超臨界流體色譜固定相的發(fā)展及在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用

宋春穎, 金高娃, 俞東萍, 夏東海, 豐 靜, 郭志謀*, 梁鑫淼

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 贛江中藥創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330000)

超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography, SFC)是為了擴寬高效液相色譜(HPLC)的應(yīng)用范圍而發(fā)展起來的一種綠色環(huán)保高效的柱色譜技術(shù)[1,2]。CO2是最常用流動相,可以與不同極性的有機溶劑混勻[3]。流動相兼容的特點決定了固定相種類的豐富性,幾乎液相色譜上所有的固定相都可以應(yīng)用在SFC上,有效拓寬了分析物的極性范圍[4-6],使得SFC在制藥、食品、環(huán)境以及天然產(chǎn)物等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[7]。其中天然產(chǎn)物的分離分析是科研領(lǐng)域有挑戰(zhàn)的方向之一,因為成分復(fù)雜且大多數(shù)含量甚微,需要更加優(yōu)異的色譜技術(shù)來解決分離和定量困難的問題。得益于儀器的進(jìn)步,SFC的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)[8,9],利用SFC分離天然產(chǎn)物的趨勢也在日益增加[10,11]。本文從超臨界流體的特殊性質(zhì)及SFC的發(fā)展過程等方面介紹了SFC的研究進(jìn)展,并綜述了SFC固定相在過去10年的發(fā)展以及在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用,以期增加科研人員對SFC的了解,促進(jìn)SFC的發(fā)展。

1 超臨界流體色譜

超臨界流體色譜是使用超過臨界溫度和臨界壓力的流體作為流動相進(jìn)行分析的一種色譜技術(shù)。SFC采用超臨界流體作為流動相,相對動力學(xué)性質(zhì)介于氣體和液體之間。擴散系數(shù)和黏度系數(shù)與氣體近似,密度與液體近似,因此SFC綜合了高溶解性和高擴散性的優(yōu)勢[2]。如圖1所示,從分離模式的角度分析,SFC與HPLC非常類似,流動相都發(fā)揮著重要作用,不僅體現(xiàn)在分析物會直接溶解于流動相中,還體現(xiàn)在流動相會與分析物競爭固定相表面,從而影響分析物與固定相之間的相互作用[12]。但同HPLC所用的液體流動相相比,超臨界流體的黏度低,擴散快,表面張力小,樣品在SFC上的分離速度更快[13]。超臨界流體是高度可壓縮的,流動相密度對分析物保留的影響很大。因此在SFC中,柱溫和背壓是調(diào)整分析物保留的重要參數(shù)[14]。增加背壓,流動相的密度會變大,溶解能力增強,保留時間縮短。柱溫會帶來雙重的影響,一方面升高溫度會降低流動相的密度,削弱溶解能力,保留時間延長;另一方面升高溫度可增加分析物分子的能量,保留時間縮短[15]。盡管可以通過調(diào)節(jié)溶劑密度來改變化合物的保留,但是并不能充分改變?nèi)軇┑臉O性。目前使用最多的超臨界流體是CO2,從圖2的相圖可以看出,它的臨界條件較溫和(臨界溫度Tc=31 ℃,臨界壓力Pc=7.4 MPa),更重要的是CO2具有很好的互溶性,能夠與強極性有機溶劑(甚至是微量水)混溶[16]。這樣的性質(zhì)使得SFC流動相的極性范圍得到了真正的改善,能夠擴展至比正相色譜(NPLC)和反相色譜(RPLC)更寬的范圍。除了上述獨特的性質(zhì)外,基于CO2的流動相還可以兼容多種固定相。在HPLC中,根據(jù)色譜模式的不同,固定相的劃分比較明確,如硅膠柱只適用于NPLC,而C18色譜柱只能應(yīng)用于RPLC。但是在SFC中,色譜柱的極性范圍可以從C18色譜柱逐漸過渡到硅膠柱。另外得益于商品化SFC儀器的發(fā)展,其穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密性顯著提升,SFC逐漸變成主流的柱色譜技術(shù)之一,在多種分離場景下表現(xiàn)出超越HPLC的分離能力[17]。

圖1 SFC的分離原理

圖2 二氧化碳的相圖

應(yīng)用SFC分離樣品時,首先要了解分析物的性質(zhì),一般認(rèn)為可以溶于常見有機溶劑的化合物就可以通過SFC分析。為了科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乇砻髂軕?yīng)用于SFC分析物的適用范圍,Berger[18]匯總了不同類型的化合物在SFC上的保留,發(fā)現(xiàn)弱極性到中等極性的化合物更適合SFC的分析。根據(jù)分析物的極性以及分離要求,挑選出最有潛力的固定相進(jìn)行后續(xù)實驗。為了得到合適的保留時間和理想的選擇性,一般需要加入助溶劑以及添加劑。常用的助溶劑包括甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈等,為了提高選擇性,也會選擇兩種或多種常見的助溶劑混合使用。分析物的酸堿性會影響色譜峰的形狀。一般來說,當(dāng)分析物為酸性時,會選擇甲酸、三氟乙酸等作為添加劑[19];當(dāng)分析物為堿性時,會選擇添加三乙胺、氨水等來改善峰形[20]。有時為了增加流動相的極性以及改善分析物的峰形,會選擇少量水作為添加劑[21]。在實驗操作中,也會通過調(diào)節(jié)背壓、柱溫等參數(shù)來獲得更好的分離效果。

2 SFC固定相的發(fā)展

SFC應(yīng)用初期,毛細(xì)管柱是主要的固定相,對很多物質(zhì)的保留都有限制。而后隨著儀器的發(fā)展,SFC固定相逐漸從毛細(xì)管柱過渡到常規(guī)填充柱,體現(xiàn)出應(yīng)用于SFC的分析物的極性范圍也在不斷擴大。但是早期并沒有專門為SFC研發(fā)的固定相,而是延續(xù)使用HPLC的固定相[22]。

了解分析物的性質(zhì)與色譜柱表面基團(tuán)之間的相互作用對于選擇最合適的固定相很有必要。選擇極性柱,如硅膠柱、氰基、氨基和丙二醇鍵合相時,SFC以正相模式進(jìn)行分離,應(yīng)用對象以極性化合物為主(生物堿、黃酮等)。而當(dāng)選擇非極性和疏水性色譜柱,如C8、C18、C30柱以及苯基柱,SFC則以反相模式運行,應(yīng)用對象以非極性化合物為主(脂肪酸、脂溶性維生素等)[23]。

當(dāng)SFC的發(fā)展越來越成熟后,科研人員不再滿足于繼續(xù)沿用HPLC的色譜柱。2001年,2-乙基吡啶(2-EP)固定相的出現(xiàn)為發(fā)展適合SFC的固定相提供了新的思路。2-EP的保留機理主要有3個:吡啶基團(tuán)與固定相上的硅醇基的氫鍵作用使固定相活性降低;質(zhì)子化后的吡啶與分析物中帶正電的基團(tuán)之間的電荷排斥作用;中性吡啶基對硅膠固定相活性位點的立體屏蔽效應(yīng)[24]。在使用過程中發(fā)現(xiàn),同其他色譜柱相比,2-EP對堿性化合物的拖尾有很好的抑制效果,同時在分離酸性和中性化合物時也可以提供良好的選擇性[25]。隨后,Waters公司相繼推出了多款性能更優(yōu)異的SFC鍵合相,包括PIC、DIOL、DEA和1-AA等,滿足了更多分離體系的需求。Shimadzu公司也合成了14款專用于SFC的固定相,Gros等[26]利用線性溶劑化能量關(guān)系模型研究了以上色譜柱的保留機理,以方便使用者根據(jù)分析物的特點選擇合適的固定相類型。與此同時,科研人員也在推出專門為SFC發(fā)展的鍵合相。如McClain等[27]設(shè)計并合成了一系列含有氫鍵基團(tuán)的雜環(huán)固定相,這些固定相很容易與分析物形成多點相互作用,其中2-PY-U和4-PY-A顯示出與商品化固定相相當(dāng)?shù)纳V性能和通用性。更重要的是,McClain等[27]考慮了固定相結(jié)構(gòu)對色譜性能和通用性的影響,提出了SFC固定相的設(shè)計原則:在保留含氮雜環(huán)的基礎(chǔ)上,增加氫鍵等多種相互作用,以利于與分析物形成多個吸附位點。該觀點為后續(xù)SFC固定相的設(shè)計提出了思路和方向。Bocian等[28]合成了一系列含有苯基的固定相并進(jìn)行了吸附測試。觀察到有機溶劑的吸附在很大程度上取決于鍵合相中極性官能團(tuán)的存在,這些極性官能團(tuán)影響固定相表面的疏水性和極性。Borges-Munoz等[29]合成了C18酰胺固定相,同硅膠柱或末端酰胺柱相比,該固定相對極性化合物的保留較弱,但卻表現(xiàn)出良好的選擇性。Ovchinnikov等[30]首次將兩性離子親水固定相應(yīng)用在SFC上,并利用線性溶劑化能量關(guān)系模型對該色譜柱對化合物的保留進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)主要作用力來自氫鍵相互作用,保留特性與2-EP接近。Nagai等[31]設(shè)計合成了一種聚對苯二甲酸丁二醇酯的新型固定相,該固定相由平面芳香苯基和酯基單體單元組成,顯示出對同分異構(gòu)芳烴和類似化合物的優(yōu)異識別能力。West等[32]設(shè)計合成了3種基于二氧化硅的聚乙烯吡啶固定相,與2-EP和2-PIC相比具有更強的保留和更好的屏蔽殘留硅醇基的作用。Fu等[33]合成并評價了一系列鍵合密度不同的C8固定相,以擴大SFC的應(yīng)用范圍。同硅膠柱相比,該固定相雖然保留較弱,但選擇性更加優(yōu)異,可以區(qū)分不同烷基鏈、雙鍵和順反式結(jié)構(gòu)的生物堿,進(jìn)一步證明了烷基固定相在提高SFC選擇性方面的潛力。Jiang等[34]合成了一系列具有不同取代基的苯基型固定相,利用線性溶劑化能量關(guān)系模型研究了這些固定相在SFC中的保留機制,并利用25種酚類化合物研究色譜柱之間良好的正交性。Wolrab等[35]合成了6種混合模式的離子交換色譜柱,研究了堿性和兩性離子分析物在HPLC和SFC模式下的分離性能。結(jié)果顯示,不同色譜模式下,離子交換作用都是主要作用力,并對堿性化合物表現(xiàn)出很好的分離效果。Fu等[36]在SFC中首次使用反相色譜/離子色譜(RP/IC)混合模式固定相,并將其應(yīng)用于吲哚類生物堿的快速分離中。綜合來看,SFC上鍵合相的發(fā)展方向是多元化的,不局限于某種類型(以上固定相的匯總見表1)。

表1 SFC固定相的匯總

在鍵合相種類不斷發(fā)展的過程中,SFC色譜柱的粒徑也在逐漸向更小的方向發(fā)展。Perrenoud等[37]在UHPLC和UHPSFC上分別對比了粒徑為1.7 μm和3.5 μm的完全多孔填充色譜柱的動力學(xué)性能以及歸一化的壓降隨線速度的變化,結(jié)果表明兩個規(guī)格的色譜柱在UHPSFC上的動力學(xué)性能明顯優(yōu)于UHPLC,但是兩根色譜柱在UHPSFC上的壓降卻低于UHPLC,體現(xiàn)了超臨界流體黏度低、擴散快的優(yōu)勢。另外在UHPSFC上,1.7 μm的色譜柱最優(yōu)線速度區(qū)間更大,即亞2 μm小粒徑色譜柱在高流速下依然保持高效分離的能力。同時為了將柱外效應(yīng)降到最低,一般會將色譜柱的規(guī)格做到100 mm×3 mm或更大規(guī)格[38]。目前亞2 μm的材料可以與現(xiàn)有SFC儀器完美匹配,應(yīng)用的場景也越來越多[39]。Khalikova等[40]利用1.7 μm的PIC色譜柱建立了快速的SFC方法來測定9種防曬劑的含量,并對一款市售防曬霜的成分進(jìn)行了測定。Novakova等[41]開發(fā)了一種用于9種雌激素衍生物的超快速定量方法。對固定相種類、改性劑種類、柱溫、背壓和梯度條件等色譜參數(shù)進(jìn)行了單變量的篩選,最終利用1.7 μm的PFP色譜柱在1.6 min內(nèi)完成對上述化合物的基線分離。Du等[42]利用1.7 μm的BEH色譜柱建立了10種生物胺的SFC分離方法,并將該方法應(yīng)用于魚和蝦體內(nèi)生物胺的檢測。

3 SFC對天然產(chǎn)物的分離

天然產(chǎn)物具有特定的活性骨架和活性基團(tuán)以及優(yōu)異的生物活性,為新藥發(fā)現(xiàn)提供了許多新機會。據(jù)報道,與天然產(chǎn)物有關(guān)的化合物在商品藥中占80%[43]。植物是天然產(chǎn)物的重要來源,含有黃酮類、生物堿類、萜類等成分,這些成分是中藥材發(fā)揮藥效作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。SFC具備中藥材分離和純化方面的優(yōu)勢,幾類中藥材中重要的活性物質(zhì)在SFC上的分離情況總結(jié)如下。

3.1 脂類

脂類是中藥中主要的一類化學(xué)成分,疏水?；満筒煌愋偷挠H水基團(tuán)之間復(fù)雜的組合方式使得脂類的種類豐富,包括脂肪酸、?；视?、磷脂等。脂類是SFC發(fā)展初期主要的應(yīng)用對象,也是目前為止在SFC上研究最多的一類化合物[44]。早期的研究中一般使用超臨界毛細(xì)管柱分析極性較弱的脂類。如Baiocchi等[45]在考察了多個色譜條件對分離的影響以及對比了幾種不同極性的固定相后,建立了在5 min內(nèi)快速分離脂類的方法,并從植物油和魚油中分離了13種三酰甘油。BorchJensen等[46]建立了一種利用DB-225極性毛細(xì)管柱分離蓖麻籽油和雨環(huán)菊種子油中幾種游離脂肪酸的方法,并經(jīng)過質(zhì)譜鑒定,純度為87%。隨著超臨界柱色譜技術(shù)的發(fā)展,SFC上可以分離的脂質(zhì)的極性范圍逐漸擴大。常用的色譜柱包括氰丙基柱、氨基柱、氰基柱、硅膠柱、C8柱和C18柱[47-49]。探索脂類的分離規(guī)律時,研究人員發(fā)現(xiàn)了C18等反相柱在SFC模式下優(yōu)異的分離效果,提高了對SFC分離機理的認(rèn)知水平,并擴大了SFC色譜柱的范圍。如Matsubara等[50]比較了類胡蘿卜素及其環(huán)氧化產(chǎn)物在硅膠柱、苯基柱、C18柱和C30柱上的分離效果,發(fā)現(xiàn)在C18柱上得到了最佳的分離度和最短的分析時間。Choo等[51]利用C18柱來分離棕櫚油中的脂肪酸、生育酚、甘油三酯以及胡蘿卜素等成分。Tyskiewicz等[52]利用C18柱對廢魚油中的脂溶性維生素進(jìn)行了分離。雖然固定相是決定化合物選擇性的主要因素,但是優(yōu)化改性劑的種類也是有必要的。最新的報道中,Kozlov等[53]對甘油異構(gòu)體分離時發(fā)現(xiàn)了不同溶劑對選擇性和峰形的影響,當(dāng)改性劑為甲醇時,分離性能最優(yōu)。

3.2 萜類

萜類及其衍生物是由戊二羥酸構(gòu)成的具有異戊二烯結(jié)構(gòu)特征的一類化合物[54]。在自然界中廣泛存在,具有抗氧化和抗菌的生物活性,以及抗炎和抗癌作用。萜類按其分子中異戊二烯的數(shù)量劃分,可分為單帖、倍半萜、二萜、三萜和四萜等。然而,各種萜烯的結(jié)構(gòu)密切相關(guān),導(dǎo)致它們的分離變得很復(fù)雜。目前主流的分離方法以氣相色譜為主,但是這種方法只限于分析水平,不適合大規(guī)模制備[55]。而SFC有較好的對映體分離能力,同時又可以滿足制備需,正在逐漸成為分離萜類化合物的新主流色譜技術(shù)。常用來分析萜類的固定相包括C18柱、苯基己基柱、PFP柱、2-EP柱、硅膠柱和氨基柱等[56-58]。一般選擇甲醇作為改性劑,很少使用添加劑。Kohler等[59]開發(fā)了測定青蒿中2種倍半萜(青蒿素和青蒿酸)的超臨界柱色譜和超臨界毛細(xì)管色譜方法。利用氨基柱色譜分離青蒿素和青蒿酸的時間不超過8 min,而超臨界毛細(xì)管色譜的分離時間約為25 min。與超臨界毛細(xì)管色譜相比,超臨界柱色譜技術(shù)具有更高的分析效率、更短的分析時間和更強的分辨能力。Lesellier等[60]首次嘗試用SFC建立分析三萜類化合物的分離方法,并將該方法應(yīng)用于蘋果渣提取物的分離上,20 min內(nèi)分離了15種三萜類化合物,顯示了該方法在三萜類化合物分離中的巨大潛力。另外利用SFC-MS聯(lián)用技術(shù)對萜類化合物進(jìn)行高效分離并鑒定也是一個重要的方向。Jones等[61]采用SFC-MS對洋甘菊提取物中的倍半萜等成分進(jìn)行分離和鑒定。同液相色譜方法相比,保留時間更短而且分離效果更好。

3.3 生物堿

生物堿是一類含氮的堿性有機化合物,大多數(shù)有復(fù)雜的氮環(huán)結(jié)構(gòu),具有顯著的生物活性,是中草藥重要的有效成分之一。分析生物堿常用到的色譜柱有PFP、PIC、2-EP、Torus 1-AA以及Diol柱等,助溶劑的選擇主要有甲醇、乙醇和乙腈[62,63]。分析物中的氮原子與固定相中殘存硅醇基之間的相互作用使得分離生物堿時存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。為了獲得正常的峰形,通常選擇加入堿性添加劑,如氨水和三乙胺等。Huang等[64]在闊葉十大功勞木不同部位測定了8種異喹啉生物堿的含量。經(jīng)過系統(tǒng)的色譜條件優(yōu)化,最終確定分析柱為PFP,助溶劑為甲醇,改性劑為氨水和少量的水。上述8種化合物在6 min之內(nèi)實現(xiàn)了完全分離,同HPLC的分析時間相比縮短了50 min。Yang等[65]對鉤藤中4種吲哚類生物堿異構(gòu)體進(jìn)行了分離和純化,建立了一個穩(wěn)定快速的色譜方法,選擇1-AA色譜柱,助溶劑為乙腈,添加劑為二乙胺,該方法被證明是快速分析和制備高純度標(biāo)準(zhǔn)品的可行方案,同時也證明了SFC在對手性化合物分離時的優(yōu)勢。然而分離生物堿時,也存在不加添加劑的情況,此時需要利用固定相表面的靜電排斥作用來控制生物堿峰形。如Fu等[66]分析雷公藤中的倍半萜吡啶類生物堿時,選擇2-EP色譜柱、純甲醇為改性劑也可以得到比較對稱的色譜峰。另外Jiang等[67]在分離10種異喹啉生物堿時,首次在SFC中使用低共熔溶劑作為添加劑。同常用的添加劑(甲酸和水)相比,低共熔溶劑可以顯著地降低硅醇基的作用,改善生物堿的峰形。多維色譜聯(lián)用的方式是解決復(fù)雜樣品體系分離的重要手段,如辛華夏等[68]建立了基于反相液相制備色譜和超臨界流體制備色譜的組合方法,用于分離純化醇提水沉后石油醚層中的海風(fēng)藤?；趦删S色譜不同的選擇性,從中分離出6種化合物,包括墻草堿等生物堿,顯示出超臨界流體色譜在天然產(chǎn)物的分析和制備方面的巨大潛力。

3.4 黃酮

黃酮類化合物在植物中含量豐富,具有抗氧化和抗炎作用,是藥用植物中主要的活性成分[69]。分析黃酮常用到的色譜柱包括硅膠柱、Diol柱、苯基柱、C18柱以及PIC柱[70,71]。由于酚羥基的存在,黃酮一般在酸性條件下可以獲得對稱的峰形,常用的酸性添加劑包括甲酸、三氟乙酸以及磷酸。如Huang等[72]經(jīng)過科學(xué)的色譜方法優(yōu)化,在硅膠柱上采用梯度洗脫對12種黃酮類化合物進(jìn)行分離。其中發(fā)現(xiàn)含0.1%磷酸的甲醇溶液是分離黃酮類化合物最合適的極性改性劑。與開發(fā)的HPLC相比,分析速度快3倍。當(dāng)黃酮類化合物中不存在酚羥基時,酸性添加劑的加入不是必要的。Li等[73]利用SFC分離橘皮素、褐皮素、橙皮素和柚皮素4種黃酮類化合物時,發(fā)現(xiàn)是否在改性劑中加入甲酸,對不同化合物的峰形影響不同。當(dāng)存在酚羥基時,選擇酸性添加劑有利于控制電離狀態(tài),從而得到更加對稱的峰形。Gibitz-Eisath等[74]在分離馬鞭草提取物中的8種黃酮類化合物時,對比了HPLC的分離方法,兩種色譜模式都能在短時間內(nèi)達(dá)到很好的分離效果,但是化合物的出峰順序不一樣。體現(xiàn)了兩種色譜模式高度正交,突出了方法交叉驗證在天然產(chǎn)物分析中的重要性,有利于發(fā)展多維色譜模式來分離復(fù)雜的天然產(chǎn)物。黃酮醇是一類具有藥用價值的黃酮類化合物,Liu等[75]首次用SFC來分離3種極性黃酮醇異構(gòu)體,表明超臨界流體色譜法在黃酮類化合物的分析、分離制備等方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

3.5 皂苷

皂苷由一個或多個親水糖苷部分(葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖等)和一個皂苷元的親脂苷元連接而成。根據(jù)皂苷元的性質(zhì),可分為三萜類和甾類。它們通常有重要藥理活性,如抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒等[76]。利用SFC分析皂苷的應(yīng)用相對較少,因為皂苷的極性較強,在SFC上存在保留強洗脫難的問題[77]。然而SFC固定相的發(fā)展以及多種改性劑的使用,逐漸解決了該問題。迄今為止,多個固定相如2-EP柱、苯基己基柱、氰基柱、Diol柱、C18柱、硅膠柱、PFP柱和苯基柱已被報道用于皂苷的分離。如Sun等[78]利用Torus Diol色譜柱建立了分離和定量柴胡皂苷的新方法。通過優(yōu)化色譜條件,5種柴草皂苷在22 min內(nèi)成功分離。并將其與HPLC進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)SFC分離柴胡皂苷時具有分析時間短、分離效果好的顯著優(yōu)勢,為皂苷的分離定量提供了一種新的方法。由于皂苷的高極性,一般會在改性劑中加入少量水作為添加劑來提高流動相的洗脫強度。如Huang等[79]建立了一種快速高效的SFC-MS聯(lián)用方法來分離苦藤皂苷、山楂皂苷和人參皂苷。在優(yōu)化色譜方法的過程中,發(fā)現(xiàn)在甲醇中加入少量水(5%～10%)以及甲酸(0.05%)時,化合物的分離程度以及質(zhì)譜靈敏度都會提高。且利用SFC建立的方法的分析時間是HPLC方法的1/2。超臨界流體的密度也可以作為調(diào)節(jié)流動相洗脫強度的方法。如Xing等[80]建立了離線二維SFC-HPLC方法分離三七藥材中的三萜皂苷。在優(yōu)化SFC方法時,選擇降低柱溫和增加背壓的方式來提高洗脫強度,減少分析時間。

利用SFC分離天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的相關(guān)色譜條件匯總見表2。

表2 SFC對天然產(chǎn)物分離的色譜條件匯總

4 總結(jié)及展望

經(jīng)過近50年的不斷發(fā)展,SFC憑借分離速度快和對異構(gòu)體選擇性好的特點,在手性分離領(lǐng)域快速發(fā)展,同時在非手性領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多。SFC從早期局限于對脂類的分離,逐漸擴展到對黃酮、皂苷甚至多肽等極性化合物的分離。這樣的發(fā)展與極性助溶劑的加入以及豐富多樣固定相的使用息息相關(guān)。幾乎HPLC上的固定相都可以用在SFC上,范圍可以從C18逐漸過渡到硅膠柱。專門為SFC研發(fā)的固定相,特別是極性固定相,在分離過程中通過氫鍵作用、疏水作用以及π-π相互作用等多種作用力改善了峰形并提高了選擇性。超臨界流體的低黏度性,既推動了快速色譜的發(fā)展,又促進(jìn)了小粒徑固定相的使用。儀器公司推出了耐高壓SFC儀器,與亞2 μm材料完美兼容。同HPLC相比,亞2 μm材料在SFC上的最優(yōu)線速度更大,理論塔板數(shù)最小值更低,展現(xiàn)出優(yōu)異的動力學(xué)性質(zhì)。隨著色譜技術(shù)的快速發(fā)展,SFC也在復(fù)雜體系的分離中逐漸發(fā)揮巨大優(yōu)勢。SFC未來的發(fā)展兼具創(chuàng)新性和實用性,發(fā)展方向有以下幾個方面。第一是固定相的發(fā)展。包括發(fā)展“通用性”SFC固定相,結(jié)構(gòu)較豐富,可能含有雜原子、雜環(huán)等結(jié)構(gòu),保證分離時存在多種相互作用力,適用分析物的極性區(qū)間廣泛,為大多數(shù)化合物和復(fù)雜體系提供良好的分離效果;針對難分離的對象,設(shè)計合成有特異選擇性的固定相,解決這類樣品的分離問題;根據(jù)超臨界流體黏度低、擴散快的特點,發(fā)展獨特的固定相類型促進(jìn)傳質(zhì)過程,或許類似于有序晶體這樣的結(jié)構(gòu)更適合SFC。第二是耐超高壓儀器的研發(fā)帶動超快速色譜的發(fā)展。儀器的耐壓程度大幅度提升,將固定相的尺寸帶到亞微米時代。從而得到超高柱效,峰容量急速提高,色譜分析速度縮短到以“秒”計時。第三是在非手性應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用的發(fā)展。目前最廣泛的色譜技術(shù)仍然是HPLC,而SFC僅在小分子藥物手性分離領(lǐng)域有較大的發(fā)展空間。隨著認(rèn)識水平的提高以及儀器的進(jìn)步,SFC可能會在非手性領(lǐng)域,特別是復(fù)雜天然產(chǎn)物的分離中發(fā)揮巨大作用。第四是制備型SFC的發(fā)展。超臨界CO2無毒無害,不可燃,而且價格便宜,在制備色譜中有安全經(jīng)濟的巨大優(yōu)勢。但是目前分析和制備過程的轉(zhuǎn)化還存在一定的問題,主要與超臨界流體高度可壓縮的性質(zhì)相關(guān)。未來還需要解決SFC在分析與制備方法轉(zhuǎn)移之間的制約問題,為純化制備領(lǐng)域帶來效率和經(jīng)濟的提升。