擬輪枝鐮孢熒光標記與侵染結構觀察

哈丹丹，鄭紅霞，張振昊，竺利紅，劉浩，王教瑜,，周雷

擬輪枝鐮孢熒光標記與侵染結構觀察

哈丹丹1，鄭紅霞2，張振昊2，竺利紅3，劉浩1，王教瑜，周雷

1天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2浙江省農業(yè)科學院農產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所/農產(chǎn)品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，杭州 310021；3浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州 310021

【目的】以玉米穗腐病優(yōu)勢病原菌和伏馬毒素主要產(chǎn)毒菌擬輪枝鐮孢（）為研究對象，構建組成型表達綠色熒光蛋白GFP、紅色熒光蛋白DsRED、過氧化物酶體靶向標記蛋白DsRED-PTS1和細胞骨架F-actin結合蛋白LifeAct-GFP的熒光菌株，觀察擬輪枝鐮孢侵染玉米須表皮的穿透結構，明確擬輪枝鐮孢侵染結構形成的調控機制和影響因素?！痉椒ā客ㄟ^農桿菌介導的遺傳轉化方法將熒光表達載體pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-DsRED-PTS1和pCOM-LifeAct-GFP分別導入擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2中，PCR鑒定含有目標基因的轉化子，激光共聚焦顯微鏡觀察各熒光蛋白的表達和分布；接種玉米須觀察侵染結構；賽璐酚膜模擬植物表皮穿透試驗，觀察穿透結構和F-actin的動態(tài)組裝；使用F-actin聚合抑制劑Latrunculin A、三環(huán)唑和活性氧抑制劑DPI（diphenyleneiodonium chloride）檢測穿透結構形成的影響因素?！窘Y果】建立了以遺傳霉素G418為抗性標記的遺傳轉化方法；FV-GFP和FV-DsRED菌株分別具有清晰、明亮的綠色熒光和紅色熒光，F(xiàn)V-DsRED-PTS1菌株中紅色熒光呈圓點狀分布，符合真菌中過氧化物酶體的分布特征，F(xiàn)V-LifeAct-GFP菌株孢子和菌絲內部具有絲絮狀綠色熒光，符合真菌中F-actin蛋白的分布特征；玉米須表皮侵染過程中觀察到菌絲頂端膨大類似附著枝侵染結構；賽璐酚膜模擬穿透試驗觀察到穿透結構中F-actin蛋白的成環(huán)組裝；藥物脅迫試驗表明，穿透結構的形成受F-actin蛋白聚合和活性氧調控。同時，三環(huán)唑能夠抑制穿透。【結論】構建了4種熒光標記菌株，細胞定位清晰，具有正常的生長表型和致病力，能夠滿足致病機制相關研究需求；明確了擬輪枝鐮孢在侵染玉米時能夠形成一種菌絲頂端膨大的類似附著枝狀的侵染結構；確定了F-actin成環(huán)聚集、細胞骨架組裝和活性氧調控是影響擬輪枝鐮孢侵染結構形成的關鍵因素。

擬輪枝鐮孢；熒光標記；過氧化物酶體；侵染結構；細胞骨架；活性氧

0 引言

【研究意義】玉米穗腐病是玉米生長后期危害安全生產(chǎn)的重要病害。優(yōu)勢致病菌擬輪枝鐮孢（）能夠侵染玉米穗部導致籽粒腐爛、霉變，造成產(chǎn)量損失和品質下降[1-3]。除了引起玉米病害，擬輪枝鐮孢還能夠產(chǎn)生伏馬毒素（fumonisin，F(xiàn)B）。伏馬毒素又稱煙曲霉毒素，是鐮孢菌屬致病真菌在侵染農作物時產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，該毒素具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性、器官毒性和致癌性，嚴重危害玉米品質和相關食品、飼料安全以及人畜生命健康[4-5]。因此，研究擬輪枝鐮孢致病侵染與毒素合成的分子調控機制，鑒定病菌侵染和毒素合成的關鍵蛋白元件，對于從源頭上阻控病害發(fā)生和毒素的形成具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】擬輪枝鐮孢又名串珠鐮孢（），是一種危害性極大的植物病原真菌，能夠引起玉米穗腐病、水稻惡苗病、小麥莖基腐病等多種作物的毀滅性病害，給糧食安全生產(chǎn)造成嚴重威脅[6-10]。目前研究表明，玉米穗腐病是由多種真菌或細菌復合侵染引起，其中主要致病菌為鐮孢屬[11-12]。擬輪枝鐮孢是引起我國各個地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌[13-18]。熒光蛋白標記的目的是監(jiān)測生物過程、輔助檢測（例如化合物的可靠定量、蛋白質修飾的特異性檢測）或者純化標記后的蛋白及其結合對象[19-20]。通過熒光蛋白標記的方法能夠有效研究啟動子活性、基因表達動態(tài)、蛋白的細胞和亞細胞定位以及生物體的生長發(fā)育等[21-22]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）對細胞無毒性，無種屬特異性，具有靈敏度高、熒光穩(wěn)定、易于檢測等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的熒光蛋白[23]。最早用于研究的紅色熒光蛋白是一種從珊瑚中分離出來的DsRed，具有熒光強、穩(wěn)定性強等優(yōu)勢[24]。卡氏白（calcofluor white，CFW）是一種能夠標記真菌細胞壁的熒光染料，它能夠結合真菌細胞壁中的纖維素和幾丁質，在熒光顯微鏡下能夠觀察到藍色熒光[25]。過氧化物酶體是真核生物中普遍存在的一類單層膜包被的細胞器，內含多種酶類，參與多種重要的生化代謝過程，如脂肪酸-氧化、乙醛酸循環(huán)、膽固醇合成、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成與降解等[26]。過氧化物酶體可由內質網(wǎng)從頭產(chǎn)生，也可通過細胞中成熟的過氧化物酶體分裂而迅速增殖。過氧化物酶體的數(shù)量在細胞中受到嚴格調控。當細胞環(huán)境變化，不再需要過氧化物酶體相關的生化代謝時，過氧化物酶體通過自噬的方式進行降解[27]。過氧化物酶體的形成涉及膜蛋白的整合和基質蛋白的輸入?；|蛋白在細胞質中合成，具有自身的定位信號，稱為PTS（peroxisome targeting signal），能夠被受體蛋白識別并轉運。真核生物中保守的PEX5和PEX7基因分別編碼PTS1與PTS2兩種定位信號的受體蛋白，結合細胞質中的基質蛋白并將其轉運至過氧化物酶體膜上，在膜上與過氧化物酶體對接復合體互作，最后在環(huán)指狀復合體等蛋白的共同作用下，將基質蛋白轉運進入過氧化物酶體內部[28-29]。因此，PTS定位信號可以作為細胞內部過氧化物酶體示蹤的特異性標記。細胞骨架不僅是細胞形態(tài)建成的支架，還與細胞發(fā)育的各種變化過程有關，其中涉及細胞器運輸、細胞分裂、細胞活性和信號傳遞等[30]。肌動蛋白含有小球狀的G-actin蛋白和聚集成絲狀的F-actin蛋白，它們在纖維動力學的研究中很常見，參與調控各種細胞骨架的變化[31]。F-actin介導的細胞骨架動態(tài)變化在真菌的形態(tài)發(fā)育和致病過程中具有重要作用[32-33]。LifeAct是一個17個氨基酸組成的多肽，來源于酵母菌F-actin標記蛋白Abp140，可以特異性靶向結合細胞中的Actin蛋白[34]。通過對活細胞或固定細胞的F-actin染色或熒光觀察，用以研究Actin蛋白介導的細胞骨架在細胞發(fā)育和分化過程中的動態(tài)變化過程[35]。真菌在侵染寄主植物時能夠形成侵染性結構，如稻瘟病菌（）在侵染水稻葉片時形成的附著胞結構，以及大麗輪枝菌（）在侵染棉花根部時形成的一種菌絲頂端膨大的侵染性結構，稱為附著枝。使用玻璃紙（賽璐酚膜）模擬真菌穿透寄主表皮的過程，可以觀察到菌絲頂端在玻璃紙穿透界面形成膨大鈍圓的侵染結構，并伴隨Actin和Septin蛋白的聚集組裝[36-37]?！颈狙芯壳腥朦c】玉米穗腐病的發(fā)病機理目前還不清楚。相比于引起棉花、番茄、西瓜等作物枯萎病的尖孢鐮孢（）和引起小麥赤霉病、玉米莖基腐病的禾谷鐮孢（），玉米穗腐病病原擬輪枝鐮孢的侵染、產(chǎn)毒以及與玉米互作的分子機制研究目前還處于起步階段[38-43]。【擬解決的關鍵問題】構建熒光菌株，揭示擬輪枝鐮孢的侵染結構，為今后深入開展擬輪枝鐮孢的侵染和致病機制研究打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2022年9月至2023年4月在浙江省農業(yè)科學院農產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所完成。

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2由中國農業(yè)科學院作物科學研究所段燦星博士惠贈。該菌株分離自重慶市玉米穗腐病樣品，具有高產(chǎn)伏馬毒素（1 566.44 μg·g-1）的特性[44]。農桿菌介導的D85-2菌株遺傳轉化體系由本實驗室[45]建立，并稍作修改。大腸桿菌菌株DH5、農桿菌菌株AGL-1為本實驗室保存。LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基（CM）用于D85-2菌株及轉化子的常規(guī)培養(yǎng)和生長表型觀察。本研究構建的熒光載體和標記菌株由本實驗室保存并科研共享。

1.2 熒光標記載體的構建

在真菌基因功能相關研究中，潮霉素B通常用于基因敲除轉化子的篩選與鑒定。為了便于對基因敲除突變體進行功能回補和熒光標記，用于突變體生長發(fā)育和侵染過程的熒光示蹤，采用遺傳霉素抗性基因作為熒光轉化子抗性篩選標記。構建熒光表達載體所用質粒為pCOM，含有抗性基因表達框，能夠表達遺傳霉素G418抗性，可以作為篩選標記[45]。驅動熒光基因表達的啟動子序列Pgpd1來自釀酒酵母甘油合成關鍵酶基因，終止子序列Tnos來自于土壤農桿菌的胭脂堿合成酶基因。將、、和熒光基因分別插入到Pgpd1啟動子和Tnos終止子之間，獲得轉化載體pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-LifeAct-GFP和pCOM-DsRED-PTS1（圖1）。

圖1 熒光標記載體的構建

1.3 熒光載體的ATMT轉化及熒光菌株的篩選鑒定

通過農桿菌介導的遺傳轉化方法（ATMT），將熒光表達載體分別轉化到擬輪枝鐮孢D85-2菌株中，篩選具有G418抗性（100 μg·mL-1）的陽性轉化子。每個熒光載體各挑取6個轉化子，在ZEISS熒光顯微鏡下初步觀察熒光定位及表達情況。挑選熒光較強的轉化子，將單孢菌落傳代培養(yǎng)5代得到遺傳穩(wěn)定的熒光標記菌株。將遺傳穩(wěn)定的各轉化子菌株在CM平板上培養(yǎng)5 d后，刮取平板上的菌絲，用植物基因組DNA小量提取試劑盒（TIANGEN，DP320）提取各轉化子的基因組DNA，并以各轉化子基因組DNA為模板，以引物G418-F/G418-R擴增抗性基因片段，以引物GFP-F/GFP-R擴增和基因片段，以引物RED-F/RED- R擴增和基因片段。引物序列見表1。

表1 本研究所用引物

1.4 熒光轉化子的生長表型、伏馬毒素含量及致病力測定

生長表型測定：對分子鑒定正確的各熒光轉化子進行生長表型分析。將各熒光轉化子在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，利用直徑5 mm的打孔器分別在轉化子和野生型菌株的平板邊緣打取菌餅，接種到新的CM平板上，每個菌株3個重復，25 ℃暗培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑并拍照。用Image J軟件統(tǒng)計菌落面積，分析生長速率差異。培養(yǎng)5 d的轉化子平板分別用10 mL無菌水洗脫孢子，并用三層滅菌濾紙過濾獲得孢子懸浮液，血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子濃度，每處理設3個重復，計算并統(tǒng)計各菌株的產(chǎn)孢量。

伏馬毒素含量檢測：將野生型及各熒光菌株在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，取孢子液/菌絲接于液體CM培養(yǎng)基中，28 ℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，取菌液用濾紙過濾，收集濾液，取2 mL過濾后的濾液，加入47 mL吐溫-20/PBS溶液，混合均勻后過免疫親和柱，流速控制在1—3 mL·min-1，用10 mL PBS緩沖液淋洗免疫親和柱，分別用1 mL甲醇-乙酸溶液洗脫免疫親和柱3次，收集洗脫液，55 ℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈-水溶液（50+50）溶解殘渣。渦旋30 s，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，收集于進樣瓶中。對濾液進行免疫親和柱純化，將洗脫液用氮氣干燥并溶解在1.5 mL 80%甲醇溶液中。使用C18反相液相色譜分離和鄰苯二甲醛（OPA）衍生后，通過HPLC進行FB1含量檢測。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

致病力檢測：采用室內接種的方法對分子鑒定正確的各熒光轉化子進行致病力檢測。首先用75%酒精將購買的新鮮玉米穗進行表面殺菌，將其置于超凈工作臺內風干3—5 min，剝開玉米穗的外皮，將其置于超凈工作臺內用紫外燈照射30 min。將各熒光轉化子在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，利用直徑5 mm的打孔器分別在轉化子和野生型菌株的平板邊緣打取菌餅，在菌落邊緣挑取菌餅直接接于新鮮玉米穗的籽粒上，水瓊脂作為對照，每個菌株5個重復，將玉米穗的底部固定在花泥中央使其站立，將所有試驗樣品置于接種盒中，并用保鮮膜在接種盒的頂部進行密封，將其置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后將籽粒上的菌餅取掉，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d，7 d后觀察其致病情況并拍照。

1.5 熒光轉化子的激光共聚焦觀察與熒光染料CFW的混合熒光定位

從熒光轉化子FV-GFP、FV-DsRED、FV-LifeAct- GFP和FV-DsRED-PTS1中各選取3個熒光表達強、定位清晰、繼代穩(wěn)定的單孢菌株，在CM平板上培養(yǎng)2 d，挑取少量菌絲和孢子用無菌水洗脫，吸取10 μL洗脫的菌液于干凈的載玻片上，滴加10 μL濃度為50 μg·mL-1的CFW（溶于水）染色液，避光染色5 min后于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。在激發(fā)波長561 nm、發(fā)射波長570—630 nm條件下觀察紅色熒光轉化子FV-DsRED和FV-DsRED-PTS1；在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長495—550 nm條件下觀察綠色熒光轉化子FV-GFP和FV-LifeAct-GFP；在激發(fā)波長405 nm、發(fā)射波長410—480 nm條件下觀察CFW染料在細胞壁上發(fā)射出的藍色熒光。

1.6 擬輪枝鐮孢FV-LifeAct-GFP菌株侵染玉米須的熒光觀察

將FV-LifeAct-GFP熒光菌株在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，用5 mm打孔器在菌落邊緣取菌餅，將菌餅放置在水瓊脂培養(yǎng)基上。用75%酒精在超凈工作臺中將新鮮玉米頂部的玉米須浸泡1 min，無菌水漂洗3遍備用。用鑷子將玉米須平行接種于水瓊脂平板中的菌餅上，密封后在25 ℃培養(yǎng)，2 d后在熒光顯微鏡下觀察侵染情況。

1.7 FV-LifeAct-GFP熒光菌株的侵染結構觀察

將FV-LifeAct-GFP菌株在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，洗脫孢子制備孢子懸浮液并調節(jié)其濃度為104個孢子/mL。在CM培養(yǎng)基上平鋪一層無菌玻璃紙（賽璐酚膜），吸取1 μL孢子液點在圓形玻璃紙中心，密封后25 ℃培養(yǎng)，2 d后取下玻璃紙，在激光共聚焦顯微鏡下觀察侵染結構。為了觀察F-actin蛋白聚合抑制劑對擬輪枝鐮孢侵染結構形成的影響，分別制備含有終濃度為0.1和0.3 μmol·L-1的Latrunculin A孢子懸浮液（104個孢子/mL），以無菌水制備的孢子懸浮液作為對照，采用上述方法分別接種到CM平板的玻璃紙中心，密封后25 ℃培養(yǎng)，3 d后將玻璃紙取出，平板拍照記錄菌絲穿透情況，并繼續(xù)在25 ℃培養(yǎng)2 d，拍照觀察穿透菌落的生長情況。

1.8 擬輪枝鐮孢侵染結構對藥物的敏感性檢測

將擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，無菌水洗脫孢子，制備濃度為104個孢子/mL的孢子懸浮液。分別加入終濃度為0.1 μg·mL-1的黑色素抑制劑三環(huán)唑，10 μg·mL-1的真菌細胞壁脅迫劑CFW和10 μg·mL-1的活性氧抑制劑DPI（diphenyleneiodonium chloride），取3 μL上述孢子液點在玻璃紙上，密封后25 ℃培養(yǎng)，3 d后將玻璃紙取出，拍照記錄菌絲穿透情況，并繼續(xù)在25 ℃培養(yǎng)2 d，拍照記錄各平板中穿透菌絲的生長情況。

2 結果

2.1 擬輪枝鐮孢遺傳轉化體系建立與熒光轉化子的篩選及鑒定

確定遺傳霉素G418的篩選濃度，首先檢測擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2對不同濃度G418抗生素的敏感性。結果表明，在150 μg·mL-1濃度條件下，菌落生長完全受到抑制（圖2）。因此，在后續(xù)轉化試驗中G418的工作濃度為150 μg·mL-1。

將構建好的熒光表達載體通過凍融法導入農桿菌AGL-1中。采用之前報道的ATMT方法獲得各熒光載體的轉化子[45]。

圖2 擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2對遺傳霉素G418的抗性濃度篩選

挑取傳代培養(yǎng)5代后能穩(wěn)定表達且發(fā)出較強熒光的FV-GFP、FV-DsRED、FV-LifeAct-GFP和FV- DsRED-PTS1各3個轉化子，提取基因組DNA并進行PCR驗證（圖3）。核酸檢測結果顯示，挑選的熒光轉化子中可分別擴增得到片段長度517 bp的片段，與pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM- LifeACT-GFP、pCOM-DsRED-PTS1質粒（陽性對照）中擴增出來的片段大小相同。其中以FV-GFP和FV-LifeAct-GFP轉化子基因組為模板可以擴增出一條約564 bp的片段，分別與pCOM-GFP和pCOM- LifeAct-GFP質粒（陽性對照）中擴增出來的片段大小相同；以FV-DsRED和FV-DsRED-PTS1轉化子基因組DNA為模板可以擴增出一條549 bp的片段，與pCOM-DsRED和pCOM-DsRED-PTS1質粒（陽性對照）中擴增出來的片段大小相同，而以未轉化的野生型菌株D85-2基因組DNA（陰性對照）為模板時沒有擴增出條帶。上述結果表明，在所檢測的轉化子中，各熒光標記基因與抗性基因均整合插入相應轉化子的基因組中，且能夠穩(wěn)定遺傳。

A：FV-GFP；B：FV-DsRED；C：FV-LifeAct-GFP；D：FV-DsRED-PTS1。P：質粒陽性對照（pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-LifeAct-GFP、pCOM-DsRED-PTS1）The plasmids pCOM-GFP, pCOM-DsRED, pCOM-LifeAct-GFP, pCOM-DsRED-PTS1；WT：野生型D85-2基因組陰性對照negative control standing for the wild-type D85-2 genome；隨機挑選穩(wěn)定遺傳的轉化子FV-GFP（G1，G2，G3）、FV-DsRED（R1，R2，R3）、FV-LifeAct-GFP（A1，A2，A3）和FV-DsRED-PTS1（P1，P2，P3）各3個，提取基因組DNA，PCR擴增檢測G418抗性基因NPTII片段（引物：G418-F/G418-R）、GFP片段（引物：GFP-F/GFP-R）和DsRED片段（引物：RED-F/RED-R）Genomic DNA samples of randomly selected three stable genetic transformants FV-GFP (G1, G2, G3), FV-DsRED (R1, R2, R3), FV-LifeAct-GFP (A1, A2, A3), and FV-DsRED-PTS1 (P1, P2, P3), were amplificated by PCR to detect NPTII fragments of G418 resistance genes (primers: G418-F/G418-R), GFP fragments (primers: GFP-F/GFP-R), and DsRED fragments (primers: RED-F/RED-R)

2.2 熒光轉化子具有正常的生長表型和致病力

各轉化子在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，定量分析發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)、生長速率及產(chǎn)孢量均與野生型菌株無顯著性差異，說明熒光基因的導入沒有影響轉化子的生長表型和產(chǎn)孢能力（圖4-A、4-B、4-C）。將野生型菌株D85-2及各熒光菌株在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，以伏馬毒素FB1標準品為參照，采用HPLC測定各菌株中FB1產(chǎn)量。結果顯示，各菌株間伏馬毒素的產(chǎn)量無顯著性差異，說明熒光基因的導入沒有影響轉化菌株的產(chǎn)毒能力（圖4-D）。將FV-GFP、FV-DsRED、FV-DsRED-PTS1和FV-LifeAct-GFP 4種熒光菌株分別接種到新鮮玉米穗上，以野生型菌株D85-2為對照，5 d后觀察發(fā)病情況。結果顯示，4個熒光菌株均能在玉米上引起病斑，與野生型無顯著差異，表明熒光基因導入沒有影響轉化子的致病力（圖4-E）。

2.3 組成型表達GFP和DsRED菌株的熒光觀察

在OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡下觀察FV-GFP和FV-DsRED熒光轉化子。GFP和DsRED標記的擬輪枝鐮孢中綠色熒光和紅色熒光在分生孢子以及菌絲的各發(fā)育形態(tài)中均具有明亮的熒光，熒光信號均勻分布于細胞內部（圖5），表明GFP綠色熒光蛋白和DsRED紅色熒光蛋白能夠在轉化子生長發(fā)育的各階段穩(wěn)定表達。

2.4 熒光轉化子中過氧化物酶體的觀察與細胞定位

為了觀察擬輪枝鐮孢中過氧化物酶體的定位和分布情況，采用基質蛋白定位信號PTS1與DsRED紅色熒光蛋白融合，構建了組成型表達DsRED-PTS1紅色熒光的菌株FV-DsRED-PTS1。在OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡下觀察FV-DsRED-PTS1菌株細胞內部的熒光定位情況。結果顯示，轉化子細胞內部具有清晰明亮的紅色圓球狀熒光斑點，在分生孢子以及菌絲的各發(fā)育形態(tài)中均有分布，與真菌過氧化物酶體的大小和分布特征一致（圖6-B）。上述結果表明，DsRED-PTS1融合基因能夠在轉化子中穩(wěn)定表達，并且PTS1信號能夠準確定位到真菌的過氧化物酶體上。

A：菌落形態(tài)Colony morphology；B：菌落直徑Colony dimeter；C：產(chǎn)孢量Conidiation；D：伏馬毒素產(chǎn)量Fumonisin B1 production；E：在玉米上的致病力測定Pathogenicity test on maize cobs。D85-2：野生型菌株wild-type strain；CK：玉米穗接種H2O的陰性對照Negative control inoculation with H2O on maize cob

2.5 F-actin細胞骨架的熒光觀察

LifeAct是一種靶向標記真核細胞Actin蛋白的定位序列，含有17個氨基酸，序列為MGVADLIKKFESISKEE，能夠特異地與細胞中的F-actin蛋白結合，并不影響F-actin蛋白的功能和胞內運輸[32]。為了研究F-actin蛋白以及細胞骨架在擬輪枝鐮孢孢子萌發(fā)、菌絲發(fā)育和侵染結構形成中的作用，構建了組成型表達LifeAct-GFP融合蛋白的綠色熒光菌株。在OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡下觀察FV-LifeAct-GFP熒光轉化子，可以看到F-actin綠色熒光在不同發(fā)育階段的孢子和菌絲中呈絲絮狀分布，與F-actin蛋白在細胞中的定位相符（圖6-A），表明LifeAct-GFP融合基因能夠在轉化子中穩(wěn)定表達，熒光強度較高，代表了擬輪枝鐮孢中細胞骨架的分布特征，可用于擬輪枝鐮孢孢子萌發(fā)、菌絲發(fā)育、侵染結構和侵染過程中F-actin蛋白及細胞骨架的動態(tài)觀察。

2.6 卡氏白染料與熒光蛋白在同一細胞中的混合定位觀察

為了更清晰直觀地觀察不同細胞結構和細胞器的位置，利用卡氏白染料對FV-GFP、FV-DsRED、FV- DsRED-PTS1和FV-LifeAct-GFP這4種熒光轉化子的細胞壁染色進行熒光定位觀察[25]。結果顯示，卡氏白染液能夠發(fā)出清晰明亮的藍色熒光，集中分布于擬輪枝鐮孢的菌絲邊緣（細胞壁）和隔膜位置（圖7、圖8）。該熒光與FV-GFP和FV-LifeAct-GFP菌株的綠色熒光，以及FV-DsRED和FV-DsRED-PTS1菌株的紅色熒光沒有相互干擾，可同時用于擬輪枝鐮孢孢子形態(tài)和菌絲發(fā)育各階段的混合熒光觀察。

A：FV-GFP菌株不同發(fā)育階段孢子和菌絲中GFP綠色熒光的分布和定位Distribution and localization of GFP green fluorescence in spores and hyphae of FV-GFP strain at different developmental stages；B：FV-DsRED菌株不同發(fā)育階段孢子和菌絲中DsRED紅色熒光的分布和定位Distribution and localization of DsRED fluorescence in spores and hyphae of FV-DsRED strain at different developmental stages

2.7 擬輪枝鐮孢具有F-actin蛋白成環(huán)組裝的附著枝狀侵染結構

為了觀察擬輪枝鐮孢的侵染結構，使用具有綠色熒光的FV-LifeAct-GFP菌株接種新鮮玉米須。結果顯示，接種24 h后，玉米須出現(xiàn)黃色病斑（圖9-A）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，玉米須表面以及內部入侵的菌絲出現(xiàn)膨大結構，類似大麗輪枝菌中報道的附著枝狀結構（圖9-B、9-C）。進一步使用玻璃紙模擬植物表皮穿透試驗，結果顯示，菌絲頂端與玻璃紙接觸界面出現(xiàn)略微膨大的鈍圓形結構。激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)鈍圓形結構內部呈現(xiàn)綠色熒光斑點的成環(huán)狀聚集（圖9-D），表明LifeAct-GFP標記的F-actin蛋白在擬輪枝鐮孢形成鈍圓形侵染結構時需要進行環(huán)狀聚集和組裝。

為了確定F-actin蛋白組裝在擬輪枝鐮孢侵染結構形成中的作用，使用F-actin蛋白聚合抑制劑Latrunculin A處理FV-LifeAct-GFP轉化子的分生孢子，并使用玻璃紙進行穿透試驗，以未處理菌株為對照[37]。結果顯示，濃度為0.1和0.3 μmol·L-1的Latrunculin A處理均顯著抑制了FV-LifeAct-GFP菌株的穿透能力（圖10），表明F-actin蛋白的組裝在擬輪枝鐮孢侵染結構形成過程中具有重要作用。

A：FV-LifeAct-GFP菌株不同發(fā)育階段孢子和菌絲中F-actin細胞骨架綠色熒光信號的分布和定位Distribution and localization of F-actin cytoskeleton with GFP fluorescence in spores and hyphae of FV-LifeAct-GFP strain at different developmental stages；B：FV-DsRED-PTS1菌株不同發(fā)育階段孢子和菌絲中過氧化物酶體紅色熒光信號的分布和定位Distribution and localization of peroxisomes with DsRED fluorescence in spores and hyphae of FV-DsRED-PTS1 strain at different developmental stages

2.8 擬輪枝鐮孢穿透結構的形成受ROS調控，對三環(huán)唑敏感

為了探究擬輪枝鐮孢侵染結構形成的影響因素，使用黑色素抑制劑三環(huán)唑、ROS抑制劑DPI、細胞壁完整性脅迫劑CFW處理擬輪枝鐮孢的分生孢子，并使用玻璃紙檢測穿透效果。結果顯示，擬輪枝鐮孢在0.1 μg·mL-1三環(huán)唑和10 μg·mL-1DPI的作用下穿透能力減弱，10 μg·mL-1CFW處理沒有顯著影響擬輪枝鐮孢的穿透能力（圖11），表明擬輪枝鐮孢侵染結構的形成需要ROS的調控，并且三環(huán)唑能夠抑制擬輪枝鐮孢穿透結構的形成。

3 討論

擬輪枝鐮孢是玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌，能夠產(chǎn)生伏馬毒素，不僅導致玉米病害暴發(fā)、減產(chǎn)，還能導致玉米相關食品、飼料的毒素污染[9]。從分子和細胞水平開展擬輪枝鐮孢致病機理和產(chǎn)毒機制的研究，鑒定關鍵致害因子，有助于生產(chǎn)上對玉米穗腐病進行科學有效的綠色防控。之前的研究已經(jīng)成功建立了擬輪枝鐮孢的遺傳轉化方法，構建了綠色熒光GFP和紅色熒光DsRED的熒光標記菌株，并利用DsRED標記菌株觀察了擬輪枝鐮孢對玉米根系的系統(tǒng)侵染和定殖過程[40,46-48]。在此基礎上，為了進一步觀察細胞骨架和過氧化物酶體在擬輪枝鐮孢侵染玉米過程的功能機制，本研究構建了能夠穩(wěn)定表達細胞骨架F-actin靶向標記熒光蛋白LifeAct-GFP和過氧化物酶體靶向標記熒光蛋白DsRED-PTS1的熒光菌株。同時，構建了組成型表達綠色熒光GFP和紅色熒光DsRED的菌株，用于滿足不同試驗目的。與野生型菌株相比，4種熒光菌株均具有正常的生長表型、產(chǎn)孢能力、毒素合成和致病力。玉米須侵染試驗觀察到菌絲頂端膨大的附著枝狀侵染結構，內部具有F-actin蛋白的成環(huán)狀聚集。在稻瘟病菌中，侵染結構穿透釘?shù)男纬尚枰街麅炔考毎み吘壓谏氐姆e累，作為機械屏障阻止細胞內甘油的外滲，以維持附著胞內部強大的膨壓，保障侵染釘能夠刺穿植物表皮[49]。使用黑色素合成抑制劑三環(huán)唑處理稻瘟病菌后不能形成有穿透功能的侵染釘[50]。此外，在稻瘟病菌和黃萎病菌中，NADPH氧化酶（Nox）通過調控細胞膜ROS的適度水平，對穿透結構的形成是必需的[36,51-52]。細胞壁完整性信號通路作為一種保守的信號調控機制也參與調控真菌侵染結構的形成[53-54]。藥物脅迫試驗表明，擬輪枝鐮孢侵染結構的形成受ROS水平調控。同時，三環(huán)唑可以有效抑制侵染結構的形成。以上研究為深入開展擬輪枝鐮孢致害機理的研究提供了菌株材料，初步揭示了擬輪枝鐮孢的侵染結構及其調控因素。

A：FV-GFP菌株中GFP綠色熒光與CFW的混合定位觀察Observation of GFP labeled green fluorescence mixed with CFW staining in the FV-GFP strain；B：FV-DsRED菌株中DsRED紅色熒光與CFW的混合定位觀察Observation of DsRED labeled red fluorescence mixed with CFW staining in the FV-DsRED strain

A：FV-LifeAct-GFP菌株中F-actin細胞骨架綠色熒光與CFW的混合定位觀察Observation of GFP labeled F-actin cytoskeleton mixed with CFW staining in the FV-LifeAct-GFP strain；B：FV-DsRED-PTS1菌株中過氧化物酶體紅色熒光與CFW的混合定位觀察Observation of DsRED labeled peroxisomes with red fluorescence mixed with CFW staining in the FV-DsRED-PTS1 strain

A：新鮮玉米須接種擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2 24 h后的發(fā)病情況Disease symptom of fresh maize silk 24 hours after inoculation with wild-type strain D85-2；CK：H2O對照H2O control。B：擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2分生孢子接種玉米須24 h后形成的菌絲頂端膨大的附著枝狀侵染結構The conidia of the wild-type strain D85-2 of F. verticillioides inoculated on maize silk for 24 hours form an enlarged hyphopodium like infection structures at the top of the hypha。C：擬輪枝鐮孢在玉米須表皮細胞間隙形成的穿透結構The penetrating structure formed by F. verticillioides in the intercellular space of maize silk epidermis。D：FV-LifeAct-GFP熒光菌株的穿透結構及其內部F-actin蛋白的成環(huán)狀組裝The penetration structure of FV-LifeAct-GFP fluorescent strain and the circular assembly of intracellular F-actin proteins

3.1 熒光菌株具有正常的生長發(fā)育、毒素合成和致病力

熒光蛋白標記是研究植物病原真菌和動物病原真菌的一種有效方法，且被廣泛應用于研究基因的時空表達以及蛋白的細胞和亞細胞定位[21]。通過對病原真菌菌株進行蛋白標記，能夠追蹤菌株自身的生長、發(fā)育以及致病性等。目前，已有多種熒光蛋白在灰霉病菌、稻瘟病菌等真菌中得到應用[22,27,55-56]。本研究采用綠色GFP熒光和紅色DsRed熒光標記擬輪枝鐮孢的全組織，綠色GFP熒光標記肌動蛋白F-actin，紅色DsRed熒光標記過氧化物酶體，通過農桿菌介導的遺傳轉化得到的轉化子中GFP、DsRED熒光高豐度表達，且熒光強度高、分散性好，能夠穩(wěn)定遺傳。將熒光蛋白定位與化學染色相結合，借助卡氏白對細胞壁的熒光染色，在熒光顯微鏡下能清楚地分辨細胞輪廓與各個細胞器。本研究利用不同熒光蛋白和熒光染料對擬輪枝鐮孢進行組織定位、蛋白定位和蛋白共定位，為細胞及亞細胞結構、基因功能以及蛋白互作的研究提供了重要的工具。此外，獲得的轉化子菌落形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢量等性狀與野生型均無顯著差異，說明在大多數(shù)轉化子中，轉化過程本身以及G418基因和融合蛋白基因的表達對轉化子的生長發(fā)育并沒有明顯影響，這些轉化子可用于進一步的分子病理學研究。

Before：擬輪枝鐮孢分生孢子在覆蓋玻璃紙的CM平板上培養(yǎng)3 d Conidia of F. verticillioides were inoculated on the center of the cellophane membrane laid on the CM plates cultured for 3 days；After (0 dpi)：CM平板上玻璃紙連同生長的菌絲一起被揭除的時間點the time point when the cellophane membranes were removed；After (2 dpi) ：揭除玻璃紙后繼續(xù)培養(yǎng)2 d的CM平板the time point when the plates without the cellophane membranes were cultured for next two days。圖11同The same as Fig. 11

DMSO：不加藥物處理的對照A control without drug treatment

3.2 擬輪枝鐮孢形成附著枝狀侵染結構，具有F-actin蛋白成環(huán)分布特征，受ROS和三環(huán)唑調控

F-actin蛋白是真核生物細胞骨架的重要組分，不僅維持細胞的正常形態(tài)，還能介導細胞運動、胞吞胞吐、營養(yǎng)吸收、細胞分裂等一系列細胞生理活動。近年來，對F-actin蛋白在植物病原真菌中的研究表明，F(xiàn)-actin蛋白介導的細胞骨架重塑和組裝在真菌侵染結構形成和植物表皮穿透過程中具有關鍵作用。例如，稻瘟病菌侵染水稻葉片時，穿透釘?shù)男纬尚枰狥-actin蛋白的成環(huán)組裝。大麗輪枝菌侵染棉花根部表皮時，需要形成附著枝侵染結構，并伴隨F-actin蛋白在附著枝頂端的成環(huán)組裝。LifeAct可以對活細胞或固定細胞的F-actin染色，用以研究LifeAct-GFP在肌動蛋白中的應用[34]。本研究采用LifeAct-GFP標記擬輪枝鐮孢的F-actin蛋白，將FV-LifeAct-GFP轉化子接種玉米須，在玉米須的內部觀察到了侵入的菌絲以及附著枝狀的侵染結構。將FV-LifeAct-GFP轉化子進行玻璃紙穿透試驗，通過LifeAct-GFP標記的F-actin蛋白的活細胞成像，觀察到在玻璃紙內部菌絲頸周圍的滲透界面處顯示出GFP信號聚集的環(huán)狀穿透釘，GFP環(huán)保留在菌絲頸處并框住菌絲頸，形成真菌-宿主滲透界面。擬輪枝鐮孢的F-actin蛋白在肌動蛋白聚合抑制劑Latrunculin A作用下能夠抑制其穿透。將各熒光轉化子在玉米上進行致病力的檢測，與野生型相比致病力沒有發(fā)生明顯的改變。通過三環(huán)唑、CFW、DPI藥物脅迫，發(fā)現(xiàn)擬輪枝鐮孢在三環(huán)唑和DPI藥物作用下穿透能力減弱，相關分子機理還需要進一步研究。

3.3 熒光菌株對研究擬輪枝鐮孢致病侵染相關信號轉導機制具有重要意義

Actin蛋白介導的細胞內吞機制對于調控真菌細胞的信號通路至關重要[57]。在稻瘟病菌中，胞吞蛋白MoEnd3介導的細胞內吞可以運輸負責感應胞外信號的受體蛋白Pth11和MoSho1至內涵體，這個過程對于MAPK信號激酶Pmk1的磷酸化激活以及細胞自噬作用的啟動是十分重要的，決定了稻瘟病菌侵染結構附著胞的形成以及對水稻的致病性[58]。在禾谷鐮孢中，四次跨膜受體FgSho1通過接頭蛋白FgSte50偶聯(lián)下游MAPK激酶三聯(lián)體FgSte11-FgSte7-Fmk1，調控DON毒素的生物合成。缺失的禾谷鐮孢突變體中DON毒素的合成量比野生型菌株下降92.3%，表明FgSho1受體蛋白在調控真菌毒素合成過程中具有重要作用[59]。在擬輪枝鐮孢中，已有證據(jù)表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號級聯(lián)也影響宿主的相互作用。MAPK FvMk1（FVEG_05063）的缺失突變體缺乏致病性，不能產(chǎn)生分生孢子和伏馬毒素[60]。此外，細胞壁完整性MAPK信號通路上游的蛋白激酶FvBck1也參與調控擬輪枝鐮孢在甘蔗和玉米秸稈中的定殖。缺失的突變體中，伏馬毒素的合成顯著下降[61]。因此，利用本研究構建的熒光標記菌株解析FvMk1和FvBck1以及其他信號調控蛋白在擬輪枝鐮孢中的亞細胞定位和動態(tài)轉運機制，將進一步加深對擬輪枝鐮孢侵染和產(chǎn)毒機制的理解，為生產(chǎn)上進行科學有效的綠色防控提供理論依據(jù)。

4 結論

以玉米穗腐病優(yōu)勢病原菌擬輪枝鐮孢為研究對象，構建了穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白GFP、紅色熒光蛋白DsRED、F-actin細胞骨架靶向標記蛋白LifeAct- GFP和過氧化物酶體靶向標記蛋白DsRED-PTS1的熒光菌株，為深入研究擬輪枝鐮孢的侵染機制和致害機理創(chuàng)制了材料。擬輪枝鐮孢在玉米須表皮入侵時會形成菌絲頂端膨大的附著枝狀侵染結構。侵染結構的形成需要細胞內部F-actin蛋白的成環(huán)狀組裝，受到活性氧調控，對三環(huán)唑敏感。

致謝：中國農業(yè)科學院作物科學研究所段燦星博士提供擬輪枝鐮孢野生型菌株D85-2。南京農業(yè)大學植物保護學院張正光教授提供LifeAct載體。在此一并表示感謝！

[1] 柴海燕, 賈嬌, 白雪, 孟玲敏, 張偉, 金嶸, 吳宏斌, 蘇前富. 吉林省玉米穗腐病致病鐮孢菌的鑒定與部分菌株對殺菌劑的敏感性. 中國農業(yè)科學, 2023, 56(1): 64-78. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752. 2023.01.005.

CHAI H Y, JIA J, BAI X, MENG L M, ZHANG W, JIN R, WU H B, SU Q F. Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and susceptibility of some strains to fungicides in Jilin province. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(1): 64-78. doi: 10.3864/j.issn. 0578-1752.2023.01.005. (in Chinese)

[2] 段燦星, 王曉鳴, 宋鳳景, 孫素麗, 周丹妮, 朱振東. 玉米抗穗腐病研究進展. 中國農業(yè)科學, 2015, 48(11): 2152-2164. doi: 10.3864/ j.issn.0578-1752.2015.11.007.

DUAN C X, WANG X M, SONG F J, SUN S L, ZHOU D N, ZHU Z D. Advances in research on maize resistance to ear rot. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(11): 2152-2164. doi: 10.3864/j.issn.0578- 1752.2015.11.007. (in Chinese)

[3] 王寶寶, 畢四剛, 肖明綱, 張冬英, 閆強, 張彥彥, 楊樹龍, 朱振東, 段燦星. 黑龍江省玉米穗腐病致病鐮孢菌分離鑒定及產(chǎn)毒基因型分析. 草業(yè)學報, 2020, 29(1): 163-174.

WANG B B, BI S G, XIAO M G, ZHANG D Y, YAN Q, ZHANG Y Y, YANG S L, ZHU Z D, DUAN C X. Isolation and identification of pathogenicsppcausing maize ear rot and analysis of their toxin-producing genotype in Heilongjiang province. Acta Prataculturae Sinica, 2020, 29(1): 163-174. (in Chinese)

[4] 劉曉莉, 李金澤, 朱勇文, 王文策, 楊琳. 伏馬毒素的毒性作用及研究進展. 中國飼料, 2022(23): 101-108.

LIU X L, LI J Z, ZHU Y W, WANG W C, YANG L. Toxic effects and research progress of fumonisin. China Feed, 2022(23): 101-108. (in Chinese)

[5] 赫丹, 徐劍宏, 仇劍波, 劉馨, 史建榮, LEE Y W. 伏馬毒素的理化性質、檢測方法及在我國玉米和玉米制品中的污染現(xiàn)狀綜述. 江蘇農業(yè)科學, 2021, 49(21): 33-39.

HE D, XU J H, QIU J B, LIU X, SHI J R, LEE Y W. Review of physicochemical properties, detection methods and pollution status of fumonisin in maize and maize products in China. Jiangsu Agricultural Sciences, 2021, 49(21): 33-39. (in Chinese)

[6] BLACUTT A A, GOLD S E, VOSS K A, GAO M, GLENN A E.: advancements in understanding the toxicity, virulence, and niche adaptations of a model mycotoxigenic pathogen of maize. Phytopathology, 2018, 108(3): 312-326.

[7] 曾丹丹, 戎振洋, 袁詠天, 王曉莉, 鄭小波. LAMP快速診斷由擬輪枝鐮孢引起的水稻惡苗病. 南京農業(yè)大學學報, 2018, 41(2): 286-292.

ZENG D D, RONG Z Y, YUAN Y T, WANG X L, ZHENG X B. Rapid diagnosis of rice bakanae disease caused byusing a loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(2): 286-292. (in Chinese)

[8] 胡穎雄, 劉玉博, 王慧, 靳林朋, 林鳳, 張學才, 鄭洪建. 玉米穗腐病抗性遺傳與育種研究進展. 玉米科學, 2021, 29(2): 171-178.

HU Y X, LIU Y B, WANG H, JIN L P, LIN F, ZHANG X C, ZHENG H J. Research progress on ear rot resistant genetics and breeding in maize. Journal of Maize Sciences, 2021, 29(2): 171-178. (in Chinese)

[9] 楊校文, 常立國, 楊琴. 玉米穗腐病真菌毒素污染抗性遺傳研究進展. 玉米科學, 2023, 31(1): 161-169.

YANG X W, CHANG L G, YANG Q. Advances on inheritance of ear rot and mycotoxin contamination resistance in maize. Journal of Maize Sciences, 2023, 31(1): 161-169. (in Chinese)

[10] 尹澤超, 王曉芳, 龍艷, 董振營, 萬向元. 玉米穗腐病抗性鑒定、遺傳分析與分子機制. 中國生物工程雜志, 2021, 41(12): 103-115.

YIN Z C, WANG X F, LONG Y, DONG Z Y, WAN X Y. Identification, genetic analysis and molecular mechanism of corn ear rot resistance. China Biotechnology, 2021, 41(12): 103-115. (in Chinese)

[11] 程璐, 陳家斌, 張藝璇, 楊丹丹, 譚靜. 兩種優(yōu)勢病原菌玉米穗腐病的研究比較. 云南大學學報(自然科學版), 2022, 44(3): 647-654.

CHENG L, CHEN J B, ZHANG Y X, YANG D D, TAN J. Research comparison of two dominant pathogens on maize ear rot. Journal of Yunnan University (Natural Sciences Edition), 2022, 44(3): 647-654. (in Chinese)

[12] 謝敏. 四川玉米穗腐病病原菌影響因子及四川主栽品種對串珠鐮刀菌的抗病性研究[D]. 雅安: 四川農業(yè)大學, 2011.

XIE M. Causal organisms and impact factors of corn ear rot and resistance of corn varieties toear rot in Sichuan[D]. Yaan: Sichuan Agricultural University, 2011. (in Chinese)

[13] 周丹妮, 王曉鳴, 李丹丹, 楊洋, 陳國康, 段燦星. 重慶及周邊地區(qū)玉米穗腐病致病鐮孢菌的分離與鑒定. 植物保護學報, 2016, 43(5): 782-788.

ZHOU D N, WANG X M, LI D D, YANG Y, CHEN G K, DUAN C X. Isolation and identification ofspecies causing maize ear rot in Chongqing and its vicinity. Journal of Plant Protection, 2016, 43(5): 782-788. (in Chinese)

[14] 孫華, 張海劍, 郭寧, 石潔, 陳丹, 馬紅霞. 黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)穗腐病病原菌的分離鑒定. 植物保護學報, 2017, 44(5): 796-802.

SUN H, ZHANG H J, GUO N, SHI J, CHEN D, MA H X. Isolation and identification of pathogens causing maize ear rot in Huang- Huai-Hai summer corn region. Journal of Plant Protection, 2017, 44(5): 796-802. (in Chinese)

[15] 肖淑芹, 許佳寧, 閆麗斌, 隋韻涵, 薛春生, 陳捷. 遼寧省玉米鐮孢穗腐病病原菌的鑒定與分布. 植物保護學報, 2017, 44(5): 803-808.

XIAO S Q, XU J N, YAN L B, SUI Y H, XUE C S, CHEN J. Identification and distribution ofspecies causing maize ear rot in Liaoning Province. Journal of Plant Protection, 2017, 44(5): 803-808. (in Chinese)

[16] 魏琪, 廖露露, 陳莉, 齊永霞. 安徽省玉米穗腐病主要致病鐮孢菌的分離與鑒定. 植物保護, 2019, 45(5): 221-225.

WEI Q, LIAO L L, CHEN L, QI Y X. Isolation and identification of mainspecies causing maize ear rot in Anhui province. Plant Protection, 2019, 45(5): 221-225. (in Chinese)

[17] 黨萌, 曹宇, 王明陽, 王楠, 龍淼. 控制鐮刀菌產(chǎn)生伏馬毒素的技術. 畜牧與獸醫(yī), 2018, 50(8): 113-116.

DANG M, CAO Y, WANG M Y, WANG N, LONG M. A review on the techniques of controlling fumonisin production by. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2018, 50(8): 113-116. (in Chinese)

[18] 孫磊, 王玲, 劉連盟, 侯雨萱, 黎起秦, 黃世文. 水稻穗腐病菌強致病力且高產(chǎn)伏馬菌素菌株篩選. 中國水稻科學, 2018, 32(6): 610-616.

SUN L, WANG L, LIU L M, HOU Y X, LI Q Q, HUANG S W. Screening for strains of rice spikelet rot disease pathogenic fungus with high fumonisin production and strong pathogenicity. Chinese Journal of Rice Science, 2018, 32(6): 610-616. (in Chinese)

[19] 吳超柱, 徐凡, 郜炎龍, 姜和. 熒光標記技術在生物學和醫(yī)學研究中的應用. 重慶理工大學學報(自然科學), 2014, 28(5): 55-62. WU C Z, XU F, GAO Y L, JIANG H. Application of fluorescent labeling technique in the research of biology and medicine. Journal of Chongqing University of Technology (Natural Science), 2014, 28(5): 55-62. (in Chinese)

[20] SCHNEIDER A F L, HACKENBERGER C P R. Fluorescent labelling in living cells. Current Opinion in Biotechnology, 2017, 48: 61-68.

[21] KILARU S, SCHUSTER M, MA W, STEINBERG G. Fluorescent markers of various organelles in the wheat pathogen. Fungal Genetics and Biology, 2017, 105: 16-27.

[22] 施笑笑, 王教瑜, 肖琛聞, 王艷麗, 李大勇, 柴榮耀, 孫國昌. 利用熒光蛋白標記西瓜枯萎病菌的過氧化物酶體及細胞核. 中國細胞生物學學報, 2020, 42(2): 195-203.

SHI X X, WANG J Y, XIAO C W, WANG Y L, LI D Y, CHAI R Y, SUN G C. Fluorescent labeling the peroxisome and nucleus inf. sp.. Chinese Journal of Cell Biology, 2020, 42(2): 195-203. (in Chinese)

[23] ORMO M, CUBITT A B, KALLIO K, GROSS L A, TSIEN R Y, REMINGTON S J. Crystal structure of thegreen fluorescent protein. Science, 1996, 273(5280): 1392-1395.

[24] 任飛, 張佳琦, 胡恒康, 梁璧, 黃有軍, 婁和強, 張啟香. 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃植株再生過程中的表達穩(wěn)定性. 林業(yè)科學, 2020, 56(12): 166-176.

REN F, ZHANG J Q, HU H K, LIANG B, HUANG Y J, LOU H Q, ZHANG Q X. Expression stability of red fluorescent protein gene DsRED in the regeneration of walnut () plant. Scientia Silvae Sinicae, 2020, 56(12): 166-176. (in Chinese)

[25] ELORZA M V, RICO H, SENTANDREU R. Calcofluor white alters the assembly of chitin fibrils inandcells. Journal of General Microbiology, 1983, 129(5): 1577-1582.

[26] 高飛雁, 李玲, 王教瑜, 王艷麗, 孫國昌. PEX基因在過氧化物酶體形成及真菌致病性中的作用. 遺傳, 2017, 39(10): 908-917.

GAO F Y, LI L, WANG J Y, WANG Y L, SUN G C. The functions of PEX genes in peroxisome biogenesis and pathogenicity in phytopathogenic fungi. Hereditas, 2017, 39(10): 908-917. (in Chinese)

[27] 劉毛欣, 王教瑜, 孫國昌. 稻瘟病菌過氧化物酶體產(chǎn)生與降解的關鍵基因. 中國生物化學與分子生物學報, 2014, 30(6): 554-564.

LIU M X, WANG J Y, SUN G C. Key genes in peroxisome biogenesis and degradation in. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 30(6): 554-564. (in Chinese)

[28] WANG J Y, WU X Y, ZHANG Z, DU X F, CHAI R Y, LIU X H, MAO X Q, QIU H P, WANG Y L, LIN F C, SUN G C. Fluorescent co-localization of PTS1 and PTS2 and its application in analysis of the gene function and the peroxisomal dynamic in. Journal of Zhejiang University Science B, 2008, 9(10): 802-810.

[29] 虞夢雪, 王教瑜, 王士臻, 李玲, 王艷麗, 孫國昌. 灰葡萄孢菌過氧化物酶體及細胞核的熒光蛋白標記. 微生物學報, 2021, 61(5): 1246-1256.

YU M X, WANG J Y, WANG S Z, LI L, WANG Y L, SUN G C. Fluorescent labeling of peroxisome and nucleus in. Acta Microbiologica Sinica, 2021, 61(5): 1246-1256. (in Chinese)

[30] LU Y Q, ZHANG Y, LIAN N, Li X J. Membrane dynamics regulated by cytoskeleton in plant immunity. International Journal of Molecular Sciences,2023, 24(7): 6059.

[31] 吳祖純, 劉新光, 陳維春. 絲狀肌動蛋白的組裝及其生物學功能. 生命的化學, 2022, 42(5): 984-992.

WU Z C, LIU X G, CHEN W C. Assembly and biological functions of filamentous actin. Chemistry of Life, 2022, 42(5): 984-992. (in Chinese)

[32] 黃璐, 陳菁秋, 孫海濤, 李艷紅, 陳志玲. 粗糙脈孢菌絲切蛋白的純化及微絲解聚活性分析. 生物學雜志, 2022, 39(6): 25-29.

HUANG L, CHEN J Q, SUN H T, LI Y H, CHEN Z L. Purification and characterization of F-actin depolymerization properties of cofilin from. Journal of Biology, 2022, 39(6): 25-29. (in Chinese)

[33] DAGDAS Y F, YOSHINO K, DAGDAS G, RYDER L S, BIELSKA E, STEINBERG G, TALBOT N J. Septin-mediated plant cell invasion by the rice blast fungus,. Science, 2012, 336(6088): 1590-1595.

[34] RIEDL J, CREVENNA A H, KESSENBROCK K, YU J H, NEUKIRCHEN D, BISTA M, BRADKE F, JENNE D, HOLAK T A, WERB Z, SIXT M, WEDLICH-SOLDNER R. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods, 2008, 5(7): 605-607.

[35] GUPTA Y K, DAGDAS Y F, MARTINEZ-ROCHA A L, KERSHAW M J, LITTLEJOHN G R, RYDER L S, SKLENAR J, MENKE F, TALBOT N J. Septin-dependent assembly of the exocyst is essential for plant infection by. The Plant Cell, 2015, 27(11): 3277-3289.

[36] ZHAO Y L, ZHOU T T, GUO H S. Hyphopodium-specific VdNoxB/VdPls1-dependent ROS-Ca2+signaling is required for plant infection by. PLoS Pathogens, 2016, 12(7): e1005793.

[37] ZHOU T T, ZHAO Y L, GUO H S. Secretory proteins are delivered to the septin-organized penetration interface during root infection by. PLoS Pathogens, 2017, 13(3): e1006275.

[38] ZURIEGAT Q, ZHENG Y, LIU H, WANG Z, YUN Y. Current progress on pathogenicity-related transcription factors in. Molecular Plant Pathology, 2021, 22(7): 882-895.

[39] CHEN Y, KISTLER H C, MA Z.trichothecene mycotoxins: Biosynthesis, regulation, and management. Annual Review of Phytopathology, 2019, 57: 15-39.

[40] 孫華, 馬紅霞, 丁夢軍, 李坡, 石潔, 劉樹森. 擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫的構建及分析. 中國農業(yè)科學, 2019, 52(8): 1380-1388. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.008.

SUN H, MA H X, DING M J, LI P, SHI J, LIU S S. Construction and evaluation of ATMT mutant library of. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(8): 1380-1388. doi: 10.3864/ j.issn.0578-1752.2019.08.008. (in Chinese)

[41] DENG Q, WU H, GU Q, TANG G, LIU W. Glycosyltransferase FvCpsA regulates fumonisin biosynthesis and virulence in. Toxins, 2021, 13(10): 718.

[42] WANG Y, LIU X, XU Y, GU Y, ZHANG X, ZHANG M, WEN W, LEE Y W, SHI J, MOHAMED S R, GODA A A, WU H, GAO X, GU Q. The autophagy-related proteins FvAtg4 and FvAtg8 are involved in virulence and fumonisin biosynthesis in. Virulence, 2022, 13(1): 764-780.

[43] ZHANG L, HOU M, ZHANG X, CAO Y, SUN S, ZHU Z, HAN S, CHEN Y, KU L, DUAN C. Integrative transcriptome and proteome analysis reveals maize responses toinfection inside the stalks. Molecular Plant Pathology, 2023, 24(7): 693-710.

[44] ZHOU D, WANG X, CHEN G, SUN S, YANG Y, ZHU Z, DUAN C. The majorspecies causing maize ear and kernel rot and their toxigenicity in Chongqing, China. Toxins, 2018, 10(2): 90.

[45] ZHOU L, ZHAO J, GUO W, ZHANG T. Functional analysis of autophagy genes via-mediated transformation in the vascular wilt fungus. Journal of Genetics and Genomics, 2013, 40(8): 421-431.

[46] 趙培寶, 周慶新, 任愛芝, 李多川. 根癌農桿菌介導的輪枝鐮孢菌遺傳轉化及T-DNA插入突變體的篩選. 菌物學報, 2008, 27(2): 258-266.

ZHAO P B, ZHOU Q X, REN A Z, LI D C.-mediated transformation ofand T-DNA insertional mutagenesis of the fungus. Mycosystema, 2008, 27(2): 258-266. (in Chinese)

[47] 吳磊, 王曉鳴, 徐榮旗, 李洪杰. 利用紅色熒光蛋白標記的輪枝鐮孢研究病原菌對玉米根系的系統(tǒng)侵染和定殖. 作物學報, 2011, 37(5): 793-802.

WU L, WANG X M, XU R Q, LI H J. Root infection and systematic colonization of DsRed-labelledin maize. Acta Agronomica Sinica, 2011, 37(5): 793-802. (in Chinese)

[48] 張小飛, 李曉, 崔麗娜, 鄒成佳, 彭云良, 楊曉蓉. 輪枝鐮孢菌的綠色熒光蛋白基因標記. 西南農業(yè)學報, 2014, 27(6): 2374-2376.

ZHANG X F, LI X, CUI L N, ZOU C J, PENG Y L, YANG X R. Green fluorescent protein gene transformation on. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2014, 27(6): 2374-2376. (in Chinese)

[49] WILSON R A, TALBOT N J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by. Nature Reviews Microbiology, 2009, 7(3): 185-195.

[50] RYDER L S, DAGDAS Y F, KERSHAW M J, VENKATARAMAN C, MADZVAMUSE A, YAN X, CRUZ-MIRELES N, SOANES D M, OSES-RUIZ M, STYLES V, SKLENAR J, MENKE F L H, TALBOT N J. A sensor kinase controls turgor-driven plant infection by the rice blast fungus. Nature, 2019, 574(7778): 423-427.

[51] RYDER L S, DAGDAS Y F, MENTLAK T A, KERSHAW M J, THORNTON C R, SCHUSTER M, CHEN J, WANG Z, TALBOT N J. NADPH oxidases regulate septin-mediated cytoskeletal remodeling during plant infection by the rice blast fungus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(8): 3179-3184.

[52] WILSON R A, GIBSON R P, QUISPE C F, LITTLECHILD J A, TALBOT N J. An NADPH-dependent genetic switch regulates plant infection by the rice blast fungus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(50): 21902-21907.

[53] JEON J, GOH J, YOO S, CHI M H, CHOI J, RHO H S, PARK J, HAN S S, KIM B R, PARK S Y, KIM S, LEE Y H. A putative map kinase kinase kinase, mck1, is required for cell wall integrity and pathogenicity of the rice blast fungus,. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2008, 21(5): 525-534.

[54] CAI Y, LIU X, SHEN L, WANG N, HE Y, ZHANG H, WANG P, ZHANG Z. Homeostasis of cell wall integrity pathway phosphorylation is required for the growth and pathogenicity of. Molecular Plant Pathology, 2022, 23(8): 1214-1225.

[55] 顧卓侃, 李玲, 王教瑜, 柴榮耀, 王艷麗, 張震, 毛雪琴, 邱海萍, 孫國昌. 利用卡氏白和尼羅紅染色觀察稻瘟病菌有性世代的結構. 中國水稻科學, 2016, 30(6): 668-672.

GU Z K, LI L, WANG J Y, CHAI R Y, WANG Y L, ZHANG Z, MAO X Q, QIU H P, SUN G C. Observation of sexual structure ofvia calcofluor white and nile red staining. Chinese Journal of Rice Science, 2016, 30(6): 668-672. (in Chinese)

[56] 郭曉宇, 李玲, 董波, 王教瑜, 柴榮耀, 張震, 毛雪琴, 邱海萍, 郝中娜, 王艷麗, 孫國昌. 利用熒光蛋白標記研究稻瘟病菌有性世代的細胞結構. 中國細胞生物學學報, 2018, 40(7): 1138-1145.

GUO X Y, LI L, DONG B, WANG J Y, CHAI R Y, ZHANG Z, MAO X Q, QIU H P, HAO Z N, WANG Y L, SUN G C. Lighting the cellular structures of sexual generation inwith fluorescent proteins and fluorescent dyes. Chinese Journal of Cell Biology, 2018, 40(7): 1138-1145. (in Chinese)

[57] KAKSONEN M, SUN Y, DRUBIN D G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell, 2003, 115(4): 475-487.

[58] LI X, GAO C, LI L, LIU M, YIN Z, ZHANG H, ZHENG X, WANG P, ZHANG Z. MoEnd3 regulates appressorium formation and virulence through mediating endocytosis in rice blast fungus. PLoS Pathogens, 2017, 13(6): e1006449.

[59] GU Q, CHEN Y, LIU Y, ZHANG C, MA Z. The transmembrane protein FgSho1 regulates fungal development and pathogenicity via the MAPK module Ste50-Ste11-Ste7 in. New Phytologist, 2015, 206(1): 315-328.

[60] ZHANG Y, CHOI Y E, ZOU X, XU J R. The FvMK1 mitogen- activated protein kinase gene regulates conidiation, pathogenesis, and fumonisin production in. Fungal Genetics and Biology, 2011, 48(2): 71-79.

[61] ZHANG C, WANG J, TAO H, DANG X, WANG Y, CHEN M, ZHAI Z, YU W, XU L, SHIM W B, LU G, WANG Z. FvBck1, a component of cell wall integrity MAP kinase pathway, is required for virulence and oxidative stress response in sugarcane Pokkah Boeng pathogen. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 1096.

Fluorescent labeling and observation of infection structure of

Ha DanDan1, Zheng HongXia2, Zhang ZhenHao2, ZHu LiHong3, Liu Hao1, Wang JiaoYu, Zhou Lei

1College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457;2Institute of Agro-Product Safety and Nutrition, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products, Hangzhou 310021;3Institute of Plant Protection and Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021

【Objective】Taking the dominant pathogencausing maize ear rot and producing fumonisin as the research object, the objective of this study is to construct fluorescent strains that constitutively express green fluorescent protein GFP, red fluorescent protein DsRED, peroxisome targeted marker protein DsRED-PTS1 and F-actin cytoskeleton binding protein LifeAct-GFP, observe the penetration structure ofinfecting maize silk epidermis, and to clarify the regulatory mechanisms and influencing factors regulating the infection structure formation of.【Method】Fluorescent expression vectors pCOM-GFP, pCOM-DsRED, pCOM-DsRED-PTS1, and pCOM-LifeAct-GFP were transformed into the wild-type strain D85-2 ofthrough-mediated genetic transformation. The transformants containing the target genes were identified by PCR, and the expression and distribution of various fluorescent proteins were observed under laser confocal microscopy. Maize was inoculated to observe the infection structure. The penetration structure and dynamic assembly of F-actin were observed by simulating the plant epidermal penetration experiment with cellophane membrane. The influencing factors of penetration structure formation were detected using F-actin polymerization inhibitor Latruculin A, tricyclazole, and reactive oxygen species (ROS) inhibitor DPI (diphenyleneiodonium chloride).【Result】A genetic transformation method using geneticin G418 as a resistance marker was established. FV-GFP and FV-DsRED strains have clear and bright green fluorescence and red fluorescence, respectively. The red fluorescence in FV-DsRED-PTS1 strain is distributed as round dots in conidia and hypha, which is consistent with the distribution characteristics of peroxisome in fungi. FV-LifeAct-GFP strain has filamentous green fluorescence in conidia and hypha, which is consistent with the distribution characteristics of F-actin protein in fungi. During the infection process of maize silk epidermis, an infection structure resembling a hyphopodium was observed at the top of the hyphae. the ring-forming assembly of F-actin protein in the penetration structure was observed in the mimic penetration experiment on the cellophane membrane. Drug stress experiments have shown that the formation of penetrating structures is regulated by F-actin protein polymerization and ROS. Meanwhile, tricyclazole can inhibit penetration.【Conclusion】Four fluorescent labeled strains were constructed, with clear cell localization and normal growth phenotype and pathogenicity, which can meet the research needs related to pathogenic mechanisms.can form a hyphopodium like infection structure with swollen hyphae at the top when infecting maize. It is confirmed that F-actin cyclization and polymerization, cytoskeleton assembly and ROS regulation are the key factors affecting the formation of infection structure of.

;fluorescent labeling; peroxisome; infection structure; F-actin; reactive oxygen species (ROS)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.006

2023-04-25；

2023-07-04

浙江省自然科學基金（LZ20C1400001）

哈丹丹，E-mail：danha61@163.com。鄭紅霞，E-mail：hxzh_bio@126.com。哈丹丹和鄭紅霞為同等貢獻作者。通信作者周雷，E-mail：zhoul@zaas.ac.cn。通信作者王教瑜，E-mail：wangjiaoyu78@sina.com

（責任編輯 岳梅）