葡萄鐵蛋白基因Ferritin的鑒定、克隆及其在果實(shí)發(fā)育不同時期對氨基酸鐵復(fù)合肥噴施的響應(yīng)

宋志忠，王建萍，史圣朋，曹晶雯，劉萬好，徐維華，肖慧琳，唐美玲

葡萄鐵蛋白基因的鑒定、克隆及其在果實(shí)發(fā)育不同時期對氨基酸鐵復(fù)合肥噴施的響應(yīng)

宋志忠1,2,3，王建萍1,2，史圣朋3,4，曹晶雯2，劉萬好1，徐維華1，肖慧琳，唐美玲

1煙臺農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院葡萄研究所，中國山東煙臺 264000；2魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院/山東省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種實(shí)驗(yàn)室），中國山東煙臺 264025；3劍橋大學(xué)植物系，英國劍橋 CB2 3EA；4劍橋大學(xué)沃爾森學(xué)院，英國劍橋 CB3 9BB）

【目的】鐵蛋白Ferritin在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其在果樹中的生物學(xué)功能尚未見報道。克隆葡萄Ferritin家族基因并揭示其在果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)模式及其對葉面噴施氨基酸-鐵（Fe）復(fù)合肥處理的響應(yīng)差異，可為研究果樹鐵素營養(yǎng)與代謝的分子機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^同源克隆法從‘馬瑟蘭’中克隆Ferritin家族基因，利用生物信息學(xué)手段分析葡萄及其編碼蛋白的詳細(xì)特征；設(shè)置葉面噴施氨基酸-Fe復(fù)合肥處理，利用熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)分析在葡萄果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)特征及其對葉面噴施處理的差異響應(yīng)。【結(jié)果】在葡萄基因組中檢索并克隆獲得4個Ferritin家族基因，命名為—，分布于第6、8和13號三條染色體上，均含有7個長度不一的內(nèi)含子，且主要定位于葉綠體和細(xì)胞核。本文所選16種植物Ferritin蛋白序列的一致性高達(dá)61.48%，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明同一屬的Ferritin同源蛋白如十字花科的擬南芥和蕪菁，茄科的煙草和馬鈴薯，豆科的大豆、落花生和鷹嘴豆，大戟科的橡膠樹、木薯和蓖麻，薔薇科的蘋果、桃和草莓，遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，葡萄VvFer3和茄科同源蛋白遺傳關(guān)系最近。葡萄VvFer基因在五年生‘馬瑟蘭’果實(shí)發(fā)育不同時期、不同組織中的表達(dá)水平差異較大，其中，在不同組織中的表達(dá)量均最高，最大值出現(xiàn)在硬核期至成熟期的果實(shí)中，其次是和?！R瑟蘭’葡萄發(fā)育不同時期果實(shí)中的Fe含量略有差異，從幼果期開始逐漸增加，并在轉(zhuǎn)色期果實(shí)中達(dá)到最高值，從轉(zhuǎn)色期到成熟期略有下降，但仍高于幼果期和硬核期果實(shí)中的Fe含量，葉面噴施處理顯著提高了成熟期果實(shí)中的Fe含量、烏頭酸酶ACO（aconitase）、硝酸還原酶NIR（nitrite reductase）和琥珀酸脫氫酶SDH（succinate dehydrogenase）的酶活性?！谵D(zhuǎn)錄水平易受葉面噴施鐵肥的誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)，且與葡萄組織/器官分布和果實(shí)發(fā)育的不同時期密切相關(guān)，在葡萄發(fā)育整個周期僅在果實(shí)中對葉面噴施鐵肥處理比較敏感，在所有組織中僅從幼果期至轉(zhuǎn)色期對葉面噴施鐵肥有響應(yīng)，在葡萄發(fā)育整個周期的韌皮部和葉片中持續(xù)受葉面噴施鐵肥的誘導(dǎo)，而在果實(shí)中僅從幼果期至轉(zhuǎn)色期對葉面噴施鐵肥有響應(yīng)；在本文所選組織中的表達(dá)量相對較低，但很均勻，且在轉(zhuǎn)錄水平對葉面噴施鐵肥沒有響應(yīng)?！窘Y(jié)論】從葡萄中克隆并鑒定了4個鐵蛋白基因，其在葡萄發(fā)育不同時期、不同組織中的表達(dá)水平差異較大，并在轉(zhuǎn)錄水平易受葉面噴施鐵肥的誘導(dǎo)；在葡萄所有組織中的整體表達(dá)量最高（特別是果實(shí)中最為突出），且在幼果期至轉(zhuǎn)色期易受鐵肥葉面噴施的調(diào)控。

葡萄；Fe的儲藏與封存；Fe蛋白；氨基酸-Fe復(fù)合肥；葉面噴施

0 引言

【研究意義】鐵（Fe）是植物細(xì)胞中含量較為豐富的礦物元素之一，參與多種代謝途徑和生命過程[1-3]，土壤缺鐵導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)降低[4-6]。鐵蛋白Ferritin參與Fe的儲藏和封存過程，在植物的生命過程中具有至關(guān)重要的作用。鑒定和克隆果樹Ferritin家族基因，為研究果樹Fe的轉(zhuǎn)運(yùn)與分配機(jī)制提供參考，并為解析果樹Fe素營養(yǎng)和高效利用奠定理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果樹學(xué)中，F(xiàn)e肥施用與果樹的生長、發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)形成和產(chǎn)量密切相關(guān)，土壤缺Fe不利于果樹的生長和發(fā)育，造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)或品質(zhì)降低[4-7]。高等植物為適應(yīng)缺Fe脅迫而進(jìn)化出的兩種根際Fe吸收策略[7-10]：雙子葉植物和非禾本科單子葉植物的吸收策略Ⅰ，通過鐵還原酶FRO（ferric reduction oxidase）將根系周圍的Fe3+被還原為Fe2+，再通過鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT（iron-regulated transporter）進(jìn)入根系被植物吸收利用[7,10-11]；禾本科植物的吸收策略Ⅱ，通過將Fe3+與麥根酸MA（mugineic acid）成Fe3+-MA螯合物，由載體PS（phytosiderophore）途徑轉(zhuǎn)運(yùn)吸收Fe3+[9-12]。當(dāng)Fe進(jìn)入細(xì)胞后，NRAMP（natural resistance associated macrophage proteins）、PIC（permease in chloroplast）和VIT（vacuolar iron transporter）等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與Fe在植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分配[7,10-14]。通常，細(xì)胞內(nèi)的Fe儲存在液泡中，也可能被螯合成鐵蛋白Ferritin，用于各種依賴于Fe的代謝途徑和生理過程。Ferritin對于微調(diào)代謝所需的多種金屬元素的含量至關(guān)重要[13-14]。質(zhì)體可充當(dāng)細(xì)胞中Fe池的作用，能感知和維持細(xì)胞中Fe的濃度以適應(yīng)外界不同F(xiàn)e素供應(yīng)的變化。Ferritin是一類由核基因編碼的24聚體，其結(jié)構(gòu)在真核生物中高度保守[13-14]。擬南芥中已鑒定出4個Ferritin家族基因（—），在轉(zhuǎn)錄水平受過量鐵毒害、H2O2、脫落酸ABA（abscisic acid）等非生物脅迫的調(diào)控[13-15]。AtFER定位于葉綠體中并與Fe形成復(fù)合物，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Fe的儲藏和封存，并維持植物耐受干旱[16]、失水脅迫[17]、活性氧ROS（reactive oxygen species）[13,18-19]等外界不利環(huán)境的脅迫。近年來，F(xiàn)erritin家族基因在梨[20]、月季[17]、大豆[21]、木薯[22]等植物中被陸續(xù)克隆和報道。鐘晨等[20]從‘碭山酥梨’中克隆了一個，其在葉片中的表達(dá)水平受輕度缺鐵的誘導(dǎo)而增強(qiáng)，且隨著缺鐵程度的增加，其表達(dá)量顯著下降。Liu等[17]從月季花瓣中克隆了一個參與花瓣失水脅迫耐性和衰老進(jìn)程的鐵蛋白基因，其表達(dá)水平受ABA和失水脅迫的誘導(dǎo)，沉默和分別降低了月季花瓣的失水脅迫耐性，進(jìn)一步研究表明在失水脅迫過程中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)依賴?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)外學(xué)者對植物Fe吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的分子機(jī)制研究主要集中在擬南芥、水稻等一年生模式植物[8-14]，有關(guān)果樹Fe素營養(yǎng)與高效利用的分子機(jī)制研究較少。葡萄（L.）是一種全球性的水果作物，其基因組序列已公布[23]。在維持植物生長和發(fā)育所必需的諸多微量元素中，葡萄對Fe的需求量最大，F(xiàn)e與葡萄品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)[4-6]。然而，葡萄對Fe吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的分子機(jī)制尚不清楚，葡萄鐵蛋白Ferritin的生物學(xué)功能依然未知。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘馬瑟蘭’葡萄為材料，克隆葡萄Ferritin家族基因并鑒定其生物信息學(xué)特征，明確其在葡萄不同發(fā)育時期、不同組織部位的表達(dá)特征及其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)差異，為研究葡萄Ferritin和果樹鐵素營養(yǎng)與高效利用的分子機(jī)制提供基因資源。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年5月至2023年2月在“十三五”山東省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種實(shí)驗(yàn)室和劍橋大學(xué)植物系離子運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)室合作完成。

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試材料為山東省煙臺市葡萄酒產(chǎn)區(qū)主栽品種‘馬瑟蘭’，由山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹所提供，種植在國家產(chǎn)業(yè)體系煙臺葡萄試驗(yàn)站，樹體健壯，南北行向，常規(guī)田間管理。參照張璐等[24]與房經(jīng)貴等[25]的描述，分別采集五年生‘馬瑟蘭’盛花后35 d（35 DAFB，屬于幼果期）、50 d（50 DAFB，硬核期）、70 d（70 DAFB，轉(zhuǎn)色期）、85 d（85 DAFB，第二次膨大期）和115 d（115 DAFB，成熟期）的果實(shí)、結(jié)果枝中間部分的葉片及韌皮部材料，用液氮冷凍并保存于-80℃低溫冰箱中備用。

根據(jù)含氨基酸水溶性肥料（微量元素型）液體產(chǎn)品國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY1429—2007）配制氨基酸-鐵水溶性液體肥料[26-27]，F(xiàn)eSO4的終濃度為1 000 mg?kg-1。參照Song等[26]和Sheng等[27]的描述，分別于幼果期、轉(zhuǎn)色期和第二次膨大期前的第7天進(jìn)行氨基酸-Fe水溶性液體肥料葉面噴施處理，6棵葡萄樹一組，共噴施3組，以葉片上噴施的液體能均勻滴落為準(zhǔn)，噴施蒸餾水的樹體作為對照，分別于35 DAFB（幼果期）、50 DAFB（硬核期）、70 DAFB（轉(zhuǎn)色期）、85 DAFB（第二次膨大期）和115 DAFB（成熟期）采集噴施鐵肥處理后的果實(shí)、結(jié)果枝中間部分的葉片及韌皮部材料，用于實(shí)時熒光定量PCR分析，其中果實(shí)材料進(jìn)一步用于Fe含量測定。

1.2 生理指標(biāo)分析

參照Song等[24,28-29]和Sheng等[27]的描述，葡萄果實(shí)材料烘干后利用HNO3-HClO4法消解，通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀ICP-AES（IRIS Advantage, Thermo Electron, USA）測定發(fā)育不同時期果實(shí)中的Fe含量。參照Song等[24,28-29]和Sheng等[27]描述的方法測定葡萄果實(shí)中烏頭酸酶（aconitase，ACO）的活性，利用中國南京建成生物工程研究所研發(fā)的檢測試劑盒測定葡萄果實(shí)中硝酸還原酶（nitrite reductase，NIR）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）的活性[24,25-29]。

1.3 葡萄VvFer克隆

以擬南芥的氨基酸序列為參考序列[13,15]，在Phytozome Grape Genome Database（http://www.phytozome.net）中檢索葡萄基因組中相對應(yīng)的Ferritin家族基因，檢索結(jié)果在Pfam（http://pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Phytozome獲得的葡萄的CDS（coding sequence）電子序列，分別設(shè)計上、下游引物（表1），利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）從‘馬瑟蘭’整株組培苗中擴(kuò)增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表1 葡萄Ferritin家族基因CDS擴(kuò)增所需引物

1.4 葡萄VvFer的生物信息學(xué)分析

利用‘馬瑟蘭’中克隆并測序驗(yàn)證的編碼區(qū)CDS序列和編碼氨基酸序列，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中獲得VvFer家族基因的基因組DNA序列，利用Gene Structure Display（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線服務(wù)器進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；通過在線工具Expasy（http://web.expasy.org/program/）預(yù)測VvFer蛋白的理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、總平均親水性GRAVY（grand average of hydropathicity）等理化性質(zhì)；通過MEME（v4.8.1）在線服務(wù)器（http://meme- suite.org/tools/meme）預(yù)測VvFer蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用TMpredict在線軟件（http://ch.embnet.org/ software/TMPRED_form.html）預(yù)測VvFer蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；借助在線軟件SignalP4.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-4.0/）預(yù)測葡萄VvFer蛋白的信號肽情況；利用PSORT在線服務(wù)器（http://psort.hgc. jp/form.html）預(yù)測VvFer蛋白的亞細(xì)胞定位；借助Phyre2在線服務(wù)器（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi?id=index）預(yù)測VvFer蛋白的三級結(jié)構(gòu)。根據(jù)施富超[22]的描述，在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥AtFer1—4（Gene ID: 818622、820276、824775、831720）、落花生AdFer1—4（107485043、107475384、107469395、107478374）、油茶BnFer1—4（106433816、106452550、106382764、106391722）、蕪菁BrFer1—3（103855410、103870409、103830031）、鷹嘴豆CaFer1 —3（101503152、101498435、101510209）、陸地棉GhFer1—3（107943203、107960065、107904058）、大豆GmFer1-4（547824、547988、547476、547477）、橡膠樹HbFer2—4（110640712、110645561、110638947）、蘋果MdFer3—4（103406424、103450693）、木薯MeFer1—4（110619691、110622202、110624811、110619936）、煙草NtFer1—2（107789800、107832545）、桃PpFer3-4（18787640、18773611）、蓖麻RcFer2—3（8263108、8272083）、馬鈴薯StFer1—2（102577492、102581985）、草莓FvFer3—4（101293015、105353074），根據(jù)王壯偉等[30]的描述，利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 8.0中的最大相似法（Maximum-likelihood）構(gòu)建不同植物物種Ferritin蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 總RNA提取與實(shí)時熒光定量PCR分析

采集五年生‘馬瑟蘭’樹體不同發(fā)育時期的果實(shí)和葉片，通過RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）（Tiangen，北京）提取葡萄樣品的總RNA，并利用Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）100rxn（TIANGEN，北京）合成第一鏈cDNA作為模板，采用Perfect Start Green qPCR Super Mix（TransGen，北京）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。利用NCBI/PrimerBLAST在線服務(wù)器，設(shè)計的特異性表達(dá)引物（表2）。以葡萄（GenBank No. MH114011）[24,30-31]為內(nèi)參，通過BIO-RAD實(shí)時熒光定量PCR儀檢測在不同組織部位的表達(dá)特征。反應(yīng)體系參照說明書的描述，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30s；95℃5s，60℃34s（40個循環(huán)）；72℃10 s。每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，不同樣品在實(shí)時熒光定量PCR儀獲得相應(yīng)的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因均一化處理后，采用2-ΔΔCT法計算的相對表達(dá)量[24,25-31]。根據(jù)Deng等[32]的描述，通過Log2計算法分析葉面噴施前后表達(dá)量的變化倍數(shù)，通過HemI軟件制作表達(dá)差異變化的熱圖，分別以對照條件下的表達(dá)值設(shè)定為1，若葉面噴施處理?xiàng)l件下的表達(dá)值＜1，表示基因表達(dá)水平被下調(diào)；表達(dá)值＞1，則表示基因表達(dá)水平被上調(diào)。

表2 本文所用特異性表達(dá)引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0（SPSS Chicago，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，在葉面噴施鐵肥處理與對照條件下兩個獨(dú)立樣品間進(jìn)行檢驗(yàn)（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 葡萄VvFer檢索與鑒定

以擬南芥的氨基酸序列為參考序列[12,15]，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到4個潛在的同源蛋白，檢索結(jié)果在Pfam在線服務(wù)器均檢測到Ferritin-like diiron domain（PF00210）功能結(jié)構(gòu)域，屬于典型的鐵蛋白Ferritin。下載同源基因的CDS電子序列，以起始密碼子ATG和終止密碼子TAG所在位置20 bp左右的序列作為上、下游引物，以‘馬瑟蘭’組培幼苗整株RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過高保真酶擴(kuò)增葡萄Ferritin家族基因的CDS，測序驗(yàn)證后分別命名為（圖1、表3）。

圖1 VvFer氨基酸序列比對分析

表3 VvFer及其編碼蛋白信息

2.2 植物Ferritin同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

測序驗(yàn)證后，獲得的編碼蛋白，同時，在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載擬南芥（十字花科）、蕪菁（十字花科）、油茶（山茶科）、鷹嘴豆（豆科）、大豆（豆科）、落花生（豆科）、陸地棉（棉葵科）、橡膠樹（大戟科）、木薯（大戟科）、蓖麻（大戟科）、馬鈴薯（茄科）、煙草（茄科）、蘋果（薔薇科）、桃（薔薇科）、草莓（薔薇科）等植物Ferritin同源蛋白序列，氨基酸序列比對結(jié)果表明16種不同科屬植物Ferritin蛋白之間具有較高的同源性（圖1），在氨基酸水平的一致性為61.48%（數(shù)據(jù)未顯示），同源關(guān)系較近的兩者之間的序列一致性均高于66.50%。此外，4個VvFer蛋白在氨基酸水平的一致性為71.17%（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明：16種不同科屬植物的Ferritin家族蛋白可分為2個亞族：Group I和Ⅱ，其中，葡萄VvFer3屬于Group I，而其他3個成員屬于Group Ⅱ（圖2）。

16種植物Ferritin家族蛋白在遺傳進(jìn)化關(guān)系上有差異，屬于同一科屬植物的同源蛋白傾向于聚在一起，如擬南芥和蕪菁同屬于十字花科，煙草和馬鈴薯同屬于茄科，其Ferritin同源蛋白分別緊密地聚在一起；同樣地，大豆、落花生和鷹嘴豆同屬于豆科植物，橡膠樹、木薯和蓖麻同屬于大戟科植物，蘋果、桃和草莓同屬于薔薇科植物，其同源蛋白成員之間的遺傳距離相較于其他科屬的植物也較近，在系統(tǒng)發(fā)育樹上傾向于緊密聚在一起（圖2）。但VvFer3傾向于和茄科（煙草和馬鈴薯）同源蛋白的遺傳進(jìn)化距離更近，而屬于Group Ⅱ的3個葡萄VvFer緊密聚集在一起，但與其他植物的遺傳進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)（圖2）。

2.3 VvFer基因及其編碼蛋白特征

VvFer基因主要定位于6號（）、8號（和）和13號（）染色體上（表3），均含有7個長度不一的內(nèi)含子（圖3）。保守基序分析結(jié)果表明VvFer1含有所有Motif基序（Motif 1—7），其特征序列見圖4，其中，VvFer2缺失Motif 4，VvFer4缺失Motif 5，而VvFer3缺失Motif 4和Motif 5（圖3）；葡萄VvFer的等電點(diǎn)PI均＜7.00，說明含有的酸性氨基酸較多；VvFer1和VvFer2含有3個跨膜區(qū)，VvFer3含有1個跨膜區(qū)，VvFer4不含有典型的跨膜區(qū)，且葡萄VvFer均不含有信號肽；VvFer1—3的不穩(wěn)定指數(shù)均＞40，為不穩(wěn)定蛋白，而VvFer4的不穩(wěn)定指數(shù)＜40，為穩(wěn)定蛋白（表3）。此外，葡萄VvFer蛋白具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（圖5）。

2.4 VvFer蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明VvFer主要定位在細(xì)胞核和葉綠體中。其中，VvFer1和VvFer2主要定位在細(xì)胞核，其次是葉綠體和線粒體；VvFer3和VvFer4主要定位在葉綠體，其次是細(xì)胞核（VvFer4除外）和線粒體。此外，VvFer2在細(xì)胞質(zhì)中也有少量的定位分布（表4）。

2.5 VvFer在果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)特征

—在成年‘馬瑟蘭’果實(shí)發(fā)育不同時期各組織中的表達(dá)量存在差異（圖6）。在葡萄發(fā)育不同時期各組織中的整體表達(dá)水平均最高，其次是和，而在葡萄果實(shí)發(fā)育不同時期各采樣組織中的表達(dá)量相對較低。具體表現(xiàn)為，‘馬瑟蘭’果實(shí)發(fā)育的整個時期（即從幼果期到成熟期），和在果實(shí)中的表達(dá)量高于葉片和韌皮部，且在不同組織中的表達(dá)量隨著發(fā)育時期的推進(jìn)逐漸增加，在果實(shí)中的表達(dá)量于轉(zhuǎn)色期達(dá)到最高水平并持續(xù)到成熟期，在果實(shí)中的表達(dá)量于硬核期便達(dá)到最高水平并維持到成熟期；在葉片中的表達(dá)量高于果實(shí)和韌皮部，且隨著發(fā)育時期的推進(jìn)而逐漸降低，在葉片中的表達(dá)量于幼果期至硬核期達(dá)到最高水平（圖6）。

圖2 植物Ferritin同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 VvFer亞細(xì)胞定位預(yù)測

圖3 基序和基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 不同基序的特征序列

圖5 VvFer蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

YFS：幼果期；HCS：硬核期；VS：轉(zhuǎn)色期；SES：第二次膨大期；MS：成熟期。下同

2.6 VvFer對葉面噴施鐵肥處理的響應(yīng)差異

‘馬瑟蘭’發(fā)育不同時期果實(shí)中的Fe含量略有差異：從幼果期開始逐漸增加，并在膨大期果實(shí)中達(dá)到最高值，從膨大期到成熟期略有下降，但仍高于幼果期和硬核期果實(shí)中的Fe含量（圖7）；與對照相比，葉面噴施鐵肥處理顯著提高了幼果期至第二次膨大期果實(shí)中的Fe含量（圖7）。此外，葉面噴施鐵肥處理顯著提高了成熟期果實(shí)中ACO、NiR和SDH 3種Fe-S蛋白的酶活性（表5）。

*：差異顯著（P＜0.05）；**：差異極顯著（P＜0.01）。下同

在‘馬瑟蘭’果實(shí)發(fā)育不同時期，—在轉(zhuǎn)錄水平對葉面噴施鐵肥的響應(yīng)存在差異（圖8）。在整個葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，和在果實(shí)中高表達(dá)。其中，在整個發(fā)育期果實(shí)中的表達(dá)水平傾向于受葉面噴施鐵肥的誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)；從幼果期至硬核期，在所有檢測組織中的表達(dá)水平傾向于受葉面噴施處理的誘導(dǎo)而顯著增加；此外，在轉(zhuǎn)色期葉片和韌皮部的表達(dá)也受葉面噴施鐵肥的誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)。雖然整體表達(dá)量相對較低，但在轉(zhuǎn)錄水平易受葉面噴施鐵肥的影響，從幼果期至成熟期，在所有檢測組織中的表達(dá)水平顯著被誘導(dǎo)而上調(diào)；此外，從第二次膨大期至成熟期，在韌皮部和葉片中的表達(dá)量持續(xù)被誘導(dǎo)而增加。整個葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，在采樣組織中的表達(dá)量極低，且在轉(zhuǎn)錄水平對葉面噴施鐵肥處理沒有任何響應(yīng)（圖8）。

表5 葉面噴施鐵肥對成熟期果實(shí)Fe-S蛋白酶活性的影響

*：差異顯著（＜0.05）；**：差異極顯著（＜0.01）

*: Significant difference (＜0.05); **: Extremely significant difference

圖8 VvFer在轉(zhuǎn)錄水平對葉面噴施鐵肥的響應(yīng)差異

3 討論

果園中，F(xiàn)e肥施用與果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)，然而，果樹中Fe營養(yǎng)與高效利用的分子機(jī)制尚未見報道，本研究從葡萄中克隆并鑒定了4個鐵蛋白Ferritin家族基因，為解析葡萄Fe的儲藏和封存機(jī)制提供了參考。

3.1 VvFer蛋白的定位特征及VvFer的組織特異性表達(dá)差異

擬南芥AtFer1、AtFer3和AtFer4主要定位于葉綠體中，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Fe的儲藏和封存，并維持植物耐受干旱[16]、失水脅迫[18]、活性氧ROS[13,18-19]等不利環(huán)境的脅迫。本研究預(yù)測結(jié)果表明VvFer3和VvFer4主要定位于葉綠體上，這兩個葡萄鐵蛋白可能具有與AtFer相似的生物學(xué)功能。

在幼果期至硬核期的葡萄葉片中高量表達(dá)，暗示該基因傾向于在果實(shí)發(fā)育初期的葉片中發(fā)揮鐵蛋白的作用，這些結(jié)果與擬南芥、和[12-15]、碭山酥梨[33]和月季[17]在植株葉片中高量表達(dá)的報道相吻合，表明植物Ferritin傾向于在地上部發(fā)揮儲藏和封存Fe2+的功能。本研究發(fā)現(xiàn)和在發(fā)育初期的果實(shí)中高量表達(dá)，特別是在葡萄發(fā)育不同時期果實(shí)中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他檢測組織，且VvFer3僅定位于液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜，說明該基因可能在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中（特別是硬核期至果實(shí)成熟這一關(guān)鍵發(fā)育時期）參與果肉細(xì)胞質(zhì)體中Fe2+的儲藏，進(jìn)而在調(diào)節(jié)或維持果肉細(xì)胞Fe2+和其他金屬元素的動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 葉面噴施鐵肥提升葡萄果實(shí)的Fe素營養(yǎng)狀況

果樹在秋季發(fā)生養(yǎng)分回流，以實(shí)現(xiàn)果樹體內(nèi)養(yǎng)分的循環(huán)利用[33-34]。秋冬季節(jié)，桃樹葉片開始衰老，葉片中的Fe含量逐漸降低[27]，葉面噴施Fe肥可有效促進(jìn)桃葉片的發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的提升，并增強(qiáng)桃葉片和果實(shí)中的Fe含量及Fe-S簇裝配機(jī)制相關(guān)基因的表達(dá)[26-27,33]。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)中的Fe含量在果實(shí)發(fā)育初期逐漸升高，在果實(shí)形成最終大小時達(dá)到最高值，并在進(jìn)入夏末秋初（第二次膨大期至成熟期）開始降低，暗示葡萄成熟后（或達(dá)到經(jīng)濟(jì)采收期）果實(shí)體內(nèi)的各種代謝活動將變緩，此時所需的Fe可能向葉片或韌皮部、枝干進(jìn)行回流。另外，葉面噴施有效增強(qiáng)了膨大期果實(shí)中的Fe含量，并提升了依賴于Fe的關(guān)鍵Fe-S蛋白（如ACO、NiR和SDH）的活性，這些發(fā)現(xiàn)與SONG等[26-27]在桃上的報道一致，再次證實(shí)合理的噴施鐵肥可有效改善果實(shí)中Fe的營養(yǎng)狀況和增強(qiáng)依賴于Fe的生命代謝活動。

3.3 葉面噴施鐵肥調(diào)控VvFer的表達(dá)

在轉(zhuǎn)錄水平，對葉面噴施鐵肥處理的響應(yīng)特征存在差異，且與葡萄組織/器官分布和果實(shí)發(fā)育的不同時期密切相關(guān)：除對葉面噴施鐵肥處理沒有任何響應(yīng)外，其他3個基因（、和）對葉面噴施鐵肥處理較為敏感，其表達(dá)水平傾向于被誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)；此外，僅在果實(shí)中對葉面噴施鐵肥比較敏感，且貫穿整個果實(shí)發(fā)育周期，而和傾向于在幼果期至轉(zhuǎn)色期對葉面噴施鐵肥有響應(yīng)，暗示這兩個基因在果實(shí)發(fā)育至最大后不再發(fā)揮作用。在葡萄形成最終果實(shí)大小之前的關(guān)鍵發(fā)育時期，需要更多的Fe2+用于果實(shí)發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的形成[25,35]。當(dāng)進(jìn)行葉面噴施鐵肥處理后，在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)傾向于受葉面噴施的誘導(dǎo)而增強(qiáng)發(fā)揮鐵蛋白的功能，儲存更多的Fe2+用于維持果實(shí)發(fā)育及其他組織或器官中依賴于Fe的代謝活動或生理途徑，在一定程度上解釋了為何膨大期果實(shí)中的Fe含量及ACO、NiR和SDH酶活性受葉面噴施的誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)。

在正常土壤營養(yǎng)狀況和常規(guī)栽培條件下，當(dāng)果實(shí)發(fā)育進(jìn)入第二次膨大期，葡萄體內(nèi)表達(dá)豐度已經(jīng)足夠滿足葡萄發(fā)育后期對鐵蛋白的需求。與此同時，—從葡萄幼果期至轉(zhuǎn)色期的表達(dá)水平逐漸達(dá)到最高值，充分保證葡萄樹體在果實(shí)發(fā)育前期積累了足夠多的Fe2+。特別是（在果實(shí)發(fā)育整個時期不同檢測組織中的表達(dá)量為其他基因的7—30倍），進(jìn)入硬核期后，其果實(shí)、韌皮部和葉片中持續(xù)穩(wěn)定的高量表達(dá)，能夠保障發(fā)揮其鐵蛋白的活性，因此，在第二次膨大期至成熟期不再受葉面噴施鐵肥的影響。后續(xù)將進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)，深入探討葉面噴施鐵肥對葡萄果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量及后期葡萄酒發(fā)酵的影響，并通過分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步揭示關(guān)鍵在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中的具體生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

從葡萄中克隆并鑒定了4個Ferritin家族基因，其在葡萄果實(shí)發(fā)育不同時期、不同組織中的表達(dá)水平差異較大，并在轉(zhuǎn)錄水平易受葉面噴施鐵肥處理的誘導(dǎo)；在葡萄所有組織中的整體表達(dá)量最高（特別是果實(shí)中最為突出），且在幼果期至轉(zhuǎn)色期易受葉面噴施鐵肥的調(diào)控；VvFer3和茄科同源蛋白之間的遺傳進(jìn)化距離最接近，研究結(jié)果為解析葡萄鐵蛋白Ferritin的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

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Identification and Cloning ofFerritinFamily Genes in Grape and Response to Compound Amino Acid-Iron Spraying During Different Fruit Developmental Stages

SONG ZhiZhong1,2,3, WANG JianPing1,2, SHI ShengPeng3,4, CAO JingWen2, LIU WanHao1，XU WeiHua1, XIAO HuiLin1,2*, TANG MeiLing1,2*

1Institute of Grape, Yantai Academy of Agricultural Science, Yantai 264000, Shandong, China;2The Engineering Research Institute of Agriculture and Forestry, Universities of Shandong Ludong University/Key Laboratory of Molecular Module-Based Breeding of High Yield and Abiotic Resistant Plants, Yantai 264025, Shandong, China;3Department of Plant Science, University of Cambridge, Cambridge CB2 3EA, United Kingdom;4Wolfson College, University of Cambridge, Cambridge CB3 9BB, United Kingdom

【Objective】Ferritin plays an important role in plant growth and development, and its biological function in fruit trees are essentially unknown. Cloning of grape Ferritin family genes and revealing their expression patterns at different fruit developmental stages and their response differences to foliar spraying of amino acid iron (Fe) compound fertilizers could provide a theoretical basis for studying the molecular mechanisms of Fe nutrition and metabolism in fruit trees. 【Method】The Ferritin family genes were screened and identified in grape genome by homologous cloning. The detailed characteristics ofgenes and their encoded proteins were analyzed by using bioinformatical methods. The tissue-specific expression patterns of Ferritin family genes during distinct fruit developmental stages and differential response to foliar spraying of amino acid-iron compound fertilizer were determined by carrying out real-time fluorescent quantitative PCR. 【Result】In total, 4 Ferritin family genes were retrieved and cloned from grape, entitled with-, which were distributed on No. 6, 8 and 13 chromosomes, containing 7 introns with different lengths. VvFer proteins were mainly located in chloroplast and nucleus. The amino acid sequence identity of Ferritin homologs from 16 plant species was as high as 61.48%. Phylogenetic tree analysis indicated that Ferritin homologs belonging to the same genus, such asand turnip of, tobacco and potato of, soybeans, peanuts and chickpeas of, rubber trees, cassava and castor of, and apples, peaches and strawberries of Rosaceae, possessed a closer genetic distance during evolution. Grape VvFer3 was closely clustered withhomologs. The expression levels ofgenes were different among distinct tissues or organs of 5-year-old Mathelan grape trees during different fruit developmental stages. In particular, the expression level ofwas the most abundant, and the maximum expression was observed in fruits from hard core stage to mature stage, followed byand. The content of Fe Marselan fruits was slightly different among distinct grape developmental stages, which was gradually increased from young fruit stage, and reached the highest value at veraison stage, and then slightly decreased until mature stage, but still higher than that of young fruit stage and hard core stage. Foliar spraying treatment significantly enhanced Fe content of fruits at mature stage, accompanied by ACO (aconitase), NIR (nitrate reductase) and SDH (succinate dehydrogenase). Genes of-were significantly up-regulated by foliar spraying of amino acid-iron compound fertilizer, which was closely related to distinct grape tissues/organs and different fruit developmental stages. In details, the expression ofwas relatively low, but very uniform, and there was no response to foliar spraying treatment at the transcription level. 【Conclusion】Fourfamily genes were cloned and identified in grape, whose expression were significantly different among distinct tissues during different fruit developmental stages and were prone to be up-regulated under foliar spraying treatment of amino acid-iron compound fertilizer. The overall expression level ofgene was the highest in all tested tissues (especially in fruits) during the whole fruit development stage, and was up-regulated in fruits under foliar spraying treatment from young fruit stage to the verason stage.

grape; Fe storage and sequestration; Ferritin; compound amino acid-iron fertilizer; foliar spraying

2023-02-23；

2023-06-05

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-29-17）、國家留學(xué)基金（202208370080）、山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃（重大科技創(chuàng)新工程）（2022CXGC010605）、煙臺市科技計劃（2020XCZX026）

宋志忠，Tel：0535-6664662；E-mail：szhzh2000@163.com。通信作者肖慧琳，Tel：0535-6352051；E-mail：1316959443@qq.com。通信作者唐美玲，Tel：0535-6352051；E-mail：tmling1999@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.011

（責(zé)任編輯 趙伶俐）