螟黃赤眼蜂攜帶球孢白僵菌防治大豆食心蟲

趙 宇，劉 佳，路 楊，隋 麗，徐文靜，杜 茜，李啟云*，張正坤*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室，公主嶺 136100；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，長春 130033）

大豆食心蟲LeguminivoraglycinivorellaMatsumura 是大豆生產(chǎn)中的主要害蟲，不僅蛀入豆莢和豆粒，導(dǎo)致大豆產(chǎn)量下降，還能夠顯著影響大豆外觀和品質(zhì)，一般年份蟲食率在5%～10%，發(fā)生嚴(yán)重年份蟲食率高達(dá)30%～60%，給我國糧食生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。東北地區(qū)是國內(nèi)大豆的主產(chǎn)區(qū)，大豆種植面積和產(chǎn)量連年增加，大豆食心蟲的有效防治對保證大豆產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。通過化學(xué)殺蟲劑熏蒸和噴霧防治大豆食心蟲成蟲和蛀前幼蟲，取得了良好的防治效果[3]。但由于大豆作為主要蛋白質(zhì)和食用油來源，化學(xué)農(nóng)藥對食品安全具有不利影響，并且過量應(yīng)用會破壞生態(tài)環(huán)境。生物防治是化學(xué)防治的主要替代手段，在提高產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平，增強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品市場競爭方面發(fā)揮了重要作用[4]。

球孢白僵菌Beauveriabassiana和赤眼蜂Trichogramma是大豆食心蟲生物防治的重要技術(shù)[5]。球孢白僵菌能夠寄生大豆食心蟲幼蟲并形成僵蟲，其氣生孢子能夠繼續(xù)感染其他幼蟲，具有持續(xù)防控的作用。而赤眼蜂可寄生大豆食心蟲蟲卵，使幼蟲難以孵化，從而實現(xiàn)防治的目的[6]。但球孢白僵菌不能感染大豆食心蟲蟲卵，而大豆食心蟲孵化即鉆蛀，如果不及時用藥，防治效果較低；而赤眼蜂作為寄生蜂，不能寄生大豆食心蟲幼蟲，一旦錯過最佳放蜂時間或環(huán)境因素就會導(dǎo)致寄生率低，并且對害蟲幼蟲無法實現(xiàn)控制。

利用害蟲天敵如赤眼蜂攜帶球孢白僵菌實現(xiàn)“精確制導(dǎo)”防治亞洲玉米螟OstriniafurnacalisGuenée[7,8]和水稻二化螟ChilosuppressalisWalker[9]已被證明具有協(xié)同增效的防治效果，但利用赤眼蜂攜帶球孢白僵菌防治大豆食心蟲還未見報道。本研究擬篩選對大豆食心蟲具有高毒力的球孢白僵菌菌株，并利用螟黃赤眼蜂T.chilonis攜帶球孢白僵菌分生孢子，進(jìn)行大豆食心蟲的協(xié)同增效防控，以期在不增加防治成本的基礎(chǔ)上，提高防治效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2017 年9 月下旬在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所試驗地（124°82′27′′ E，43°50′45″ N）大豆食心蟲蛀莢嚴(yán)重植株下土壤中采集自然發(fā)生的大豆食心蟲僵蟲，分離并鑒定球孢白僵菌菌株，4 ℃保存在沙土管中備用。

1.1.2 供試赤眼蜂 供試螟黃赤眼蜂和赤眼蜂中間寄主柞蠶AntheraeapernyiGuerin-Meneville 卵由公主嶺吉農(nóng)綠色農(nóng)業(yè)高新科技發(fā)展有限公司飼養(yǎng)并提供。

1.1.3 供試?yán)ハx 供試?yán)ハx為2017 年秋季在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所試驗地采集的自然脫莢的大豆食心蟲老熟幼蟲，選取發(fā)育整齊一致的幼蟲用于球孢白僵菌高毒力菌株的篩選。

供試大豆食心蟲蟲卵獲取方法參考林英等[10]。2018 年8 月初大豆食心蟲雌蟲盛發(fā)期，每天15：00 于大豆試驗田網(wǎng)掃大豆食心蟲成蟲，將搜集的成蟲每20 頭接入備有清水保鮮的裝有5 個頂莢的大豆莖保濕的透明接蟲杯。將杯子放入溫度（26±1）℃、相對濕度（60±5）%、光周期14L:10D 的環(huán)境條件下，24 h 后去除成蟲，體視鏡下觀察計數(shù)，將著卵量達(dá)到約50 粒的豆莢重新水培并移入1 個新的透明接蟲杯用于寄生率測定。

1.1.4 供試大豆品種 大豆品種為矮桿耐密植大豆品種吉密豆3 號，中早熟，株高65 cm～75 cm[11]，由吉農(nóng)高新技術(shù)發(fā)展股份有限公司選育并提供。

1.2 球孢白僵菌菌種分離及鑒定

將從田間采集的大豆食心蟲幼蟲僵蟲浸泡在70%酒精水溶液（v/v），表面消毒處理30 s，無菌水清洗后的蟲體接種于PDA 培養(yǎng)基中，26 ℃暗培養(yǎng)。7～10 d 后待僵蟲四周長出真菌孢子后，進(jìn)行單孢分離并再次接種于PDA 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取與球孢白僵菌菌落生長形態(tài)相似的分離物分別進(jìn)行菌落、孢子及菌絲形態(tài)學(xué)觀察[12]。采用CTAB 法提取各分離物的基因組總DNA，采用真菌通用引物 ITS 1（5′-TCCGTAGGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS 4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行ITS 序列擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果送交吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定[13]。隨機(jī)選取8 個菌落生長速度較快且產(chǎn)孢量高的球孢白僵菌菌種，分別命名為BbLGNA1～8，在PDA 培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，獲得分生孢子進(jìn)行毒力測定。

1.3 對大豆食心蟲高毒力球孢白僵菌菌種篩選

球孢白僵菌菌株的毒力測定采用浸漬法[14]。將供試球孢白僵菌分離物的分生孢子分別配制成濃度為1×107個孢子/mL 的孢子懸液，將田間采集大豆食心蟲老熟幼蟲，浸泡在孢子懸浮液中約30 s，取出后用無菌濾紙吸干蟲體表面多余液體，然后移入放有無菌濾紙的1.5 mL 滅菌離心管中。以無菌水浸漬作為空白對照，26 ℃保濕培養(yǎng)，光周期12L:12D，每天觀察記錄幼蟲死亡情況，待幼蟲死亡90%以上時，計算致死中時間（LT50），作為毒力測定依據(jù)。每個球孢白僵菌分離物重復(fù)3 次，每個重復(fù)20 頭幼蟲。

1.4 助劑及球孢白僵菌對赤眼蜂出蜂量影響及載菌量的測定

參考楊芷等[8]的方法。分別配制無菌水（H2O）、0.1%（w/v）葡萄糖（Glu）、0.1%（w/v）淀粉（SS）、0.1%（w/v）馬鈴薯葡萄糖（PDS）和0.1%（v/v）吐溫-80（T-80）溶液，均勻噴霧于赤眼蜂寄生后的柞蠶卵表面使其潤濕即可，然后將柞蠶卵置于球孢白僵菌孢子粉（1×1011個孢子/g）中滾動使其均勻沾菌，同時設(shè)置不沾菌赤眼蜂寄生后的柞蠶卵為對照（Control）。將處理后的柞蠶卵放在培養(yǎng)皿中，封口膜封口，在（26±1）℃，RH（60±10）%，光周期14L:10D 的養(yǎng)蟲室內(nèi)培養(yǎng)，每個處理5 次重復(fù)，每次重復(fù)1 粒柞蠶卵。并且在24 h 后將培養(yǎng)皿放入-20 ℃冰箱，待各處理赤眼蜂全部死亡后，記錄赤眼蜂羽化數(shù)量。從每個重復(fù)中各取兩只蜂體分別放入1.5 mL 離心管中，加入100 μL 0.1%（v/v）吐溫-80 后振蕩混勻，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板觀察并統(tǒng)計孢子數(shù)量，計算每只赤眼蜂載菌量。

1.5 攜帶球孢白僵菌對赤眼蜂寄生率影響的測定

分別設(shè)置載菌赤眼蜂和非載菌赤眼蜂處理。每個處理3 個接蟲杯，每個接蟲杯中放置5 個豆莢，每個豆莢約50 粒蟲卵，每個接蟲杯釋放5 只羽化12 h 的充分交配的雌蜂。放蜂24 h 后，將帶有卵塊的豆莢移入新的接蟲杯，待孵出幼蟲后，統(tǒng)計寄生率。

赤眼蜂寄生率＝（卵塊卵粒數(shù)―幼蟲孵化數(shù)）/ 卵塊卵粒數(shù)×100%。

1.6 載菌赤眼蜂對大豆食心蟲田間防效

分別設(shè)置不防治對照、赤眼蜂處理及載菌赤眼蜂處理，每個處理1 hm2，間隔500 m。試驗于2019 年和2020 年在吉林省農(nóng)安縣億家農(nóng)村合作社（44°43′27″ N，125°18′48″ E）進(jìn)行。大豆壟寬63 cm，株距12 cm，播種為穴播，每穴1 株，每年6 月下旬施用底肥，施用量為尿素50 kg/hm2、磷酸二銨100 kg/hm2和氯化鉀50 kg/hm2，出苗后進(jìn)行人工除草等田間管理，不使用化學(xué)農(nóng)藥。將濕潤的柞蠶卵與球孢白僵菌分生孢子粉混合，每畝300 個被寄生柞蠶卵（寄生螟黃赤眼蜂數(shù)量約60～80 頭/卵）與0.7 g 利用液固兩相發(fā)酵培養(yǎng)的球孢白僵菌BbLGNA4 菌株高孢粉（1×1011個孢子/g）混合，90 r/min 搖動5 s，使柞蠶卵表面均勻吸附球孢白僵菌孢子粉，隨即放入放蜂球（專利號：ZL 201720555354.1），每個放蜂球100 卵。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，分別于2019 年8 月15 日和2020 年8 月17 日進(jìn)行第一次放蜂，間隔7 d 分別進(jìn)行第二次放蜂，每次放蜂約20 萬頭。放蜂時將該放蜂球均勻分散放置于田間地表背光處。9 月末大豆收獲前根據(jù)羅寶君[3]的方法，采取5 點取樣法進(jìn)行蟲食率調(diào)查，計算防治效果。

蟲食率＝（蟲食粒數(shù)/調(diào)查總粒數(shù)）×100%。

防治效果＝（空白對照蟲食率―防治田蟲食率）/空白對照蟲食率×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計及方差齊性檢測，并通過Duncan 氏方法進(jìn)行多重比較及顯著性分析，利用Graphpad 8.0.2 軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高毒力球孢白僵菌菌株篩選

從田間采集的大豆食心蟲幼蟲僵蟲體表分離蟲生真菌（圖1A），隨機(jī)選取菌落和孢子形態(tài)與球孢白僵菌相近的真菌菌落進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。在鑒定為球孢白僵菌的菌株中，選擇菌落生長速度較快的8 個菌株進(jìn)行生物學(xué)測定。結(jié)果表明，菌株BbLGNA1，BbLGNA4 和BbLGNA6 在1×107個孢子/mL 供試濃度下對大豆食心蟲老齡幼蟲的LT50顯著低于其他供試菌株，分別為（6.39±0.16）d，（6.21±0.11）d 和（6.87±0.13）d（圖1B）。后續(xù)試驗選擇菌株BbLGNA4 作為赤眼蜂載菌試驗的供試菌株。

圖1 球孢白僵菌對大豆食心蟲老齡幼蟲的高毒力菌株篩選Fig.1 Screening of high virulence strains of B.bassiana against soybean moth larvae

2.2 載菌赤眼蜂羽化量及載菌量

利用不同助劑進(jìn)行柞蠶卵附著后，調(diào)查24 h 羽化量，結(jié)果表明，所有處理及對照羽化量均在60～80 頭之間，且差異不顯著（P＞0.05）（圖2），表明助劑及球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂羽化無影響。羽化后的螟黃赤眼蜂單頭蜂載菌量結(jié)果表明，0.1%SS 溶液和0.1% Glu 溶液處理載菌量顯著高于其他處理和對照，均達(dá)到3.56×104個孢子/蜂以上（表1），在此基礎(chǔ)上，我們選擇0.1% SS 溶液作為載菌助劑進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 不同助劑處理柞蠶卵后螟黃赤眼蜂載菌量Table 1 Fungal conidia carrying amount of T.chilonis treated by different assistant

圖2 不同助劑和球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂羽化的影響Fig.2 Effects of different assistant and B.bassiana on emergence of T.chilonis

2.3 球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂寄生率的影響

利用SS 溶液作為載菌助劑處理柞蠶卵羽化的赤眼蜂載菌后，與對照相比，對大豆食心蟲卵的寄生率分別為（55.07±3.81）%和（56.80±4.00）%，且差異不顯著（F＝0.30，p＞0.05）。表明球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂寄生大豆食心蟲蟲卵無影響（圖3）。

圖3 球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂寄生率的影響Fig.3 Effect of B.bassiana on parasitic rate of T.chilonis

2.4 載菌赤眼蜂對大豆食心蟲田間防效

分別在2019 年和2020 年進(jìn)行螟黃赤眼蜂載球孢白僵菌防治大豆食心蟲的田間防治試驗。兩年試驗結(jié)果表明，赤眼蜂和載菌赤眼蜂對大豆食心蟲均有較好的防治效果。2019 年對照田蟲食率為（24.89±2.74）%，單獨使用赤眼蜂防治蟲食率為（10.30±1.96）%，而載菌赤眼蜂防治蟲食率為（7.36±0.98）%，各處理間差異顯著（F＝107.50，P＜0.05）（圖4A）；2020 年對照田蟲食率為（13.6±1.42）%，單獨使用赤眼蜂防治蟲食率為（5.92±0.78）%，而載菌赤眼蜂防治蟲食率為（4.79±0.88）%。其中，赤眼蜂單獨防治和載菌赤眼蜂防治，蟲食率顯著低于對照田（F＝101.12，P＜0.05），而前兩者之間差異不顯著（P＞0.05）（圖4B）。校正防效計算結(jié)果表明，2019 年單獨使用赤眼蜂防治效果為58.64%，而載菌赤眼蜂防治效果為70.44%，較單一使用赤眼蜂防治提高11.80%；2020 年單獨使用赤眼蜂防治效果為56.44%，而載菌赤眼蜂防治效果為64.75%，較單一使用赤眼蜂防治提高8.31%。

圖4 赤眼蜂和載菌赤眼蜂防治大豆食心蟲田間試驗的蟲食率Fig.4 Insect mouth-eaten rate of T.chilonis and T.chilonis carrying B.bassiana in field experiment on controlling soybean moth

3 討論

球孢白僵菌和赤眼蜂是鱗翅目害蟲生物防治的兩種重要手段。球孢白僵菌是一類廣譜性昆蟲病原真菌，具有環(huán)境友好、容易大量制備等諸多優(yōu)點，防治鱗翅目害蟲是以幼蟲期為主[15,16]；而赤眼蜂通過觸角上的嗅覺器官主動尋找寄主，并產(chǎn)卵于寄主卵內(nèi)，幼蟲取食卵黃引起寄主死亡，主要防治鱗翅目害蟲卵期[17,18]。將二者聯(lián)合應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)大豆食心蟲卵期和幼蟲期的雙重防控。但大豆食心蟲孵化后很快鉆蛀[19]，這對赤眼蜂放蜂時間和白僵菌應(yīng)用時間都提出了很高的要求，并且分別應(yīng)用該兩種技術(shù)，會導(dǎo)致材料成本和勞動成本的提高。楊芷等[23]利用松毛蟲赤眼蜂攜帶球孢白僵菌進(jìn)行亞洲玉米螟的防治，載菌赤眼蜂較單一使用赤眼蜂防效在被害株數(shù)、蛀孔數(shù)和活蟲數(shù)等防效指標(biāo)上分別提高了28.1%，22.8%和24.5%。Wang 等[9]證明稻螟赤眼蜂T.japonicum不僅成功將球孢白僵菌帶到水稻二化螟為害處起到協(xié)同增效作用，同時球孢白僵菌對稻螟赤眼蜂并無明顯不利影響，反而一定程度上促進(jìn)其發(fā)育。本研究中，經(jīng)過兩年田間試驗，螟黃赤眼蜂攜帶球孢白僵菌對大豆食心蟲防治效果分別提高了11.80%和8.31%，表明利用螟黃赤眼蜂攜帶高毒力球孢白僵菌，較單一使用赤眼蜂顯著提高防治效果，在實現(xiàn)協(xié)同增效的同時，不增加材料成本和勞動成本。

球孢白僵菌是一種蟲生真菌，并且赤眼蜂對生物脅迫和非生物脅迫較為敏感，明確球孢白僵菌對赤眼蜂羽化和寄生的影響非常必要[20]。孫光芝等[21]的研究表明赤眼蜂載菌以后，白僵菌對赤眼蜂羽化率無明顯影響，也不影響赤眼蜂對玉米螟卵的寄生。Potrich 等[22]的研究也證明白僵菌對赤眼蜂孵化率、雌雄比，以及寄生效果沒有影響，并且白僵菌不會干擾寄生雌蜂的壽命。楊芷等[23]也證明球孢白僵菌對松毛蟲赤眼蜂羽化、發(fā)育等無不良影響。本研究結(jié)果也表明，0.1% SS 和0.1% Glu 溶液對螟黃赤眼蜂羽化無影響，進(jìn)一步研究結(jié)果表明以SS 助劑進(jìn)行載菌對螟黃赤眼蜂寄生大豆食心蟲卵無顯著影響，并且載菌量也高于其他助劑，達(dá)到了3.56 萬個孢子/蜂。本實驗室前期[23]通過松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi可以攜帶綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）標(biāo)記的球孢白僵菌孢子至亞洲玉米螟卵表面，并實現(xiàn)對幼蟲的感染。徐慶豐等[24]研究表明，2944 個球孢白僵菌孢子即可實現(xiàn)對大豆食心蟲幼蟲100%感染。因此，螟黃赤眼蜂可以將球孢白僵菌孢子攜帶至大豆食心蟲卵表面，從而感染未被赤眼蜂寄生而孵化的幼蟲。

赤眼蜂和球孢白僵菌對防治靶標(biāo)均具有一定的專一性，因此，選擇高效的蜂種和菌種是提高載菌赤眼蜂防效的必要條件。羅寶君[3]比較了松毛蟲赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂和螟黃赤眼蜂對大豆食心蟲的寄生和田間防治效果，證明螟黃赤眼蜂寄生率和防效優(yōu)于其他兩種赤眼蜂；程媛等[25]選用螟黃赤眼蜂和性誘劑聯(lián)合防治大豆食心蟲，其防治效果達(dá)到了66.08%；溫玄燁等[26]研究表明利用米蛾卵繁育的黏蟲赤眼蜂T.leucaniae對大豆食心蟲的寄生率和防效要優(yōu)于螟黃赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂。米蛾卵適用于單頭蜂寄生，柞蠶卵可以實現(xiàn)赤眼蜂大量寄生，而黏蟲赤眼蜂在應(yīng)用柞蠶卵作為中間寄主進(jìn)行繁育和田間應(yīng)用過程中，其寄生率和羽化率較低[27]，因此，我們選用寄生率和羽化率高的柞蠶卵作為中間寄主的螟黃赤眼蜂作為應(yīng)用蜂種。球孢白僵菌同樣具有寄主專化性，不同寄主來源的球孢白僵菌由于其遺傳分化導(dǎo)致了針對某一害蟲毒力的不同[28]，而即使來源于同一寄主的菌株在毒力上也表現(xiàn)一定差異[29]。李樂等[12]研究結(jié)果表明，來源于同一寄主的球孢白僵菌菌株毒力與生長速度呈正相關(guān)性。本研究中，我們從大豆食心蟲僵蟲分離到了球孢白僵菌分離物，并根據(jù)生長速度選取了8 個菌種進(jìn)行高毒力菌株篩選，獲得了3 個高毒力菌株，LT50分別為6.21 d，6.39 d 和6.87 d。陶淑霞等[30]從大豆食心蟲僵蟲分離到的球孢白僵菌菌株，篩選到了一株高毒力菌株，其LT50為6.54 d。因此，本研究篩選到的3 株高毒力菌株為將來大豆食心蟲田間防治提供了生防資源。

綜上，本研究篩選到了對大豆食心蟲具有高毒力的球孢白僵菌菌株，并證明球孢白僵菌對螟黃赤眼蜂羽化和寄生大豆食心蟲蟲卵無不利影響，通過高載菌量助劑篩選，創(chuàng)建了螟黃赤眼蜂攜帶球孢白僵菌協(xié)同增效田間防治大豆食心蟲技術(shù)體系，在不增加防治成本的前提下，提高了防治效果，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會意義。