激活嘌呤回補(bǔ)途徑提高淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌豐加霉素產(chǎn)量

張子軒，宋 陽(yáng)，申屠旭萍，俞曉平

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

豐加霉素（Toyocamycin，TM）是鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物，作為核苷類抗生素家族中重要成員之一，具有高效性、低毒性和低殘留的特性，在農(nóng)業(yè)植物真菌病害的生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。1970年，Suhadolnik 利用同位素14C 和3H 喂養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一種新型的核糖類抗生素，其核糖C1 連接類似鳥(niǎo)嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，分子式為C12H13N5O4，命名為豐加霉素[1]。由于其對(duì)動(dòng)物病原菌如白假絲酵母Candidaalbicans，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，其生物活性研究報(bào)道主要集中在抗病原菌方面[2]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，TM 對(duì)多種植物疫病具有良好的防治效果。豐加霉素由淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，對(duì)水稻紋枯病菌、葡萄炭疽病菌和番茄灰霉病菌等7 種植物病原真菌具有良好的抑制作用[3]，也能夠抑制稻瘟致病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)[4]。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害生物防治領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，豐加霉素作為生防菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境更加友好[3]。

鏈霉菌屬Streptomyces是一種廣泛分布于土壤、海洋、極端條件等環(huán)境中的高等放線菌。鏈霉菌所能產(chǎn)生的天然次級(jí)代謝產(chǎn)物是世界上70%抗生素的來(lái)源。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌S.diastatochromogenes1628 最初是2006 年從土壤樣本中分離出來(lái)，經(jīng)進(jìn)一步提取分離研究表明，菌株1628 能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，包括豐加霉素和四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物（四霉素A、四霉素P 和四環(huán)素B）[5]。由于豐加霉素在生防領(lǐng)域的效果顯著，未來(lái)有可能應(yīng)用于植物病害防治，本研究將有助于推動(dòng)豐加霉素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物受到菌體內(nèi)多層次調(diào)控因子的調(diào)節(jié)作用，常規(guī)的結(jié)構(gòu)基因過(guò)量表達(dá)通常無(wú)法大量提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，因此需要對(duì)鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑進(jìn)行分析。前期研究發(fā)現(xiàn)合成TM 的前體物質(zhì)為GTP，而GTP 通常由嘌呤合成途徑和嘌呤回補(bǔ)途徑維持GTP 的穩(wěn)態(tài)[6,7]。嘌呤合成途徑為利用5-磷酸核糖（Ribose-5-P）通過(guò)核糖磷酸焦磷酸激酶（Ribose-phosphate pyrophosphokinase，Rpp）催化合成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），PRPP 在嘌呤操縱子作用下經(jīng)過(guò)次黃嘌呤（HPX）合成肌苷酸（IMP）（從HPX 到IMP 由HprT 催化），IMP 在GuaB、GuaA 催化下合成GMP，GMP 在Gmk 催化下合成GDP，GDP 在Ndk酶催化下磷酸化形成GTP[8]（圖1）。前期研究表明，過(guò)量表達(dá)GTP 合成途徑中的rpp基因能夠提高胞內(nèi)GTP 含量122%，豐加霉素產(chǎn)量提高133.3%，產(chǎn)量達(dá)到340.2 mg/L[9]。但由于在生長(zhǎng)穩(wěn)定期存在嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)抑制GTP 合成途徑以及激活嘌呤回補(bǔ)途徑的作用。因此，本研究從維持嘌呤穩(wěn)態(tài)的嘌呤回補(bǔ)途徑入手，提高TM 產(chǎn)量。

圖1 GTP 合成途徑與回補(bǔ)途徑Fig.1 The synthesis and salvage pathway of GTP

嘌呤回補(bǔ)途徑（purine salvage pathway）指的是菌體利用外源或者內(nèi)源細(xì)胞更新產(chǎn)生的嘌呤（堿基或核苷）轉(zhuǎn)化為核苷酸，核苷被轉(zhuǎn)化為堿基[10]。例如，外源鳥(niǎo)苷被降解為鳥(niǎo)嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)（也可以不通過(guò)）黃嘌呤途徑合成GMP。外源或內(nèi)源代謝產(chǎn)生的腺苷通過(guò)腺嘌呤或者肌苷合成次黃嘌呤，次黃嘌呤HPX合成肌苷酸IMP，兩條途徑均可以實(shí)現(xiàn)嘌呤回補(bǔ)[8]（圖1）。而對(duì)于黃嘌呤與次黃嘌呤之間的轉(zhuǎn)變過(guò)程，受到黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，xdh）基因簇的催化。因此，xdh基因簇是實(shí)現(xiàn)嘌呤回補(bǔ)途徑的重要環(huán)節(jié)，也是合成GTP，維持細(xì)胞內(nèi)GTP 穩(wěn)態(tài)的重要步驟。xdh基因簇由3 個(gè)基因（xdhA、xdhB、xdhC）組成，共同受到XdhR 蛋白的阻遏調(diào)節(jié)，在嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，較高濃度的ppGpp 與XdhR 基因結(jié)合，激活嘌呤回補(bǔ)途徑[8]。另一方面，有研究表明，XdhR 也是次級(jí)代謝基因簇表達(dá)的抑制性調(diào)控因子，能夠結(jié)合到次級(jí)代謝基因簇的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成[11]。但是xdhR基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中的基因功能尚未明確，需要通過(guò)敲除xdhR基因來(lái)研究xdhR 對(duì)豐加霉素合成的影響。

本研究旨在闡明xdhR基因的序列特征、在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 中對(duì)于形態(tài)分化的影響，以及xdhR基因與TM 生物合成中的相關(guān)性。同時(shí)，也考察敲除xdhR基因后對(duì)嘌呤合成途徑基因轉(zhuǎn)錄、胞內(nèi)GTP 含量的影響，進(jìn)一步揭示xdhR基因?qū)ωS加霉素合成的重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 研究所用的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌S.diastatochromogenes1628 菌株是由浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌E.coliJM109，質(zhì)粒pKC1139 是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，用于構(gòu)建敲除突變株（均由本實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，10 g NaCl，5 g 酵母提取物，1 L 超純水，pH 調(diào)至7.4；葡萄糖酵母礦物質(zhì)（Glucose yeast extract mineral，GYM）培養(yǎng)基：10 g 麥芽提取物，4 g 葡萄糖，4 g 酵母提取物，2 g NaCl，1 g 酶解酪蛋白，600 μL OB 溶液（5 g CuSO4·5H2O，7.5 g FeSO4·7H2O，5 g MgSO4·7H2O，3.6 g MnSO4·7H2O，9 g ZnSO4·7H2O，35 g CuCl2·2H2O，1 L 超純水），1 L 超純水，pH 調(diào)至7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂，1 L 超純水，pH 調(diào)至7.0；MS 培養(yǎng)基：20 g 黃豆粉，20 g 甘露醇，18 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH 調(diào)至7.4。

1.1.3 引物 本試驗(yàn)所用引物如表1 所示

表1 本試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 RNA 的提取 挑取菌株1628 培養(yǎng)平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，搖勻菌液，以2%接種量接至新液體GYM 培養(yǎng)基于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)至4 d，每隔24 h 取50 mL 菌液，4 ℃、7000 r/min 離心5 min，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS，20 mmol/L，pH 7.4）清洗菌體2 次，最后棄去PBS 上清，將菌體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌濾紙吸凈水分，挑入研缽中使用液氮研磨至粉末狀，RNA 的提取按照TaKaRa 的RNA 提取試劑盒（No.9767）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2xdhR基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)同源重組的方法對(duì)xdhR基因進(jìn)行敲除。以菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 基因組DNA 為模板，通過(guò)XdhR Left for/ XdhR Left rev 和XdhR Right for/XdhR Right rev 分別擴(kuò)增xdhR基因上、下游同源臂并連接在pKC1139 質(zhì)粒上，構(gòu)建xdhR基因的敲除質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌JM109感受態(tài)，使用驗(yàn)證引物-for/rev 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，將顯示陽(yáng)性結(jié)果對(duì)應(yīng)菌落進(jìn)行擴(kuò)培，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證成功后為載體pKC1139-ΔXdhR。

1.2.3 敲除xdhR基因的菌株構(gòu)建 用熱激的方法將 pKC1139-ΔXdhR轉(zhuǎn)入E.coliET12567（pUZ8002）獲得結(jié)合轉(zhuǎn)移供體菌株E.coliET12567（pUZ8002/ΔXdhR），并通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取、酶切驗(yàn)證確認(rèn)供體菌正確。隨后在MS 平板上培養(yǎng)野生型菌株1628，收集孢子后，與大腸桿菌ET12567（pUZ8002/ΔXdhR）混合，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將敲除質(zhì)粒整合到菌株1628 基因組中，在含有安普霉素的MS 平板上覆蓋萘啶酮酸篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有安普霉素的平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，制備孢子懸液。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以每個(gè)平皿 104個(gè)孢子的濃度涂布在不含抗生素的GYM 培養(yǎng)基上42℃高溫培養(yǎng)。隨后挑取單菌落在無(wú)抗性GYM 培養(yǎng)基上28 ℃松弛培養(yǎng)，將生長(zhǎng)出來(lái)的菌落同時(shí)影印到GYM（Ap）和無(wú)抗GYM 培養(yǎng)基上，篩選發(fā)生雙交換（ApS）的xdhR基因阻斷突變株。隨機(jī)選擇10 株xdhR基因阻斷突變株接種于無(wú)任何選擇壓力的基本培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。并采用XdhR Left for/ XdhR Right rev 引物驗(yàn)證xdhR基因敲除成功。

1.2.4 菌株發(fā)酵及豐加霉素產(chǎn)量測(cè)定方法 分別挑取淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR培養(yǎng)平板的單菌落接種至液體GYM 培養(yǎng)基于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，以2%的接種量轉(zhuǎn)接至液體GYM培養(yǎng)基于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)10 d。每隔24 h 取1 mL 發(fā)酵液11000 r/min 離心10 min，取上清，使用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾于1.5 mL 的液相瓶中備用，采用HPLC 方法分析豐加霉素含量[12]。

流動(dòng)相A 為超純水，流動(dòng)相B 為色譜甲醇，用孔徑0.45 μm 的偏氟膜過(guò)濾色譜甲醇，用孔徑0.45 μm 的纖維膜過(guò)濾超純水，過(guò)濾后將流動(dòng)相瓶放置于超聲波清洗儀中超聲30 min，去除氣泡。色譜柱為C18 色譜柱，柱溫設(shè)置為30 ℃。洗脫方法見(jiàn)表2。

表2 HPLC 條件Table 2 HPLC conditions

1.2.5 SEM 電鏡分析 挑取鏈霉菌培養(yǎng)平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，用槍頭吸取菌絲體置于1.5 mL 離心管內(nèi)吸取量保證離心后沉淀于管底約為黃豆大小，室溫、2000 r/min 離心，棄掉上清。用PBS 洗菌體1～2 次，棄掉上清，沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的電鏡固定液，放置于4 ℃保存，固定12 h 以上寄送樣品送公司進(jìn)行SEM 電鏡拍照。

1.2.6 RT-qPCR 方法 以S.diastatochromogenes1628 的gyrB基因作為內(nèi)參基因，以豐加霉素生物合成關(guān)鍵基toyB、toyC、toyD、toyE、toyF、toyG、toyI、toyM和嘌呤合成途徑關(guān)鍵基因guaA，gmK，ndk為目的基因分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物。分別收集淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR培養(yǎng)4 d 的菌體，提取總RNA 取1 μg 反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 分析。熒光定量PCR程序設(shè)置如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因做3 個(gè)重復(fù)，使用TaKaRa熒光定量PCR 試劑盒（No.RR071A）配制反應(yīng)體系。

1.2.7 GTP 含量測(cè)定方法 挑取鏈霉菌培養(yǎng)平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，以2%接種量接至新液體GYM 培養(yǎng)基于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)至所需生長(zhǎng)期，取50 mL 菌液，4 ℃、7000 r/min 離心5 min，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗菌體2 次后液氮研磨至粉末狀，將破碎后的菌體100 mg 浸泡在3 mL 2 mol/L 甲酸中，并在冰水中孵育30 min。將醋酸銨（50 mol/L，pH 4.5）加入到粉碎的組織中至體積為6 mL，并在4 ℃、5000 r/min 離心5 min 后收集上清液。

固相萃?。⊿PE）過(guò)程根據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行，用1 mL 甲醇和1 mL 50 mmol/L 醋酸銨（pH 4.5）對(duì)SPE 柱進(jìn)行預(yù)處理后，將上述樣品溶液裝載到SPE 柱上。用1 mL 50 mmol/L 醋酸銨（pH 4.5）清洗SPE 柱，用1 mL 甲醇洗滌SPE 柱，用1 mL MeOH:H2O:NH4OH（20:70:10）溶液從SPE 柱上洗脫核苷酸。4 ℃冷凍干燥后，溶解于200 μL 水中，使用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，采用文獻(xiàn)中相同的方法[13]利用LC-MS 法測(cè)定GTP 含量。

1.2.8 抑菌活性測(cè)定 將鏈霉菌接種于GYM 培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)4 d，離心收集上清發(fā)酵液將發(fā)酵液稀釋6 個(gè)梯度（稀釋后發(fā)酵上清液濃度分別為0%，20%，40%，60%，80%，100%），后取100 μL涂布于PDA 培養(yǎng)基上。將水稻紋枯和黃瓜枯萎病菌接種于PDA 培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，分別利用打孔器獲得5 mm 菌片，將菌片放置于涂布有不同濃度發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)平皿中心，每組設(shè)置3 組平行重復(fù)，取平均值計(jì)算抑制率，對(duì)照組為無(wú)菌水處理。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列對(duì)比和進(jìn)化樹(shù)分析

在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中，xdhA、xdhB、xdhC基因在基因組中順序排列，受到位于上游的XdhR 調(diào)控因子的調(diào)控作用。xdhA編碼一個(gè)2Fe-2S 的結(jié)構(gòu)域、xdhB編碼一個(gè)FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，xdhC編碼一個(gè)鉬結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這三個(gè)結(jié)構(gòu)域共同組成一個(gè)含鉬氧化還原酶[8]。在xdhR與xdhA的起始密碼子中間，存在兩個(gè)方向的啟動(dòng)子，也存在著XdhR 蛋白的結(jié)合序列。同時(shí)，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這段基因間序列存在2 個(gè)不完美的回文序列，與天藍(lán)色鏈霉菌內(nèi)的xdh基因簇的基因排布一致，并且存在重疊的-35 區(qū)，這些位點(diǎn)可能是XdhR 的結(jié)合位點(diǎn)。

通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌xdhR序列與來(lái)自蟻鏈霉菌Streptomycesformicae菌株的xdhR氨基酸比較相近，與唐德鏈霉菌Streptomycestendae菌株的xdhR氨基酸序列相似度較低。與模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyceslividans的序列相似度為61.9%，因此，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的xdhR基因具有與S.lividans中xdhR相似功能（圖2）。

圖2 xdhR 基因的進(jìn)化樹(shù)分析及序列分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis and sequence analysis of xdhR gene

隨后，對(duì)XdhR 的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析。XdhR 是TetR 家族的調(diào)控因子，該家族的調(diào)控因子具有保守的helix-turn-helix 結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合DNA 分子。在TetR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的C 端或者N 端，通常是各種各樣的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，用于響應(yīng)不同的配體分子。盡管TetR 家族的分子并沒(méi)有特定的保守序列，但是通過(guò)Swiss-model 構(gòu)建出的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌XdhR 的三維立體結(jié)構(gòu)表明（以2rek 為模板），結(jié)構(gòu)上XdhR屬于? 型，符合TetR 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)特征[14]。說(shuō)明該TetR 家族的調(diào)節(jié)分子可能通過(guò)與配體結(jié)合后的變構(gòu)作用實(shí)現(xiàn)DNA 結(jié)合的功能。目前已知的XdhR 的配體為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)信號(hào)分子ppGpp，因此，在ppGpp激活次級(jí)代謝基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，會(huì)激活xdh基因簇的表達(dá)，進(jìn)而激活嘌呤回補(bǔ)途徑。

2.2 重組菌1628_ΔXdhR 的構(gòu)建及驗(yàn)證

采用同源雙交換方法進(jìn)行無(wú)縫基因敲除，連接敲除基因上下游同源臂于pKC1139 載體上構(gòu)建成敲除載體pKC1139-ΔXdhR，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將載體轉(zhuǎn)入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 中，隨后通過(guò)高溫誘導(dǎo)獲得單交換突變株，松弛培養(yǎng)后篩選出同時(shí)在無(wú)抗GYM 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不在GYM（Ap）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的同一菌落，隨機(jī)選擇10 株xdhR基因阻斷突變株接種于無(wú)任何選擇壓力的基本培養(yǎng)基上，28 ℃下擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性。用引物XdhR Left for/ XdhR Right rev 進(jìn)行驗(yàn)證，敲除成功后的結(jié)果長(zhǎng)度為4074bp（圖3），并通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)敲除基因正確。重組菌1628_ΔXdhR構(gòu)建成功。

圖3 1628_ΔXdhR 突變菌株的PCR 驗(yàn)證Fig.3 PCR result of recombinant 1628_ΔXdhR deletion mutant

2.3 激活嘌呤回補(bǔ)途徑對(duì)豐加霉素產(chǎn)量的影響

調(diào)控因子X(jué)dhR 是嘌呤回補(bǔ)途徑基因xdhA、xdhB、xdhC的轉(zhuǎn)錄抑制因子，所以敲除xdhR基因?qū)τ诩せ钹堰驶匮a(bǔ)途徑具有重要作用。本研究中采用同源重組的方式構(gòu)建xdhR基因的敲除菌株，測(cè)定重組菌1628_ΔxdhR菌株與淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 菌株的豐加霉素產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵至 96 h 時(shí)，重組菌1628_ΔxdhR中豐加霉素產(chǎn)量達(dá)到最高 287.8 mg/L，較淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 升高114.0%。該結(jié)果表明敲除基因xdhR對(duì)豐加霉素合成起促進(jìn)作用（圖4）。

圖4 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 的豐加霉素產(chǎn)素水平比較Fig.4 Comparison of toyocamycin production between amylase-producing S.diastatochromogenes 1628 and 1628_ΔXdhR

2.4 重組菌1628_ΔXdhR 和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 的菌落形態(tài)

通常，鏈霉菌的菌絲分化和形態(tài)學(xué)變化與次級(jí)代謝產(chǎn)物積累密切相關(guān)。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 的菌落呈白色正圓形（圖5a），中央隆起，表面弧度較為圓潤(rùn)，菌絲表面較為平整光滑。重組菌1628_ΔxdhR（圖5c）菌落較1628 原始菌菌更加粗糙。在SEM 電鏡照片中，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628（圖5b）菌絲較為光滑稀疏，重組菌1628_ΔxdhR（圖5d）菌絲較淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 菌絲更加密一些，也附有更多一些絮狀物質(zhì)。說(shuō)明嘌呤代謝途徑變化，導(dǎo)致鏈霉菌菌絲形態(tài)發(fā)生變化。

圖5 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 菌落形態(tài)和電鏡照片F(xiàn)ig.5 Colony morphology and electron microscopic photos of S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR

2.5 敲除xdhR 基因?qū)ωS加霉素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

豐加霉素由豐加霉素合成基因簇合成，該基因簇主要受到全局調(diào)控因子adpA和途徑特異性調(diào)控因子toyA的調(diào)控作用，toyB、toyC、toyD、toyE、toyF、toyG、toyI、toyM是合成豐加霉素的途徑基因。因此，通過(guò)分析重組菌1628_ΔXdhR菌株與淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 的toy基因表達(dá)水平差異，可以解釋豐加霉素產(chǎn)量變化的原因。通過(guò)對(duì)重組菌1628_ΔXdhR菌株和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 在第四天進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)，adpA的轉(zhuǎn)錄水平提高4.27 倍，說(shuō)明XdhR 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子影響adpA基因的轉(zhuǎn)錄。而toy基因簇的途徑特異性調(diào)控因子toyA的轉(zhuǎn)錄水平提升1.47 倍，能夠激活toy基因簇結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。在結(jié)構(gòu)基因中，toyB、toyD、toyE的基因轉(zhuǎn)錄水平激活幅度較大，達(dá)到2.54 倍以上。而其他結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平激活在1.15～1.74 之間（圖6）。

圖6 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 的豐加霉素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Gene transcription level of toyocamycin biosynthesis pathway in S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628 _ΔXdhR

2.6 敲除xdhR 基因?qū)︵堰屎铣赏緩郊班堰驶匮a(bǔ)途徑基因表達(dá)的影響

重組菌1628_ΔxdhR菌株中嘌呤合成途徑基因guaA、gmK、ndk的轉(zhuǎn)錄水平變化，以及嘌呤回補(bǔ)途徑基因xdhA、xdhB、xdhC基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，表明1628_ΔxdhR對(duì)嘌呤代謝的總體影響。通過(guò)測(cè)定guaA,gmK和ndk基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，敲除xdhR微弱的抑制嘌呤合成途徑基因，guaA、gmK和ndk的轉(zhuǎn)錄水平分別降低12.9%、14.8%和24.4%（圖7A）。通過(guò)測(cè)定嘌呤回補(bǔ)途徑基因xdhA、xdhB和xdhC基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)敲除xdhR激活嘌呤回補(bǔ)途徑幅度較大，xdhA、xdhB和xdhC的轉(zhuǎn)錄水平提升154.4%、56.9%和102.7%（圖7A）。隨后測(cè)定胞內(nèi)GTP 含量來(lái)表征胞內(nèi)GTP 水平的變化發(fā)現(xiàn)，24～96 h 敲除菌的胞內(nèi)GTP 含量與野生菌株相比略有提升，但4 d 內(nèi)的GTP 含量不存在顯著差異，說(shuō)明敲除xdhR基因仍然能夠保持鏈霉菌內(nèi)的GTP 穩(wěn)態(tài)（圖7B）。

圖7 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 對(duì)嘌呤合成和回補(bǔ)途徑的影響Fig.7 The effect of xdhR gene on the purine biosynthesis and salvage pathway in S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR

2.7 重組菌1628_ΔXdhR 對(duì)植物病原菌的抑制效果的影響

對(duì)照組（淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628）與處理組（重組菌1628_ΔXdhR）100%的發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病致病菌菌絲的抑制率分別是48.9%和69.3%（圖8A）。而對(duì)于水稻紋枯病致病菌，重組菌1628_ΔXdhR發(fā)酵上清液的抑菌效果則更好，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR100%的發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病致病菌菌絲的抑制率分別是69.3%和100%（圖8B）。試驗(yàn)結(jié)果表明，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌重組菌1628_ΔXdhR發(fā)酵上清液對(duì)植物病原菌的生長(zhǎng)相較于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 有明顯提高。

圖8 不同含量淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病病菌和水稻紋枯病致病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of different concentration of fermentation broth of S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR on mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum and Rhizoctonia solani

3 討論

TetR 家族蛋白參與細(xì)胞的各種功能，包括多藥耐藥、抗生素的生物合成、建立致病性和調(diào)控代謝途徑[15,16]。它們通常作為阻遏物發(fā)揮作用，通過(guò)與特定配體結(jié)合到特定基因前調(diào)控基因表達(dá)[17,18]。本研究在構(gòu)建敲除xdhR基因菌株時(shí)也觀察到TM 產(chǎn)量的提高，說(shuō)明xdhR基因?qū)τ赥M 的產(chǎn)量具有負(fù)調(diào)控作用。在天藍(lán)色鏈霉菌中也有類似現(xiàn)象，在敲除xdhR基因后放線紅素的合成提高2.5 倍[11]。通過(guò)電鏡照片對(duì)比可知，xdhR基因不僅對(duì)于TM 的產(chǎn)量有調(diào)控作用，對(duì)于菌落形態(tài)分化也有著調(diào)控作用，使得菌落不再光滑，菌絲變得更密和更粗糙。

XdhR 存在于嘌呤合成與回補(bǔ)途徑中，所以敲除xdhR基因后，導(dǎo)致嘌呤合成與回補(bǔ)途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，其中嘌呤合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平略有抑制，而嘌呤回補(bǔ)途徑基因xdhA、xdhB和xdhC大量表達(dá)，進(jìn)一步分析胞內(nèi)GTP 水平發(fā)現(xiàn)GTP 含量略有提高，然而，胞內(nèi)GTP 含量在野生型菌株和xdhR敲除菌株中不具備顯著性差異，說(shuō)明鏈霉菌中存在其他調(diào)控途徑來(lái)維持GTP 的穩(wěn)態(tài)。例如，IMP 脫氫酶（IMP dehydrogenase）能夠與ATP、GTP 和ppGpp 結(jié)合來(lái)改變自身催化活性[19]，發(fā)酵后期胞內(nèi)ppGpp 積累導(dǎo)致GTP 被利用[10]等。同時(shí)，GTP 含量的大幅度改變也會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)速度減慢甚至死亡[20]。所以對(duì)于核苷類抗生素來(lái)說(shuō)，提高其前體供應(yīng)（如ATP 和GTP 等核苷類底物）仍然是比較困難的任務(wù)。另一方面，結(jié)合GTP 穩(wěn)態(tài)以及更高的豐加霉素產(chǎn)量來(lái)說(shuō)，XdhR 對(duì)豐加霉素的激活機(jī)制不是通過(guò)提高豐霉素前體GTP供應(yīng)而激活，而更有可能的是XdhR 直接對(duì)豐加霉素合成基因簇轉(zhuǎn)錄的激活，類似現(xiàn)象在天藍(lán)色鏈霉菌M145 中已有發(fā)現(xiàn)[11]。

長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于植物病害的防治都很大程度依賴于化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥的使用會(huì)帶來(lái)大量的環(huán)境污染和生態(tài)破壞等負(fù)面影響[21]。生物防治在環(huán)境保護(hù)和綠色健康方面的優(yōu)越性很大程度上高于化學(xué)防治，因此應(yīng)用生物防治和生物抗菌已迫在眉睫。豐加霉素作為一種具有巨大應(yīng)用潛力的農(nóng)用抗生素，本課題組前期發(fā)現(xiàn)豐加霉素可以拮抗黃瓜立枯絲核菌，防止黃瓜立枯病[22]。豐加霉素在其他生防菌株中也發(fā)揮抑菌作用，如在抗真菌農(nóng)藥農(nóng)抗120 的產(chǎn)生菌S.hygrospinosusvar.beijingensis的次級(jí)代謝產(chǎn)物中也鑒定到豐加霉素成分[23]。此外，關(guān)于農(nóng)抗120 的生防研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)自粉病、瓜果和蔬菜炭疽病、西瓜枯萎病以及水稻紋枯病其有顯著的防治效果，同時(shí)也有促進(jìn)植物增產(chǎn)的作用[24]。這些研究表明豐加霉素在植物防治中的重要地位。本研究中通過(guò)提高豐加霉素產(chǎn)量大幅度提高淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的生防效果，也為其他生防菌株改造和提高生防效果提供了可靠的理論依據(jù)。