最大程度上降低生態(tài)環(huán)境對不同品種農(nóng)藝產(chǎn)量性狀的影響，增加QTL檢測的準(zhǔn)確性，同時還能對多個農(nóng)藝性狀同時進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖。

表1 38個重復(fù)位點(diǎn)的物理位置、值及解釋的表型變異率

Fig. 1 Physical locations,values and interpreted phenotypic variation rates of 38 repeat sites

續(xù)表1 Continued table 1

PH：株高；SL：穗長；SN：小穗數(shù)；FSN：可育小穗數(shù)；GNPS：穗粒數(shù)；TKW：千粒重；GL：粒長；GW：粒寬；GL/GW：籽粒長/寬

PH: plant height; SL: spike length; SN: spikelet number; FSN: fertile spikelet number per spike; GNPS: grain number per spike; TKW: thousand kernel weight; GL: grain length; GW: grain width; GL/GW: grain length/width ratio

3.2 影響關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的因素

全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）是剖析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的主要方法之一[31]，通過利用表型性狀和基因本身或基因附近微小區(qū)域的分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)來實(shí)現(xiàn)基因的精細(xì)定位[31-32]。全基因組關(guān)聯(lián)分析是以生物體在進(jìn)化過程中的基因重組和基因突變（位點(diǎn)變異）為基礎(chǔ)，定位的精細(xì)度與統(tǒng)計(jì)效力均會受位點(diǎn)數(shù)量與樣本數(shù)量的影響[33]。連鎖不平衡（LD）是GWAS的基礎(chǔ)，受到遺傳衰減、種群分層和自然選擇的影響，而群體分層被認(rèn)為是影響GWAS結(jié)果有效性的主要因素[34]。影響LD的因素都會對關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果產(chǎn)生影響，首要因素就是作物的群體結(jié)構(gòu)。許多重要作物都擁有漫長的馴化史，復(fù)雜的選育過程以及來自野生近緣種的遺傳漂變，造成了種質(zhì)資源內(nèi)存在著復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)[22]。當(dāng)研究所使用的群體存在較多亞群時，等位基因在基因組上的分布往往不平衡，可能造成標(biāo)記與數(shù)量性狀相關(guān)位點(diǎn)的假陽性關(guān)聯(lián)，從而使關(guān)聯(lián)分析更加復(fù)雜[35]。本研究在LD分析的基礎(chǔ)上，利用主成分分析法將所有小麥材料分為地方品種和選育品種兩個亞群，有效降低了對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響。

3.3 單個位點(diǎn)對多個性狀的遺傳效應(yīng)分析

遺傳學(xué)上通常會出現(xiàn)一個位點(diǎn)對多個性狀產(chǎn)生效應(yīng)，在作物研究中有很多這樣的報道。如Mora等[30]以來自智利、烏拉圭和國際玉米小麥改良中心（CMMITE）的382個春麥品種為材料，采用全基因組掃描法將SNP標(biāo)記對在不同環(huán)境下的株高、穗粒數(shù)、千粒重、產(chǎn)量等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于2D、1B、3B染色體的iniaGBS30112、iniaGBS33956、iniaGBS36569標(biāo)記分別只在1個環(huán)境下被檢測到與產(chǎn)量關(guān)聯(lián)，還有一些標(biāo)記與多個性狀關(guān)聯(lián)。Li等[36]選擇326 570個單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記對來自中國黃淮麥區(qū)的166個優(yōu)質(zhì)小麥品種進(jìn)行9個產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析，在8條染色體上檢測到12個多效性基因位點(diǎn)；其中3A染色體上的714.4—725.8 Mb區(qū)間與產(chǎn)量、穗粒數(shù)、粒寬、株高、最長節(jié)間長度和旗葉長顯著相關(guān)。Sun等[8]利用90K SNP芯片對163個小麥品種的13個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測到5個多效性SNP與3個或更多性狀相關(guān)。本研究檢測到5個多效SNP同時與小穗數(shù)、結(jié)實(shí)小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)，而小穗數(shù)與結(jié)實(shí)小穗數(shù)之間存在極顯著相關(guān)性，因此必然會有相同的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

4 結(jié)論

利用多位點(diǎn)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（MLM）對小麥9個產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，在6個環(huán)境和綜合BLUP值條件下分別檢測到1 309和66個與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，其中，與2個性狀或2個以上環(huán)境（BLUP值作為1個環(huán)境）相關(guān)聯(lián)的重復(fù)SNP位點(diǎn)有38個。結(jié)合基因功能注釋，篩選出3個重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀候選基因。

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Genome-wide association analysis of Yield Traits in Xinjiang Winter Wheat Germplasm

1Institute of Crop Germplasm Resource, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091;2College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193;3Institute of Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097;4Institute of Agricultural Sciences of Ili Prefecture, Yining 835011, Xinjiang;5College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong

【Objective】To discover new high yield genes in wheat by association analysis, which can provide technical supports for the innovation and genetic improvement of high yield germplasm resources in wheat.【Method】Totally 188 bread wheat cultivars in Xinjiang were genotyped using the wheat 55K genotyping assay. GWAS was carried out to identify the signifcant single nucleotide polymorphisms (SNPs) which were associated with 9 wheat yield traits in 6 environments. The MLM algorithm in TASSEL5.0 was used to analyze the nine traits related to wheat yield traits.【Result】Totally 1309 SNPs explained 7.259%-70.792% of the phenotypic variation. 38 SNP loci were identifed, which were significantly correlated with 5 plant height weight SNP loci, 10 spike length weight SNP loci, 10 spikelet number SNP loci, 6 fertile spikelet number SNP loci, 6 spike grain number SNP loci, and 1 thousand grain weight SNP loci. These loci can explain 9.10%-23.81% of phenotypic variations. Comparing these 38 loci with the published wheat genome loci, only 3 functional genes were found, which annotated with gene function. There genes are:on chromosome 2A, which is close to the plant height associated site AX-108794050 and is related to the metabolic synthesis of transcription factor bHLH71;, located on chromosome 1A at a distance similar to the spike length associated site AX-110689765, is related to protein coding;, located on the 4B chromosome at a distance similar to the 1000 grain weight associated site AX-110399975, is associated with the encoding serine/threonine protein kinase SD1-8 and is involved in regulating cell proliferation and differentiation. 【Conclusion】38 QTL loci associated with wheat yield traits were detected. After verification, it was found that the associated excellent alleles have the effect of reducing plant height, increasing spike length, spikelet number, fertile spikelet number, grain number per spike, and thousand grain weight.

wheat; yield traits; SNP; association analysis; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.001

2023-03-27；

2023-05-25

國家科技資源共享服務(wù)平臺-國家作物種質(zhì)資源庫項(xiàng)目（NCGRC-2021-029）

馬艷明，Tel：13999260539；E-mail：ymma213@sina.com。通信作者劉杰，Tel：010-62734072；E-mail：jieliu@cau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）