貝萊斯芽胞桿菌SH-1471可濕性粉劑研制及其對(duì)番茄枯萎病的防治效果

申云鑫，李銘剛，施竹鳳，趙江源，王 楠，李者芬，楊明英，陳齊斌，楊佩文*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；3.云南省微生物研究所，昆明 650091）

由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum引起的番茄枯萎病，可通過侵染番茄根部并在維管束繁殖，引起維管束阻塞，導(dǎo)致植株萎蔫、枯死[1]。具有危害損失大、防治困難等特點(diǎn)，還可危害瓜類、茄類、豆類等多種經(jīng)濟(jì)作物。目前針對(duì)番茄枯萎病主要使用咯菌腈、惡霉靈、咪鮮胺等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，而化學(xué)農(nóng)藥處理易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，嚴(yán)重危害人類與環(huán)境健康[2]。

在可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)的背景下，隨著《農(nóng)藥工業(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃》、《“十四五”全國農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展規(guī)劃》等政策的推出，大力助推了生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-5]。但目前新生物農(nóng)藥仍面臨著研發(fā)難度大、生產(chǎn)工藝以及推廣應(yīng)用等方面的問題[6-8]。因此，加強(qiáng)對(duì)新生物農(nóng)藥產(chǎn)品的研發(fā)以及生產(chǎn)工藝優(yōu)化，是推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化的重要措施之一，且對(duì)推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展、實(shí)現(xiàn)綠色防控具有重大意義。截至2022年，全國已登記的118 個(gè)芽胞桿菌屬微生物可濕性粉劑（Wettable powder）中，貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisWP 僅占1 個(gè)（來源于中國農(nóng)藥信息網(wǎng)：http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml）。近年來，有關(guān)貝萊斯芽胞桿菌防治植物病害的研究報(bào)道日益增加，但缺乏對(duì)其可濕性粉劑研發(fā)的相關(guān)報(bào)道，以及缺乏對(duì)其進(jìn)行商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的開發(fā)利用。研究表明，貝萊斯芽胞桿菌具有無致病性、抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物種類豐富、抗菌譜廣以及可提高作物生長(zhǎng)性能和抗病力等特點(diǎn)，已成為植物病害生物防治的理想微生物之一[9,10]。貝萊斯芽胞桿菌L-1 可抑制引起梨紋病的貝倫格葡萄座腔菌和粉紅單端孢菌的生長(zhǎng)，且可長(zhǎng)期定殖于植株內(nèi)部[11,12]；分離自水稻OryzasativaL葉片的貝萊斯芽胞桿菌E69，在高效防治葉瘟病的同時(shí)，可定殖于作物莖、葉以及維管束等部位，從而達(dá)到病害持續(xù)防控的目的[13]；從多花黃精根部分離的貝萊斯芽胞桿菌ZJU-3，不僅具有產(chǎn)表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽類抑菌化合物的功能，而且可產(chǎn)生吲哚乙酸、激動(dòng)素、玉米素和赤霉素等植物促生激素[14]；貝萊斯芽胞桿菌8-4 能夠有效抑制馬鈴薯瘡痂病的病原鏈霉菌Streptomycesgalilaeus生長(zhǎng)，且能提高馬鈴薯的產(chǎn)量[15]?？傮w來說，貝萊斯芽胞桿菌在生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)酶制劑等領(lǐng)域是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)菌株[16,17]，但由于其在菌種資源、生產(chǎn)工藝和定殖能力等方面存在問題，導(dǎo)致其缺乏規(guī)?；蜕虡I(yè)化應(yīng)用[18]。此外，國內(nèi)外對(duì)于貝萊斯芽胞桿菌WP 的研發(fā)相關(guān)報(bào)道較少，亟需加強(qiáng)對(duì)貝萊斯芽胞桿菌WP 生產(chǎn)工藝的探索和優(yōu)化并進(jìn)行實(shí)際生防試驗(yàn)進(jìn)行研究。

貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 分離自健康煙草根際土壤，其對(duì)番茄枯萎病菌具有良好的拮抗作用，且具有srfA、fenB、ituA、ituD、bymA等抗生素的合成基因，以及產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、解磷、固氮、分泌鐵載體的能力[19]，具有廣闊的應(yīng)用前景。為使其可更加高效地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物病害的生物防治，并有效實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，本文以其為研究對(duì)象，通過試驗(yàn)對(duì)其載體、潤濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑及其復(fù)配比例進(jìn)行篩選，研制貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP，根據(jù)可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)其各項(xiàng)指標(biāo)，測(cè)定其貯存穩(wěn)定性，并采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏y(cè)定SH-1471 WP 對(duì)番茄枯萎病的防治效果，為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 的開發(fā)及進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 供試菌種：貝萊斯芽胞桿菌 SH-1471 由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所于健康煙草根際土壤分離、鑒定與保存，于2022 年6 月20 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2022923，專利號(hào)：ZL 2022 1 1479280.X）。

供試病原物：文中涉及的指示病原物番茄枯萎病菌由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所分離、鑒定與保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0～7.4，蒸餾水1 L；種子培養(yǎng)基（本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化所得）：蔗糖10 g/L，豆粉10 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，酵母膏5 g/L，蒸餾水1 L；發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g/L，玉米粉30 g/L，黃豆粉30 g/L，KH2PO40.3 g/L，Na2HPO44 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 載體和助劑 載體：膨潤土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑、凹凸棒土、高嶺土、輕質(zhì)碳酸鈣等。潤濕劑：洗衣粉、皂角粉、D425、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉CMC-Na（Carboxymethylcellulose）、十二烷基硫酸鈉SDS（Sodium sulfate）、十二烷基苯磺酸鈉DBS (Dodecyl benzene sulfonate)、吐溫-60 等。分散劑：NNO、聚乙烯醇（PEG8000）、木質(zhì)素磺酸鈣。穩(wěn)定劑：磷酸氫二鉀（K2HPO4）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、海藻酸鈉、黃原膠、輕質(zhì)碳酸鈣、十二烷基苯磺酸鈉（DBS）。紫外保護(hù)劑：糊精、抗壞血酸VC（Vitamin C）、海藻酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉（DBS）。文中涉及所有載體和助劑均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 種子液制備

將培養(yǎng)好的解淀粉芽胞桿菌SH-1471 菌株用接種針劃線培養(yǎng)接種于NA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，獲得單菌落。挑取單菌落接種于裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃、200 r/min（本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化所得）振蕩培養(yǎng)24 h，得到種子液。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

取貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 菌株種子液，以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d，得到菌株發(fā)酵液。

1.4 可濕性粉劑載體和助劑的篩選

1.4.1 可濕性粉劑載體篩選及母粉制備 載體吸附能力測(cè)定：分別取無菌供試載體100 g 置于三角瓶，將SH-1471 菌株發(fā)酵液緩慢倒入三角瓶中，玻璃棒同時(shí)攪拌至載體呈流動(dòng)狀且不結(jié)塊、不溢水，記錄所倒入發(fā)酵液的體積V，并計(jì)算載體最大吸附量：H=V/0.1（Kg/L）。潤濕時(shí)間和懸浮率測(cè)定：將菌株發(fā)酵液與各載體均勻混合，經(jīng)進(jìn)風(fēng)溫度175 ℃，出風(fēng)溫度60 ℃進(jìn)行噴霧干燥后制成母粉，并參照1.4.4 中質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法，分別測(cè)定潤濕時(shí)間、懸浮率。最綜合考慮潤濕時(shí)間、懸浮率、吸附容量以及成本等擇優(yōu)選擇載體類型。

1.4.2 可濕性粉劑助劑篩選 潤濕劑和分散劑篩選：將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉分別與待選潤濕劑（12%）和分散劑（12%）經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，參照1.4.4 中質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法測(cè)定潤濕時(shí)間和懸浮率，并測(cè)定胞子萌發(fā)率，結(jié)合潤濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率選擇最佳潤濕劑和分散劑。

潤濕劑和分散劑最佳質(zhì)量配比篩選：結(jié)合潤濕時(shí)間和懸浮率分別挑選出潤濕劑和分散劑，以潤濕劑與分散劑：1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1 的含量與貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，混合均勻后加工制成可濕性粉劑，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，測(cè)定潤濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率，結(jié)合潤濕時(shí)間和懸浮率以及胞子萌發(fā)率選擇最佳配比。

潤濕劑和分散劑總用量對(duì)可濕性粉劑性能的影響：將篩選所得濕潤劑和分散劑經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混勻，按上述比例均勻混合后過325 目篩，分別以2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的用量與貝萊斯芽胞桿菌母粉均勻混合，測(cè)定潤濕時(shí)間、懸浮率和胞子萌發(fā)率。綜合考慮制劑潤濕性、懸浮率以及胞子萌發(fā)率，篩選出濕潤劑和分散劑的最佳用量。

穩(wěn)定劑篩選：將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉與潤濕劑、分散劑及待選穩(wěn)定劑（1%、2%、3%）經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑，以不加穩(wěn)定劑為對(duì)照每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)；采用《農(nóng)藥可濕性粉劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范》（GB/T 19136-2003）中的試驗(yàn)方法進(jìn)行加速貯藏穩(wěn)定性測(cè)定：熱貯（54±2）℃，14 d 后測(cè)定芽胞含量的變化，計(jì)算芽胞損失率（%）=（儲(chǔ)藏前芽胞含量－儲(chǔ)藏后芽胞含量）/儲(chǔ)藏前芽胞含量×100。

紫外保護(hù)劑篩選：將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 母粉與已篩選所得的潤濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑及待篩選紫外保護(hù)劑（0.5%、1.0%、1.5%）經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎混合均勻后加工制成可濕性粉劑，以不加保護(hù)劑為對(duì)照，稀釋涂布在平板上，在254 nm 紫外燈（20W）距離40 cm 處照射12、24 h 后，計(jì)算芽胞存活率，篩選出最佳紫外保護(hù)劑。

1.4.3 可濕性粉劑研制 將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 發(fā)酵液與粉碎后的1.2.3 中篩選所得載體、潤濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑等按優(yōu)化后的配比同時(shí)混合，邊攪拌邊進(jìn)行噴霧干燥制成可濕性粉劑。

1.4.4 可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)硬水的配制：稱取無水氯化鈣0.304 g，帶結(jié)晶水的氯化鎂0.139 g，放入1000 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解、稀釋至刻度。

（1）含孢量測(cè)定：參考《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 2293.1-2012）進(jìn)行含孢量測(cè)定。

（2）懸浮率測(cè)定：參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定》（GB/T 14825-2006）為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。

（3）潤濕時(shí)間測(cè)定：參考《可濕性粉劑潤濕性的測(cè)定》（GB/T 5451-2001）為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。

（4）細(xì)度測(cè)定：參考《農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定》（GB/T 16150-1995）為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。

（5）含水率測(cè)定：參考《農(nóng)藥水分測(cè)定》（GB/T 1600-2001）為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。

（6）pH 測(cè)定方法：參考《農(nóng)藥pH 值的測(cè)定》（GB/T 1601-1993）為本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)。

（7）雜菌率測(cè)定：將可濕性粉劑樣品梯度稀釋后，分別涂布在NA 和PDA 培養(yǎng)基上，在PDA 平板上檢測(cè)真菌雜菌數(shù)，在NA 平板上檢測(cè)細(xì)菌雜菌數(shù)，細(xì)菌與真菌總和所占總比例為雜菌率。

1.4.5 制劑穩(wěn)定性的測(cè)定 稱取一定量的貝萊斯芽胞桿菌WP 分別在低溫（4 ℃±2 ℃）條件下以及室溫（25 ℃）下連續(xù)貯存180 d，并每10 d 使用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)并計(jì)算貝萊斯芽胞桿菌WP 的芽胞存活率。

番茄枯萎病發(fā)病情況調(diào)查分組標(biāo)準(zhǔn)如下：0：無癥狀；1：一片或兩片葉子變黃；2：三片或者四片真葉變黃葉片萎蔫下垂；3：五片或六片真葉變黃或真葉萎蔫下垂；4：全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死。

病情指數(shù)=（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（總株數(shù)×最高級(jí)值）×100；

防效（%）=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析、多重比較及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較處理間的顯著性差異。選擇Excel 和SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以及采用Origin 2018 和GraphPad Prism 8 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體篩選

以吸附容量、潤濕時(shí)間和懸浮率為指標(biāo)進(jìn)行載體篩選結(jié)果如表1，7 種載體在吸附容量上具有顯著差異，其中白炭黑的吸附容量最高，為3.7 mL/g，其次為硅藻土、凹凸棒土和高嶺土，吸附容量分別為2.8、2.6 和1.9 mL/g；高嶺土的潤濕時(shí)間最短，為15.7 s，其次為硅藻土和白炭黑，分別為17.8 和18.4 s，凹凸棒土和膨潤土的潤濕時(shí)間最長(zhǎng)，分別為61.6 和75.5 s；高嶺土和硅藻土的懸浮率最高，均超過70%，分別為79.5%和66.5%，故選擇高嶺土作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的載體。

表1 SH-1471 WP 載體篩選結(jié)果Table 1 Screening results of SH-1471 WP vector

2.2 潤濕劑和分散劑的篩選

將待選潤濕劑和分散劑以12%的含量與選定的載體、發(fā)酵液混合均勻，噴霧干燥制成可濕性粉劑，檢測(cè)其潤濕時(shí)間和懸浮率，結(jié)果如表2 所示，以潤濕時(shí)間為指標(biāo)，潤濕劑中木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉（DBS）、洗衣粉及羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的潤濕時(shí)間最短，依次為11.8、12.2、16.8 和17.8 s；分散劑中NNO、木質(zhì)素磺酸鈣及聚乙烯醇（PEG 8000）的潤濕時(shí)間最短，分別為13.1、15.6 和15.8 s；以懸浮率為指標(biāo)，NNO 的懸浮率最高，達(dá)90.9%，其次為木質(zhì)素磺酸鈉，達(dá)84.9%，再次為三聚磷酸鈉，達(dá)84.8%，十二烷基硫酸鈉（SDS）、拉開粉、木質(zhì)素磺酸鈣、皂角粉、洗衣粉和吐溫-60 的懸浮率均超過70%，以木質(zhì)素磺酸鈉和羧甲基纖維素鈉作為潤濕劑時(shí)，活菌數(shù)最高為2.79×109CFU/g，以NNO 為分散劑時(shí)，活菌數(shù)最高為2.58×109CFU/g。綜合潤濕時(shí)間、懸浮率和活菌數(shù)，選擇NNO 作為分散劑、木質(zhì)素磺酸鈉作為潤濕劑。

表2 SH-1471 WP 潤濕劑、分散劑篩選結(jié)果Table 2 Screening results of wetting agent and dispersant for SH-1471 WP

2.3 潤濕劑與分散劑配比篩選

由表3 可知，潤濕時(shí)間隨著潤濕劑木質(zhì)素磺酸鈉含量增多而降低，懸浮率隨著分散劑NNO 的含量降低而降低，其潤濕時(shí)間最高為12.3 s，已達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)木質(zhì)素纖維素鈉:NNO 為1:9 時(shí)，潤濕時(shí)間為12.3 s，懸浮率最高為88.6%，芽胞含量為2.73×109CFU/g；當(dāng)木質(zhì)素磺酸鈉:NNO 為2:8 時(shí)，潤濕時(shí)間為10.1 s，懸浮率為87.2%，芽胞含量為2.86×109CFU/g。結(jié)合潤濕時(shí)間、懸浮率及芽胞含量結(jié)果，故確定木質(zhì)素磺酸鈉:NNO 的比例為2:8。

科文學(xué)院擬將新教學(xué)樓北區(qū)3層及4層的8個(gè)多媒體教室的320臺(tái)電腦開通視頻點(diǎn)播系統(tǒng),以便學(xué)生點(diǎn)播優(yōu)秀的視頻課件．為此,在網(wǎng)絡(luò)中心增加1臺(tái)視頻服務(wù)器,并將其命名為Video Destination,通過6類雙絞線千兆連接到核心交換機(jī)CS6509上,利用OPNET Modeler提供的Video Conferencing業(yè)務(wù)進(jìn)行仿真．

表3 潤濕劑與分散劑最佳配比篩選結(jié)果Table 3 Screening results of optimum ratio of wetting agent and dispersant

2.4 潤濕劑和分散劑總用量的篩選

由表4 可知，隨著潤濕劑和分散劑總用量的增加，貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤濕時(shí)間逐漸變短，當(dāng)二者總用量?jī)H為2%時(shí)，制劑潤濕時(shí)間為21.6 s，顯著高于其他用量，當(dāng)二者總用量為12%時(shí)，潤濕時(shí)間最短為10.1 s；說明增加潤濕劑和分散劑總用量對(duì)貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤濕時(shí)間的變短具有促進(jìn)作用；且隨著潤濕劑和分散劑總用量的增加，其懸浮率具有明顯的提高，當(dāng)用量為2%時(shí)，懸浮率僅為51.4%，當(dāng)用量提高至18%時(shí)，懸浮率達(dá)89.9%，表明增加潤濕劑和分散劑總用量對(duì)其潤濕性和懸浮率均有促進(jìn)作用，但隨著潤濕劑和分散劑總用量的提高，制劑中芽胞存活率會(huì)有一定的損失，總用量為18%時(shí)，芽胞含量?jī)H為2.42×109CFU/g，相比低濃度具有一定的損失。結(jié)合潤濕時(shí)間、懸浮率以及芽胞存活率，本試驗(yàn)中選擇潤濕劑和分散劑總用量為10%，此時(shí)貝萊斯芽胞桿菌WP 的潤濕時(shí)間為10.3 s，懸浮率為88.6%，芽胞含量為2.92×109CFU/g。

表4 潤濕劑和分散劑總用量篩選結(jié)果Table 4 Screening results of total dosage of wetting agent and dispersant

2.5 穩(wěn)定劑篩選

結(jié)合表5 的試驗(yàn)結(jié)果可知，與CK1（不加穩(wěn)定劑，不熱儲(chǔ)）和CK2（不加穩(wěn)定劑，熱儲(chǔ)）相比，穩(wěn)定劑的添加，可降低高溫脅迫下的芽胞熱儲(chǔ)損失率，在（54±2）℃下儲(chǔ)存7 d 時(shí)，與CK2（不加穩(wěn)定劑，熱儲(chǔ)7 d）相比，加了穩(wěn)定劑后貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的芽胞損失率均降低，其中以穩(wěn)定劑2%黃原膠的保護(hù)效果最好，可將熱儲(chǔ)損失率降低至14.01%，當(dāng)（54±2）℃下儲(chǔ)存14 d 時(shí)，在添加2%黃原膠作為保護(hù)劑，可使熱儲(chǔ)損失率降低至30.74%。結(jié)合生物相容性和熱儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇黃原膠2%作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的穩(wěn)定劑。

表5 SH-1471 WP 穩(wěn)定劑篩選結(jié)果Table 5 Screening results of SH-1471 WP stabilizer

2.6 紫外保護(hù)劑篩選

由表6 可知，與CK1（不加紫外保護(hù)劑，不照射）和CK2（不加紫外保護(hù)劑，照射）相比，紫外保護(hù)劑的添加，可降低紫外脅迫下的芽胞存活率，當(dāng)添加1%的紫外保護(hù)劑，在254 nm 紫外燈（20W）距離40 cm處照射12、24 h 后，以1%抗壞血酸（VC）為紫外保護(hù)劑時(shí)的存活率最高，照射12 h 時(shí)存活率為71.43%，照射24 h 時(shí)存活率為59.52%，其次為糊精（1%）和海藻酸鈉（1%），12 h 的存活率分別為65.31%和38.14%，24 h 的存活率分別為36.73%和4.24%。而十二烷基苯磺酸鈉（DBS）的存活率最低。結(jié)合紫外保護(hù)效果與生物相容性試驗(yàn)結(jié)果，選擇1%抗壞血酸（VC）作為貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑的紫外保護(hù)劑。

表6 SH-1471 WP 紫外保護(hù)劑篩選結(jié)果Table 6 Screening results of SH-1471 WP UV protectant

2.7 質(zhì)量檢測(cè)

將貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 發(fā)酵液與篩選所得并粉碎載體、潤濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑等按優(yōu)化后的配比同時(shí)混合，邊攪拌邊進(jìn)行噴霧干燥制得貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP。對(duì)貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如表7 所示，根據(jù)檢測(cè)測(cè)量值與質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值，貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 細(xì)度、潤濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH、活菌數(shù)以及雜菌率均符合質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值，可應(yīng)用于植物病害的生物防治。

表7 SH-1471 WP 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 7 SH-1471 WP quality test results

2.8 儲(chǔ)藏存活率檢測(cè)

貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑經(jīng)室溫4 ℃、25 ℃連續(xù)儲(chǔ)藏180 d，每10 d 測(cè)定依次芽胞存活率，測(cè)定結(jié)果如圖1 所示，貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑在4 ℃下，180 d 后芽胞存活為87.65%，而在室溫25 ℃下儲(chǔ)藏180 d 結(jié)果表明，其芽胞存活率為82.45%。該結(jié)果表明，低溫對(duì)菌株的存活率影響較小，而高溫對(duì)菌株的存活率有一定的影響。

圖1 SH-1471 WP 連續(xù)180 d 儲(chǔ)藏結(jié)果Fig.1 SH-1471 WP continuous 180 d storage results

2.9 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

室內(nèi)盆栽防效實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示，采用拌土+灌根、拌土和灌根三種方式評(píng)價(jià)貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 可濕性粉劑對(duì)番茄枯萎病的防治效果，與CK1（單接病原菌）相比，貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 灌根+拌土對(duì)番茄枯萎病的防效最好，發(fā)病率僅為4.2%，防治效果可達(dá)93.7%，防效顯著優(yōu)于3% 多抗霉素WP；其次為拌土，發(fā)病率僅為8.6%，防治效果為85.8%；灌根處理下發(fā)病率為9.2%，防治效果為83.3%。

表8 SH-1471 WP 盆栽防治效果Table 8 Potting control effect of SH-1471 WP

3 討論

可濕性粉劑是我國微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬?，在病蟲害綠色防控中發(fā)揮越來越大的作用，因其相比于液體制劑和其他固體制劑具有生產(chǎn)成本低，有效成分含量高，濕潤性好、易于運(yùn)輸和貯運(yùn)，且防病范圍更廣等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用[20]。其通常由載體、潤濕劑、懸浮劑、分散劑、穩(wěn)定劑以及保護(hù)劑等組成，并以有效成分含量、懸浮率、潤濕時(shí)間、干燥減量、細(xì)度以及pH 等作為質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)品研發(fā)以及工藝優(yōu)化[21]。

載體在可濕性粉劑中所占比例最大，探究載體與菌株之間的生物相容性是極其重要的。本研究發(fā)現(xiàn)，高嶺土和硅藻土與菌株的生物相容性最好，顯著高于白炭黑、滑石粉等。Chiou 等[22]則發(fā)現(xiàn)，以高嶺土為載體，可提高芽胞存活率。王劍等[23]和孫麗麗等[24]等[的研究結(jié)果與本研究相同，以硅藻土為載體時(shí)，制劑芽胞存活率較高。而陳茹等[25]研究則表明，當(dāng)使用硅藻土為WP 的載體時(shí)，其孢子萌發(fā)率會(huì)受到抑制。由此可知，盡管大部分載體為惰性材料，但不同菌株對(duì)同種載體的適應(yīng)能力不同，且同種載體對(duì)不同菌株的生物相容性亦存在差異。因此，菌株與載體的生物相容性測(cè)定尤為重要。

懸浮率和潤濕時(shí)間是評(píng)價(jià)農(nóng)藥可濕性粉劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響制劑的操作便利性和混合均一穩(wěn)定性[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素磺酸鈉可顯著縮短制劑的潤濕時(shí)間，僅為11.8 s，且不對(duì)菌株有抑制作用，而十二烷基苯磺酸鈉（DBS）的潤濕時(shí)間為12.2 s，且菌株孢子萌發(fā)率大幅下降，表明其對(duì)菌株具有一定的毒害作用。相同地，錢一鑫等[27]試驗(yàn)結(jié)果十二烷基苯磺酸鈉（DBS）可縮短制劑潤濕時(shí)間至11 s，但對(duì)菌株芽胞含量會(huì)造成一定的損失。本制劑在加入NNO 作為分散劑時(shí)，懸浮率得到顯著提高，達(dá)90.9%，顯著優(yōu)于張成等[28]的木霉菌TrichodermavirideT069 可濕性粉劑懸浮率（73.04%），以及且顯著優(yōu)于劉盼西等[29]的海洋芽胞桿菌B.marinus可濕性粉劑的懸浮率（73.13%）；基于此基礎(chǔ)，本研究還進(jìn)行了潤濕劑與分散劑的比例優(yōu)化和總用量?jī)?yōu)化，最終確定總用量為10%，比例為2:8 時(shí)，以此制劑潤濕時(shí)間最短，懸浮率最佳，且芽胞含量最高。

穩(wěn)定劑有利于制劑芽胞含量在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)，紫外保護(hù)劑可減少自然條件下紫外線對(duì)芽胞造成的不利影響[30]。本研究結(jié)果表明，黃原膠（2%）可降低菌株在溫度（54±2）℃下儲(chǔ)藏的損失率，僅為14.01%，以羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí)，熱儲(chǔ)損失率高達(dá)49.38%。優(yōu)于李舒雯等[31]以羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí)的內(nèi)生短短芽胞桿菌B.endophytes可濕性粉劑的芽胞損失率（49%）。表明同一物質(zhì)對(duì)不同菌株的保護(hù)機(jī)制和保護(hù)效果不同，與張正一等[32]和張成等[28]的試驗(yàn)結(jié)果類似，本研究以抗壞血酸（VC）（1%）作為紫外保護(hù)劑時(shí)，可提高菌株在紫外照射下的存活率。貝萊斯芽胞桿菌SH-1471 WP 在25℃下儲(chǔ)藏180 d 后的存活率為82.45%，今后可進(jìn)一步對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化，以提高其在室溫條件下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及其環(huán)境適應(yīng)能力。此外，室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明本制劑可有效降低番茄枯萎病的發(fā)病率，防效達(dá)93.7%，防效高于3%多抗霉素。而羅嫚等[33]的研究表明，咪鮮胺和咯菌腈對(duì)番茄枯萎病的防治效果分別為52.5%、53.33%，表明貝萊斯芽胞桿菌WP 對(duì)番茄枯萎病具有良好的防治效果。

前期研究表明菌株SH-1471 還具有解磷、固氮等活性，可進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及提高作物抗逆性等方面的活性，并結(jié)合大田試驗(yàn)驗(yàn)證，探究和挖掘其生防、促生功能，以便發(fā)揮其在農(nóng)業(yè)病害防治和作物促生增產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值。