基于絲素蛋白的水凝膠開發(fā)及應用研究進展*

毛婉一，劉奕辰，徐青清，葛健文，陳 浩，錢 穎，季 鵬

(泰州學院 醫(yī)藥與化學化工學院，江蘇 泰州 225300)

皮膚，作為最廣泛的與外界接觸的人體器官，包裹于身體表面，直接暴露在外界環(huán)境中，容易受到刮傷、碰撞或是更嚴重的傷害，從而形成傷口。受到創(chuàng)傷后皮膚會先自行修復，但傷口較嚴重時則需要一些傷口愈合藥物的輔助，加快傷口愈合，避免傷口長期愈合不了而導致發(fā)炎等，引起更嚴重的創(chuàng)傷。傷口愈合的生理過程主要包含四個重疊在一起的階段，分別為：止血、炎癥、增殖和組織重塑[1]。這四個階段是一個連續(xù)的整體，使用有效的傷口愈合藥物，不僅能加速傷口愈合的速度，還能避免二次感染。理想的傷口愈合藥物具有極佳的保濕性、抗細菌感染性、生物相容性和促進血管生成等優(yōu)異特點。

水凝膠是一種以水為分散介質的凝膠，具有很強的親水性和三維網狀結構。三維聚合物鏈交聯網絡的存在，使水凝膠可以在保持完整結構的同時迅速溶脹和吸收大量的水分[2]，為水分、藥物分子、營養(yǎng)物質等的傳輸提供了理想的環(huán)境。隨著新生物技術時代的到來，水凝膠的發(fā)展也進入了新的階段。水凝膠是傷口愈合藥物的理想載體，較高的含水量為傷口提供了極佳的愈合環(huán)境。

絲素蛋白(Silk fibroin，SF)作為目前已知的一種天然高分子材料，有著優(yōu)異的可加工性、生物相容性、可調節(jié)的生物降解性、提取成本低、安全性較高等特點，在紡織、服裝行業(yè)乃至醫(yī)用建材上都有著廣泛的應用。SF由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成，因其止血性能好、炎癥反應低、氣體滲透性好等，被廣泛用作皮膚修復生物材料。致密的網狀結構能有效防止細菌對傷口的感染，同時還能吸收傷口滲出液。良好的生物黏附性對傷口組織的再生、清創(chuàng)都有益。SF降解可控，極其有利于傷口細胞的修復，可有效降低材料耗損，且降解產物對皮膚組織的愈合作用顯著。此外，其柔韌性、緩釋性、透氣性以及透水性能都十分理想，能幫助細胞的黏附和增生，是一種極具發(fā)展前景的傷口愈合材料[3]。這些顯著的特點讓人們對于SF在傷口愈合方面的研究更加深入，同時開始探討SF與其他材料之間的聯系。利用SF制備高質量的水凝膠是目前材料學科的一個熱門課題。

1 絲素蛋白水凝膠的交聯方法

1.1 物理交聯法制備

物理交聯法制備SF水凝膠是在溫和的條件下，通過改變特定的物理因素，誘導SF分子由無規(guī)卷曲結構向β-折疊構象轉變，隨后通過進一步聚集形成具有三維網絡結構的凝膠。這種方法的優(yōu)勢是制備方法簡單可控，而且不需要任何的化學交聯劑[4]。常見的物理方法有超聲波技術、電場作用、使用有機溶劑等[5]，能有效制備SF水凝膠。

1)超聲波技術

超聲波技術制備水凝膠屬于一種簡便的、無需添加的物理交聯。超聲處理通過改變疏水水化作用引發(fā)β片層的形成，從而加速負責凝膠穩(wěn)定的物理交聯，在超聲波的幫助下，加速SF的分子間作用以誘導SF的結構變化，從而形成水凝膠[6]。透明質酸(hyaluronic acid，HA)大分子鏈在超聲處理過程中不能形成物理交聯，不發(fā)生凝膠化，因此凝膠化是由SF物理交聯控制的。Hu等通過超聲波作用實現了將SF水溶液凝膠化，并用于在沒有化學交聯的情況下捕獲混合的、未交聯的HA[7]，研究表明，超聲功率輸出、超聲時間和SF濃度的因素會調節(jié)水凝膠狀態(tài)。超聲波法相對于其他物理交聯法更加快速有效。

2)電場作用

電場誘導SF凝膠化是將電極浸入含有SF并通有25 V直流電源的水溶液中，高電壓導致SF溶液的溫度迅速升高，在電場作用下只需幾秒就在正極形成可見的凝膠。最后，膠束聚集體通過分子鏈之間的物理糾纏形成SF水凝膠網絡[8]。Liu等通過低壓電場，在新鮮的SF水溶液中獲得了纖維電凝膠[9]。原本SF纖維水凝膠很難形成，然而，通過CaCl2-乙醇-H2O溶解法獲得的SF水溶液暴露在直流電中。在低壓電場下，溶液開始在正極上凝膠化。在施加低電壓的幾分鐘內，溶液變得不透明，并且在正極周圍完全形成了電凝膠。經過檢驗，制得的SF纖維電凝膠具有更高的壓縮應力。研究發(fā)現只有在低電壓(3～24 V)、低質量分數(≤5.0%)和中性、堿性條件下，SF纖維電凝膠才容易形成。因此電場誘導絲蛋白水凝膠的形成對電壓、溶液濃度和酸堿條件有嚴格的要求。

3)有機溶劑

通過使用有機溶劑，同樣可以做到誘導SF凝膠化[10]。Naresh等使用甲醇誘導再生絲素蛋白(Regenerated silk fibroin，RSF)水凝膠的形成[11]，當加入甲醇后，RSF-水-甲醇體系表現為聚合物-溶劑-非溶劑三元體系，甲醇參與與水的質子交換，從而干擾水與RSF的相互作用，導致RSF脫溶，最終RSF從無序形態(tài)變?yōu)榱擞行虻慕Y晶形態(tài)。通過研究得出，乙醇、異丙醇、正丁醇等有機溶劑也有相似效果。其中，有機溶劑的多少是能否形成凝膠和成膠快慢的決定因素。

4)表面活性劑

表面活性劑如月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉和泊洛沙姆等可以與SF混合，以加速誘導SF溶液形成水凝膠。SF納米纖維由無規(guī)卷曲到β-片層形式構象的轉變主要依賴于表面活性劑固有性質，以及表面活性劑和SF分子在水溶液中的不同相互作用[12]。Wu等使用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)作為膠凝劑來加速SF凝膠，在低濃度下，SF鏈之間相互的疏水作用在締合中發(fā)揮主導功能，誘導凝膠化，并使凝膠時間縮短[13]。相反，在較高濃度下，膠束聚集體之間的靜電排斥力逐漸占主導地位，凝膠化受到阻礙，甚至無法發(fā)生凝膠。此項研究表明，表面活性劑的濃度是SF凝膠能否凝膠、凝膠速度快慢的關鍵。

綜上所述，這些物理交聯法通過促進SF分子之間的相互作用，加速β-片層結構的形成，從而加快SF凝膠化，而且實驗方法簡單、凝膠速度快、不需要任何化學交聯劑輔助。不過物理交聯法也存在缺陷：制備的水凝膠穩(wěn)定性比較差，通常較脆且機械性能較差。

1.2 化學交聯法制備

利用化學交聯方法制備的SF水凝膠具有更高的物理穩(wěn)定性和機械性能。當前應用于SF水凝膠制備的主要方法有光交聯方法、使用酶進行交聯制備等[14]。

1)光交聯法

光交聯法制備SF水凝膠的機理是由于光引發(fā)劑吸收能量后形成自由基，該自由基會進攻預聚物的活性基團，活性基團受到進攻后相互之間發(fā)生反應，引發(fā)相關的聚合物鏈之間的交聯，從而形成SF水凝膠。通過該反應機理可以發(fā)現光聚合制備需要有合適的光源，帶有活性基團的預聚物以及光引發(fā)劑。對于光源的選擇，大體可以分為紫外光以及可見光。目前，紫外光作為光源進行制備的報道很多。例如，Zhang等利用紫外光作為光源，制備了PEGDA/SF互穿網狀結構水凝膠，并通過改變SF在水凝膠中的含量，研究SF含量對于該水凝膠理化性質的影響[15]。研究表明，該光交聯法制備的水凝膠具有較好的生物相容性和力學性能，能夠作為生物醫(yī)學組織材料應用到相關醫(yī)學治療上。也有可見光作為光源的研究報道，如Whittaker等在可見光照射下，用釕作為催化劑，使SF分子上的酪氨酸被氧化并發(fā)生反應，形成了二酪氨酸交聯[16]。此方法制備的水凝膠在發(fā)生凝膠化的過程中用時更短，并具有良好的生物相容性，但該方法涉及到金屬釕，制備的水凝膠存在潛在毒性，還需要進一步完善相關研究。可見光的危害要小于紫外光，且效率更高，應用可見光作為光聚合的光源條件將是研究的一個重要方向。同樣的，也有應用其他光源(如LED藍光)作為能量來源的相關研究，并且證明可以克服RSF水凝膠生物活性、凝膠效率及凝膠強度三者難以兼具的問題[17]。應用光交聯制備SF水凝膠能夠控制反應進行，對材料整體或部分進行調控、在未來生物醫(yī)學應用上具有良好的前景。

2)酶

與上文提到的光交聯方法制備SF水凝膠相比，利用酶作為聚合物參與水凝膠的交聯制備有著更多的優(yōu)點。比如，酶參與會減少甚至不產生具有化學毒性的物質[18]。酶化學提供了優(yōu)異的凝膠速率的微調方法，能更好地控制產生的水凝膠性質，制得的SF水凝膠力學性能優(yōu)異，能夠作為生物材料應用到相關醫(yī)學治療中[19-20]。其中，學者Chirila等在有過氧化氫存在下，用辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)誘導SF的自交聯，制備了相應的SF水凝膠[21]，并且與物理交聯方法以及傳統(tǒng)化學交聯方法制得的水凝膠進行了比較。從化學背景和合成方法、物理和光學性能、酶降解以及作為細胞粘附和增殖底物的相容性等方面進行比較，得出：HRP誘導交聯能夠顯著縮短凝膠時間，增強水凝膠的彈性，并提高細胞相容性。制得的HRP/H2O2水凝膠將應用于人體眼部的組織工程中[22-26]，提高該工程材料的機械強度，使得相關手術的難度降低、安全性有所提高。通過酶交聯制備的水凝膠在相關生物工程上展示巨大潛力，我們還需要發(fā)現更多的像HRP這樣的酶物質，使其應用到人類相關生產生活中。

2 復合型絲素蛋白的制備和傷口愈合作用

前文已經提及了SF水凝膠作為傷口敷料的一些優(yōu)勢，其本身能夠吸收傷口的滲出物，保持潮濕的傷口環(huán)境，促進抗菌和止血，同時，獨特的粘接性能使其能夠進一步促進傷口的愈合。但是用于傷口愈合的理想SF水凝膠應該具有極佳的機械性能、生物相容性、抗細菌感染性、止血、低成本、安全性較高等[27]，單一的SF水凝膠顯然無法同時滿足如此多的要求。令人鼓舞的是，研究發(fā)現的復合型SF水凝膠的出現可有效解決。根據SF水凝膠原本的結構和尺寸，與其他優(yōu)異的材料整合、重塑，合成的新型復合型SF水凝膠被賦予其它一種或多種特征和性能，彌補了傳統(tǒng)SF水凝膠在傷口愈合方面的一些不足，加強了功能性，使其更加優(yōu)異和高效。

2.1 加載FGF1的肝素化絲素蛋白水凝膠

酸性成纖維細胞生長因子(FGF1)是一種重要的血管生成因子，可以與內皮細胞上的受體相結合，激活細胞內的信號傳導，發(fā)揮相應的作用，能夠影響細胞的分化和遷移等關鍵功能[28]。研究表明，FGF1可以促進傷口處組織細胞的增殖分化，加速傷口的愈合，是臨床上改善糖尿病皮膚潰瘍、愈合傷口的理想傷口敷料[29]。肝素屬于高度硫酸化的多糖，可以作為一種抗凝劑，將其附加在醫(yī)學材料表面上能夠形成肝素化涂層，不僅使原本的材料表現出良好的抗凝特性，還能夠增強血液的相容性。但肝素化材料的不足之處在于，其對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有一定的促進作用，即可促進細菌的繁殖，所以可能會伴隨有血流感染，進而危及生命[30]。He等嘗試將肝素共價固定在SF水凝膠表面，經過一系列的沖洗和滅菌后浸泡在重組FGF1上，形成新型的復合型水凝膠傷口敷料。根據傷口愈合劃痕實驗和細胞增殖實驗，對其安全性和傷口愈合效率進行實驗評估，發(fā)現其極可能成為理想的傷口敷料[31]。肝素附帶的細菌感染危機由于SF水凝膠本身所具有的抗菌作用得以解決，且SF水凝膠本身特殊的多孔結構有利于細胞的再生長和生物活性分子的運輸。研究還發(fā)現，肝素化的SF水凝膠可以維持FGF1在傷口的濃度，刺激傷口的愈合。一系列實驗表明，負載了FGF1的肝素化SF水凝膠能夠改善傷口愈合的情況，加快傷口愈合的速度，為未來的臨床治療提供了研究思路。

2.2 姜黃素絲素蛋白水凝膠

姜黃素是從姜黃根莖中提取的多酚成分，具有抗氧化和抗菌作用。其獨特的化學結構和藥理作用已經在許多慢性疾病的治療中展露效果，如關節(jié)炎、炎癥、神經性疾病等。更重要的是，其在臨床上已經被證實具有治療癌癥的作用，在乳腺癌[32]、肺癌[33]等癌癥中已經有了突破性進展。它對于腫瘤細胞的增殖起著抑制作用，可促進腫瘤細胞的凋亡。有研究人員提出，將姜黃素的抗炎和抗菌等特性附加在SF水凝膠上制成新型的復合型SF水凝膠。Zeynep等人嘗試利用一種新型的方法制備SF水凝膠，該制備過程稱為電凝膠化制備法[34]。在低壓直流電作用下，水性重組SF先形成溶膠最后變成水凝膠，他們在這一過程中加入了姜黃素溶液，成功形成了負載姜黃素的SF水凝膠。經過進一步的處理，這種復合水凝膠還被制成了一種3D水凝膠支架。這種水凝膠支架是一種小孔和高孔隙率結構，研究人員對其進行了評估，發(fā)現：因為姜黃素的存在，細菌無法粘附在傷口部位，并且細菌生物膜的形成遭到抑制，極大的改善了傷口的愈合環(huán)境。制成的水凝膠支架具有高分子多孔的海綿性質，對于血管生成細胞的浸潤作用、傷口血管的生成有著促進效果[35]。這種新型的復合型水凝膠制成的支架極大的促進了傷口愈合，生物相容性也很好，對正常細胞沒有副作用，有望成為理想的傷口愈合敷料。

2.3 CSMA/SFMA水凝膠

殼聚糖(Chitosan，CS)細胞親和性較差，但具有良好的止血作用與抗感染活性。SF是一種良好的增稠劑，能夠改善CS的細胞親和性，并增強其機械性能的穩(wěn)定性。研究發(fā)現，將甲基丙烯?；瘹ぞ厶?Chitosan Methacrylated，CSMA)與含抗生素的SF相結合制得的水凝膠，有加快傷口愈合效率的作用。He等在室溫下將CSMA溶解于去離子水中形成4%的CSMA溶液，將SFMA溶解于去離子水中形成20%的SFMA溶液[36]。將上述等量的兩份溶液混合后加入0.4%的苯基鋰(2，4，6-三甲基苯甲酰)亞磷酸鹽(LAP)在黑暗環(huán)境下攪拌至完全溶解，在紫外光下照射5 min直至形成水凝膠。最后，將形成的水凝膠浸入40 ℃下單寧酸中24 h，獲得單寧酸環(huán)境下增強的CSMA/SFMA水凝膠。就促進傷口愈合的水凝膠敷料而言，物理穩(wěn)定性十分重要。快速降解會導致水凝膠的機械性能降低，而緩慢降解則會導致水凝膠粘在傷口上，不易切除[37]。He等對CSMA/SFMA水凝膠進行了一個月內不同程度的降解性能評估，發(fā)現CSMA/SFMA水凝膠降解速率較低，表明該復合型SF水凝膠適用于傷口敷料[31]。隨后該實驗還通過對CSMA/SFMA水凝膠粘接性能、體外抗氧化性能、抗菌性能與細胞相容性等進行多重性評價，結果均表明CSMA/SFMA水凝膠對于傷口愈合具有良好的促進作用。

2.4 膽綠素/絲素蛋白水凝膠(BVSF)

膽綠素，血紅蛋白分解的副產物，是一種顏色呈深綠色的膽色素。近幾年來，膽綠素被證實具有抗炎特性、抗氧化性與較高的光熱效率[38]，能夠作為愈合傷口的生物活性藥物。膽紅素、膽綠素的生物轉化產物，也具有抗炎、抗氧化性與光吸收特性。Qing等人將膽紅素與β-環(huán)糊精相結合制得復合型生物粘附性水凝膠，但由于膽紅素的疏水性，其應用受到一定限制[39]。相較于疏水性的膽紅素，親水性的膽綠素更適合于水凝膠藥物的配制。根據Qing等人的制備方法[40]，將2%的SF溶解于去離子水中，再將膽綠素溶解于去離子水中制成不同濃度的溶液，在不斷攪拌下將膽綠素溶液滴加于SF溶液中，用異硫氰酸熒光素標記好的溶液在 100 W 的超聲波下進行凝膠化，制得膽綠素/SF水凝膠(BVSF)。在治療過程中發(fā)現，當炎癥因子過多時，過度炎癥反應將會抑制或延緩傷口愈合。通過對BVSF水凝膠的體內研究與病理實驗表明，BVSF水凝膠能夠附著于傷口處發(fā)揮抗炎作用。經過對BVSF水凝膠光熱特性與體外滯留時間等的相關結果研究，表明BVSF水凝膠具有刺激細胞增殖、加快傷口愈合的特性。

2.5 銀納米粒顆粒-蘆薈絲素蛋白復合水凝膠

銀納米顆粒(Silver nanoparticles，Ag-NPs)作為一種具有廣譜抗菌活性的替代品，應用前景廣泛[41]。但由于銀離子具有不安全性，它的遞送導致細胞毒性及其對聚集的敏感性功效喪失，使得臨床轉化受到阻礙。然而，研究發(fā)現，Ag-NPs水凝膠具有卓越的抗菌作用和促進傷口愈合特性，能夠減少傷口炎癥的產生。同時，蘆薈(Aloe vera，AV)作為一種藥用植物，一直被應用于抗菌、抗病毒等[42]。許多研究表明，AV因其較為簡單的成分和藥理活性在促進傷口愈合方面起著重要作用，已被用于預防和治療皮膚相關疾病[43]。使用傷口敷料是治療皮膚損害最有效的方法，可用SF以調節(jié)傷口愈合，但因其抗菌性和生物活性需要進一步提高，Liu等用Ag-NPs和AV為改性劑，制備了銀納米顆粒-蘆薈-SF復合水凝膠(Ag-AV-SF水凝膠)[44]。該研究表明，Ag-AV-SF水凝膠具有良好的物理性質、抗菌能力以及生物相容性，具有促進細胞增殖、遷移和傷口愈合的作用。因此，該凝膠在改善臨床治療中的傷口愈合方面具有巨大的潛力。

3 總結與展望

SF水凝膠的發(fā)展不再局限于SF與水凝膠的簡單結合應用，已經轉變成由多種復合材料制成的新型復合型SF水凝膠。由原本有限的傳統(tǒng)功能轉變?yōu)榕c其他生物材料相結合而帶來的創(chuàng)新型特性，為傷口的安全穩(wěn)定、快速愈合帶來了更多的可能。傷口的愈合是一個動態(tài)而復雜的過程，目前臨床傷口愈合面臨的主要問題是慢性傷口的治療。慢性傷口停滯在愈合的炎癥階段，組織中生長因子的減少，衰老細胞的增加，高水平的促炎細胞因子等問題抑制傷口的快速愈合，這些依舊是目前傷口管理所面臨的艱巨挑戰(zhàn)，每年需要花費大量的醫(yī)療保健資源。未來，用于傷口愈合的SF水凝膠應仍具有極佳的機械性能、抗細菌感染性、生物相容性、止血、低成本、易制備以及安全性較高等優(yōu)異特點，并在此基礎上持續(xù)加以改進，以提高其治療傷口的效果，SF水凝膠的進一步研究發(fā)展終需克服上述難題，在傳統(tǒng)SF水凝膠的基礎上開發(fā)出更多功能型SF水凝膠仍是重中之重。