申云鑫,李銘剛,施竹鳳,趙江源,王 楠,李者芬,楊明英,陳齊斌,楊佩文*
(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所,昆明 650205;3.云南省微生物研究所,昆明 650091)
由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum引起的番茄枯萎病,可通過(guò)侵染番茄根部并在維管束繁殖,引起維管束阻塞,導(dǎo)致植株萎蔫、枯死[1]。具有危害損失大、防治困難等特點(diǎn),還可危害瓜類(lèi)、茄類(lèi)、豆類(lèi)等多種經(jīng)濟(jì)作物。目前針對(duì)番茄枯萎病主要使用咯菌腈、惡霉靈、咪鮮胺等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治,而化學(xué)農(nóng)藥處理易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題,嚴(yán)重危害人類(lèi)與環(huán)境健康[2]。
在可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)的背景下,隨著《農(nóng)藥工業(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃》、《“十四五”全國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展規(guī)劃》等政策的推出,大力助推了生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-5]。但目前新生物農(nóng)藥仍面臨著研發(fā)難度大、生產(chǎn)工藝以及推廣應(yīng)用等方面的問(wèn)題[6-8]。因此,加強(qiáng)對(duì)新生物農(nóng)藥產(chǎn)品的研發(fā)以及生產(chǎn)工藝優(yōu)化,是推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化的重要措施之一,且對(duì)推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展、實(shí)現(xiàn)綠色防控具有重大意義。截至2022年,全國(guó)已登記的118 個(gè)芽胞桿菌屬微生物可濕性粉劑(Wettable powder)中,貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisWP 僅占1 個(gè)(來(lái)源于中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng):http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml)。近年來(lái),有關(guān)貝萊斯芽胞桿菌防治植物病害的研究報(bào)道日益增加,但缺乏對(duì)其可濕性粉劑研發(fā)的相關(guān)報(bào)道,以及缺乏對(duì)其進(jìn)行商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的開(kāi)發(fā)利用。研究表明,貝萊斯芽胞桿菌具有無(wú)致病性、抗逆性強(qiáng),產(chǎn)抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)豐富、抗菌譜廣以及可提高作物生長(zhǎng)性能和抗病力等特點(diǎn),已成為植物病害生物防治的理想微生物之一[9,10]。貝萊斯芽胞桿菌L-1 可抑制引起梨紋病的貝倫格葡萄座腔菌和粉紅單端孢菌的生長(zhǎng),且可長(zhǎng)期定殖于植株內(nèi)部[11,12];分離自水稻OryzasativaL葉片的貝萊斯芽胞桿菌E69,在高效防治葉瘟病的同時(shí),可定殖于作物莖、葉以及維管束等部位,從而達(dá)到病害持續(xù)防控的目的[13];從多花黃精根部分離的貝萊斯芽胞桿菌ZJU-3,不僅具有產(chǎn)表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽類(lèi)抑菌化合物的功能,而且可產(chǎn)生吲哚乙酸、激動(dòng)素、玉米素和赤霉素等植物促生激素[14];貝萊斯芽胞桿菌8-4 能夠有效抑制馬鈴薯瘡痂病的病原鏈霉菌Streptomycesgalilaeus生長(zhǎng),且能提高馬鈴薯的產(chǎn)量[15]。總體來(lái)說(shuō),貝萊斯芽胞桿菌在生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)酶制劑等領(lǐng)域是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)菌株[16,17],但由于其在菌種資源、生產(chǎn)工藝和定殖能力等方面存在問(wèn)題,導(dǎo)致其缺乏規(guī)?;蜕虡I(yè)化應(yīng)用[18]。此外,國(guó)內(nèi)外對(duì)于貝萊斯芽胞桿菌WP 的研發(fā)相關(guān)報(bào)道較少,亟需加強(qiáng)對(duì)貝萊斯芽胞桿菌WP 生產(chǎn)工藝的探索和優(yōu)化并進(jìn)行實(shí)際生防試驗(yàn)進(jìn)行研究。
貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 分離自健康煙草根際土壤,其對(duì)番茄枯萎病菌具有良好的拮抗作用,且具有srfA、fenB、ituA、ituD、bymA等抗生素的合成基因,以及產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、解磷、固氮、分泌鐵載體的能力[19],具有廣闊的應(yīng)用前景。為使其可更加高效地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物病害的生物防治,并有效實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,本文以其為研究對(duì)象,通過(guò)試驗(yàn)對(duì)其載體、潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑及其復(fù)配比例進(jìn)行篩選,研制貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP,根據(jù)可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)其各項(xiàng)指標(biāo),測(cè)定其貯存穩(wěn)定性,并采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)?zāi)P蜏y(cè)定SH-1471 WP 對(duì)番茄枯萎病的防治效果,為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 的開(kāi)發(fā)及進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌種 供試菌種:貝萊斯芽胞桿菌 SH-1471 由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所于健康煙草根際土壤分離、鑒定與保存,于2022 年6 月20 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2022923,專(zhuān)利號(hào):ZL 2022 1 1479280.X)。
供試病原物:文中涉及的指示病原物番茄枯萎病菌由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所分離、鑒定與保存。
1.1.2 培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉粉3 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂15 g/L,pH 7.0~7.4,蒸餾水1 L;種子培養(yǎng)基(本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化所得):蔗糖10 g/L,豆粉10 g/L,硫酸鎂2.5 g/L,酵母膏5 g/L,蒸餾水1 L;發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮10 g/L,玉米粉30 g/L,黃豆粉30 g/L,KH2PO40.3 g/L,Na2HPO44 g/L,蒸餾水1 L,pH 7.0~7.2。
1.1.3 載體和助劑 載體:膨潤(rùn)土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑、凹凸棒土、高嶺土、輕質(zhì)碳酸鈣等。潤(rùn)濕劑:洗衣粉、皂角粉、D425、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉CMC-Na(Carboxymethylcellulose)、十二烷基硫酸鈉SDS(Sodium sulfate)、十二烷基苯磺酸鈉DBS (Dodecyl benzene sulfonate)、吐溫-60 等。分散劑:NNO、聚乙烯醇(PEG8000)、木質(zhì)素磺酸鈣。穩(wěn)定劑:磷酸氫二鉀(K2HPO4)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、海藻酸鈉、黃原膠、輕質(zhì)碳酸鈣、十二烷基苯磺酸鈉(DBS)。紫外保護(hù)劑:糊精、抗壞血酸VC(Vitamin C)、海藻酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉(DBS)。文中涉及所有載體和助劑均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。
將培養(yǎng)好的解淀粉芽胞桿菌SH-1471 菌株用接種針劃線(xiàn)培養(yǎng)接種于NA 固體培養(yǎng)基上,28 ℃倒置培養(yǎng)24 h,獲得單菌落。挑取單菌落接種于裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中,30 ℃、200 r/min(本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化所得)振蕩培養(yǎng)24 h,得到種子液。
取貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 菌株種子液,以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d,得到菌株發(fā)酵液。
1.4.1 可濕性粉劑載體篩選及母粉制備 載體吸附能力測(cè)定:分別取無(wú)菌供試載體100 g 置于三角瓶,將SH-1471 菌株發(fā)酵液緩慢倒入三角瓶中,玻璃棒同時(shí)攪拌至載體呈流動(dòng)狀且不結(jié)塊、不溢水,記錄所倒入發(fā)酵液的體積V,并計(jì)算載體最大吸附量:H=V/0.1(Kg/L)。潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率測(cè)定:將菌株發(fā)酵液與各載體均勻混合,經(jīng)進(jìn)風(fēng)溫度175 ℃,出風(fēng)溫度60 ℃進(jìn)行噴霧干燥后制成母粉,并參照1.4.4 中質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法,分別測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率。最綜合考慮潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率、吸附容量以及成本等擇優(yōu)選擇載體類(lèi)型。
1.4.2 可濕性粉劑助劑篩選 潤(rùn)濕劑和分散劑篩選:將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉分別與待選潤(rùn)濕劑(12%)和分散劑(12%)經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑,每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù),參照1.4.4 中質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率,并測(cè)定胞子萌發(fā)率,結(jié)合潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率選擇最佳潤(rùn)濕劑和分散劑。
潤(rùn)濕劑和分散劑最佳質(zhì)量配比篩選:結(jié)合潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率分別挑選出潤(rùn)濕劑和分散劑,以潤(rùn)濕劑與分散劑:1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1 的含量與貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎,混合均勻后加工制成可濕性粉劑,每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù),測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率,結(jié)合潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率以及胞子萌發(fā)率選擇最佳配比。
潤(rùn)濕劑和分散劑總用量對(duì)可濕性粉劑性能的影響:將篩選所得濕潤(rùn)劑和分散劑經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混勻,按上述比例均勻混合后過(guò)325 目篩,分別以2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的用量與貝萊斯芽胞桿菌母粉均勻混合,測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率。綜合考慮制劑潤(rùn)濕性、懸浮率以及胞子萌發(fā)率,篩選出濕潤(rùn)劑和分散劑的最佳用量。
穩(wěn)定劑篩選:將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉與潤(rùn)濕劑、分散劑及待選穩(wěn)定劑(1%、2%、3%)經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑,以不加穩(wěn)定劑為對(duì)照每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù);采用《農(nóng)藥可濕性粉劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)范》(GB/T 19136-2003)中的試驗(yàn)方法進(jìn)行加速貯藏穩(wěn)定性測(cè)定:熱貯(54±2)℃,14 d 后測(cè)定芽胞含量的變化,計(jì)算芽胞損失率(%)=(儲(chǔ)藏前芽胞含量-儲(chǔ)藏后芽胞含量)/儲(chǔ)藏前芽胞含量×100。
紫外保護(hù)劑篩選:將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉與已篩選所得的潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑及待篩選紫外保護(hù)劑(0.5%、1.0%、1.5%)經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑,以不加保護(hù)劑為對(duì)照,稀釋涂布在平板上,在254 nm 紫外燈(20W)距離40 cm 處照射12、24 h 后,計(jì)算芽胞存活率,篩選出最佳紫外保護(hù)劑。
1.4.3 可濕性粉劑研制 將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 發(fā)酵液與粉碎后的1.2.3 中篩選所得載體、潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑等按優(yōu)化后的配比同時(shí)混合,邊攪拌邊進(jìn)行噴霧干燥制成可濕性粉劑。
1.4.4 可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)硬水的配制:稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣0.304 g,帶結(jié)晶水的氯化鎂0.139 g,放入1000 mL 容量瓶中,用蒸餾水溶解、稀釋至刻度。
(1)含孢量測(cè)定:參考《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 2293.1-2012)進(jìn)行含孢量測(cè)定。
(2)懸浮率測(cè)定:參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定》(GB/T 14825-2006)為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。
(3)潤(rùn)濕時(shí)間測(cè)定:參考《可濕性粉劑潤(rùn)濕性的測(cè)定》(GB/T 5451-2001)為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。
(4)細(xì)度測(cè)定:參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定》(GB/T 16150-1995)為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。
(5)含水率測(cè)定:參考《農(nóng)藥水分測(cè)定》(GB/T 1600-2001)為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。
(6)pH 測(cè)定方法:參考《農(nóng)藥pH 值的測(cè)定》(GB/T 1601-1993)為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。
(7)雜菌率測(cè)定:將可濕性粉劑樣品梯度稀釋后,分別涂布在NA 和PDA 培養(yǎng)基上,在PDA 平板上檢測(cè)真菌雜菌數(shù),在NA 平板上檢測(cè)細(xì)菌雜菌數(shù),細(xì)菌與真菌總和所占總比例為雜菌率。
1.4.5 制劑穩(wěn)定性的測(cè)定 稱(chēng)取一定量的貝萊斯芽胞桿菌WP 分別在低溫(4 ℃±2 ℃)條件下以及室溫(25 ℃)下連續(xù)貯存180 d,并每10 d 使用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)并計(jì)算貝萊斯芽胞桿菌WP 的芽胞存活率。
番茄枯萎病發(fā)病情況調(diào)查分組標(biāo)準(zhǔn)如下:0:無(wú)癥狀;1:一片或兩片葉子變黃;2:三片或者四片真葉變黃葉片萎蔫下垂;3:五片或六片真葉變黃或真葉萎蔫下垂;4:全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死。
病情指數(shù)=(各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值)/(總株數(shù)×最高級(jí)值)×100;
防效(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。
數(shù)據(jù)采用單因素方差分析、多重比較及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較處理間的顯著性差異。選擇Excel 和SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,以及采用Origin 2018 和GraphPad Prism 8 軟件制圖。
以吸附容量、潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率為指標(biāo)進(jìn)行載體篩選結(jié)果如表1,7 種載體在吸附容量上具有顯著差異,其中白炭黑的吸附容量最高,為3.7 mL/g,其次為硅藻土、凹凸棒土和高嶺土,吸附容量分別為2.8、2.6 和1.9 mL/g;高嶺土的潤(rùn)濕時(shí)間最短,為15.7 s,其次為硅藻土和白炭黑,分別為17.8 和18.4 s,凹凸棒土和膨潤(rùn)土的潤(rùn)濕時(shí)間最長(zhǎng),分別為61.6 和75.5 s;高嶺土和硅藻土的懸浮率最高,均超過(guò)70%,分別為79.5%和66.5%,故選擇高嶺土作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的載體。
表1 SH-1471 WP 載體篩選結(jié)果Table 1 Screening results of SH-1471 WP vector
將待選潤(rùn)濕劑和分散劑以12%的含量與選定的載體、發(fā)酵液混合均勻,噴霧干燥制成可濕性粉劑,檢測(cè)其潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率,結(jié)果如表2 所示,以潤(rùn)濕時(shí)間為指標(biāo),潤(rùn)濕劑中木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉(DBS)、洗衣粉及羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的潤(rùn)濕時(shí)間最短,依次為11.8、12.2、16.8 和17.8 s;分散劑中NNO、木質(zhì)素磺酸鈣及聚乙烯醇(PEG 8000)的潤(rùn)濕時(shí)間最短,分別為13.1、15.6 和15.8 s;以懸浮率為指標(biāo),NNO 的懸浮率最高,達(dá)90.9%,其次為木質(zhì)素磺酸鈉,達(dá)84.9%,再次為三聚磷酸鈉,達(dá)84.8%,十二烷基硫酸鈉(SDS)、拉開(kāi)粉、木質(zhì)素磺酸鈣、皂角粉、洗衣粉和吐溫-60 的懸浮率均超過(guò)70%,以木質(zhì)素磺酸鈉和羧甲基纖維素鈉作為潤(rùn)濕劑時(shí),活菌數(shù)最高為2.79×109CFU/g,以NNO 為分散劑時(shí),活菌數(shù)最高為2.58×109CFU/g。綜合潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和活菌數(shù),選擇NNO 作為分散劑、木質(zhì)素磺酸鈉作為潤(rùn)濕劑。
表2 SH-1471 WP 潤(rùn)濕劑、分散劑篩選結(jié)果Table 2 Screening results of wetting agent and dispersant for SH-1471 WP
由表3 可知,潤(rùn)濕時(shí)間隨著潤(rùn)濕劑木質(zhì)素磺酸鈉含量增多而降低,懸浮率隨著分散劑NNO 的含量降低而降低,其潤(rùn)濕時(shí)間最高為12.3 s,已達(dá)標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)木質(zhì)素纖維素鈉:NNO 為1:9 時(shí),潤(rùn)濕時(shí)間為12.3 s,懸浮率最高為88.6%,芽胞含量為2.73×109CFU/g;當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉:NNO 為2:8 時(shí),潤(rùn)濕時(shí)間為10.1 s,懸浮率為87.2%,芽胞含量為2.86×109CFU/g。結(jié)合潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率及芽胞含量結(jié)果,故確定木質(zhì)素磺酸鈉:NNO 的比例為2:8。
科文學(xué)院擬將新教學(xué)樓北區(qū)3層及4層的8個(gè)多媒體教室的320臺(tái)電腦開(kāi)通視頻點(diǎn)播系統(tǒng),以便學(xué)生點(diǎn)播優(yōu)秀的視頻課件.為此,在網(wǎng)絡(luò)中心增加1臺(tái)視頻服務(wù)器,并將其命名為Video Destination,通過(guò)6類(lèi)雙絞線(xiàn)千兆連接到核心交換機(jī)CS6509上,利用OPNET Modeler提供的Video Conferencing業(yè)務(wù)進(jìn)行仿真.
表3 潤(rùn)濕劑與分散劑最佳配比篩選結(jié)果Table 3 Screening results of optimum ratio of wetting agent and dispersant
由表4 可知,隨著潤(rùn)濕劑和分散劑總用量的增加,貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤(rùn)濕時(shí)間逐漸變短,當(dāng)二者總用量?jī)H為2%時(shí),制劑潤(rùn)濕時(shí)間為21.6 s,顯著高于其他用量,當(dāng)二者總用量為12%時(shí),潤(rùn)濕時(shí)間最短為10.1 s;說(shuō)明增加潤(rùn)濕劑和分散劑總用量對(duì)貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤(rùn)濕時(shí)間的變短具有促進(jìn)作用;且隨著潤(rùn)濕劑和分散劑總用量的增加,其懸浮率具有明顯的提高,當(dāng)用量為2%時(shí),懸浮率僅為51.4%,當(dāng)用量提高至18%時(shí),懸浮率達(dá)89.9%,表明增加潤(rùn)濕劑和分散劑總用量對(duì)其潤(rùn)濕性和懸浮率均有促進(jìn)作用,但隨著潤(rùn)濕劑和分散劑總用量的提高,制劑中芽胞存活率會(huì)有一定的損失,總用量為18%時(shí),芽胞含量?jī)H為2.42×109CFU/g,相比低濃度具有一定的損失。結(jié)合潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率以及芽胞存活率,本試驗(yàn)中選擇潤(rùn)濕劑和分散劑總用量為10%,此時(shí)貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤(rùn)濕時(shí)間為10.3 s,懸浮率為88.6%,芽胞含量為2.92×109CFU/g。
表4 潤(rùn)濕劑和分散劑總用量篩選結(jié)果Table 4 Screening results of total dosage of wetting agent and dispersant
結(jié)合表5 的試驗(yàn)結(jié)果可知,與CK1(不加穩(wěn)定劑,不熱儲(chǔ))和CK2(不加穩(wěn)定劑,熱儲(chǔ))相比,穩(wěn)定劑的添加,可降低高溫脅迫下的芽胞熱儲(chǔ)損失率,在(54±2)℃下儲(chǔ)存7 d 時(shí),與CK2(不加穩(wěn)定劑,熱儲(chǔ)7 d)相比,加了穩(wěn)定劑后貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的芽胞損失率均降低,其中以穩(wěn)定劑2%黃原膠的保護(hù)效果最好,可將熱儲(chǔ)損失率降低至14.01%,當(dāng)(54±2)℃下儲(chǔ)存14 d 時(shí),在添加2%黃原膠作為保護(hù)劑,可使熱儲(chǔ)損失率降低至30.74%。結(jié)合生物相容性和熱儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇黃原膠2%作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的穩(wěn)定劑。
表5 SH-1471 WP 穩(wěn)定劑篩選結(jié)果Table 5 Screening results of SH-1471 WP stabilizer
由表6 可知,與CK1(不加紫外保護(hù)劑,不照射)和CK2(不加紫外保護(hù)劑,照射)相比,紫外保護(hù)劑的添加,可降低紫外脅迫下的芽胞存活率,當(dāng)添加1%的紫外保護(hù)劑,在254 nm 紫外燈(20W)距離40 cm處照射12、24 h 后,以1%抗壞血酸(VC)為紫外保護(hù)劑時(shí)的存活率最高,照射12 h 時(shí)存活率為71.43%,照射24 h 時(shí)存活率為59.52%,其次為糊精(1%)和海藻酸鈉(1%),12 h 的存活率分別為65.31%和38.14%,24 h 的存活率分別為36.73%和4.24%。而十二烷基苯磺酸鈉(DBS)的存活率最低。結(jié)合紫外保護(hù)效果與生物相容性試驗(yàn)結(jié)果,選擇1%抗壞血酸(VC)作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的紫外保護(hù)劑。
表6 SH-1471 WP 紫外保護(hù)劑篩選結(jié)果Table 6 Screening results of SH-1471 WP UV protectant
將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 發(fā)酵液與篩選所得并粉碎載體、潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑等按優(yōu)化后的配比同時(shí)混合,邊攪拌邊進(jìn)行噴霧干燥制得貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP。對(duì)貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如表7 所示,根據(jù)檢測(cè)測(cè)量值與質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值,貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 細(xì)度、潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH、活菌數(shù)以及雜菌率均符合質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值,可應(yīng)用于植物病害的生物防治。
表7 SH-1471 WP 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 7 SH-1471 WP quality test results
貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑經(jīng)室溫4 ℃、25 ℃連續(xù)儲(chǔ)藏180 d,每10 d 測(cè)定依次芽胞存活率,測(cè)定結(jié)果如圖1 所示,貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑在4 ℃下,180 d 后芽胞存活為87.65%,而在室溫25 ℃下儲(chǔ)藏180 d 結(jié)果表明,其芽胞存活率為82.45%。該結(jié)果表明,低溫對(duì)菌株的存活率影響較小,而高溫對(duì)菌株的存活率有一定的影響。
圖1 SH-1471 WP 連續(xù)180 d 儲(chǔ)藏結(jié)果Fig.1 SH-1471 WP continuous 180 d storage results
室內(nèi)盆栽防效實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示,采用拌土+灌根、拌土和灌根三種方式評(píng)價(jià)貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑對(duì)番茄枯萎病的防治效果,與CK1(單接病原菌)相比,貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 灌根+拌土對(duì)番茄枯萎病的防效最好,發(fā)病率僅為4.2%,防治效果可達(dá)93.7%,防效顯著優(yōu)于3% 多抗霉素WP;其次為拌土,發(fā)病率僅為8.6%,防治效果為85.8%;灌根處理下發(fā)病率為9.2%,防治效果為83.3%。
表8 SH-1471 WP 盆栽防治效果Table 8 Potting control effect of SH-1471 WP
可濕性粉劑是我國(guó)微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬?,在病蟲(chóng)害綠色防控中發(fā)揮越來(lái)越大的作用,因其相比于液體制劑和其他固體制劑具有生產(chǎn)成本低,有效成分含量高,濕潤(rùn)性好、易于運(yùn)輸和貯運(yùn),且防病范圍更廣等特點(diǎn),在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用[20]。其通常由載體、潤(rùn)濕劑、懸浮劑、分散劑、穩(wěn)定劑以及保護(hù)劑等組成,并以有效成分含量、懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間、干燥減量、細(xì)度以及pH 等作為質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)品研發(fā)以及工藝優(yōu)化[21]。
載體在可濕性粉劑中所占比例最大,探究載體與菌株之間的生物相容性是極其重要的。本研究發(fā)現(xiàn),高嶺土和硅藻土與菌株的生物相容性最好,顯著高于白炭黑、滑石粉等。Chiou 等[22]則發(fā)現(xiàn),以高嶺土為載體,可提高芽胞存活率。王劍等[23]和孫麗麗等[24]等[的研究結(jié)果與本研究相同,以硅藻土為載體時(shí),制劑芽胞存活率較高。而陳茹等[25]研究則表明,當(dāng)使用硅藻土為WP 的載體時(shí),其孢子萌發(fā)率會(huì)受到抑制。由此可知,盡管大部分載體為惰性材料,但不同菌株對(duì)同種載體的適應(yīng)能力不同,且同種載體對(duì)不同菌株的生物相容性亦存在差異。因此,菌株與載體的生物相容性測(cè)定尤為重要。
懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間是評(píng)價(jià)農(nóng)藥可濕性粉劑質(zhì)量的重要指標(biāo),直接影響制劑的操作便利性和混合均一穩(wěn)定性[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素磺酸鈉可顯著縮短制劑的潤(rùn)濕時(shí)間,僅為11.8 s,且不對(duì)菌株有抑制作用,而十二烷基苯磺酸鈉(DBS)的潤(rùn)濕時(shí)間為12.2 s,且菌株孢子萌發(fā)率大幅下降,表明其對(duì)菌株具有一定的毒害作用。相同地,錢(qián)一鑫等[27]試驗(yàn)結(jié)果十二烷基苯磺酸鈉(DBS)可縮短制劑潤(rùn)濕時(shí)間至11 s,但對(duì)菌株芽胞含量會(huì)造成一定的損失。本制劑在加入NNO 作為分散劑時(shí),懸浮率得到顯著提高,達(dá)90.9%,顯著優(yōu)于張成等[28]的木霉菌TrichodermavirideT069 可濕性粉劑懸浮率(73.04%),以及且顯著優(yōu)于劉盼西等[29]的海洋芽胞桿菌B.marinus可濕性粉劑的懸浮率(73.13%);基于此基礎(chǔ),本研究還進(jìn)行了潤(rùn)濕劑與分散劑的比例優(yōu)化和總用量?jī)?yōu)化,最終確定總用量為10%,比例為2:8 時(shí),以此制劑潤(rùn)濕時(shí)間最短,懸浮率最佳,且芽胞含量最高。
穩(wěn)定劑有利于制劑芽胞含量在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài),紫外保護(hù)劑可減少自然條件下紫外線(xiàn)對(duì)芽胞造成的不利影響[30]。本研究結(jié)果表明,黃原膠(2%)可降低菌株在溫度(54±2)℃下儲(chǔ)藏的損失率,僅為14.01%,以羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí),熱儲(chǔ)損失率高達(dá)49.38%。優(yōu)于李舒雯等[31]以羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí)的內(nèi)生短短芽胞桿菌B.endophytes可濕性粉劑的芽胞損失率(49%)。表明同一物質(zhì)對(duì)不同菌株的保護(hù)機(jī)制和保護(hù)效果不同,與張正一等[32]和張成等[28]的試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似,本研究以抗壞血酸(VC)(1%)作為紫外保護(hù)劑時(shí),可提高菌株在紫外照射下的存活率。貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 在25℃下儲(chǔ)藏180 d 后的存活率為82.45%,今后可進(jìn)一步對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化,以提高其在室溫條件下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及其環(huán)境適應(yīng)能力。此外,室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明本制劑可有效降低番茄枯萎病的發(fā)病率,防效達(dá)93.7%,防效高于3%多抗霉素。而羅嫚等[33]的研究表明,咪鮮胺和咯菌腈對(duì)番茄枯萎病的防治效果分別為52.5%、53.33%,表明貝萊斯芽胞桿菌WP 對(duì)番茄枯萎病具有良好的防治效果。
前期研究表明菌株SH-1471 還具有解磷、固氮等活性,可進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及提高作物抗逆性等方面的活性,并結(jié)合大田試驗(yàn)驗(yàn)證,探究和挖掘其生防、促生功能,以便發(fā)揮其在農(nóng)業(yè)病害防治和作物促生增產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值。