磺酸功能化共價有機骨架固相微萃取纖維的制備及其在小鼠腦部神經(jīng)遞質(zhì)分析中的應(yīng)用

楊 成, 史艷梅*, 龐田田, 劉曉冰, 張至玉, 胡 鍇*, 張書勝

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院, 河南 鄭州 450046; 2. 鄭州大學(xué)現(xiàn)代分析與基因測序中心, 河南 鄭州 450001)

神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitters, NTs)是細胞間用來傳遞信息的基本化學(xué)物質(zhì)之一,它們在機體對壓力的反應(yīng)、運動協(xié)調(diào)、精神運動控制以及神經(jīng)元間的交流中起著核心作用[1,2]。這些化學(xué)物質(zhì)根據(jù)結(jié)構(gòu)差異分為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(包括去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺等)、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(包括γ-氨基丁酸、谷氨酸和色氨酸等)。神經(jīng)遞質(zhì)與其代謝產(chǎn)物參與人體的代謝、免疫和調(diào)節(jié)活動,其異常產(chǎn)生、釋放和代謝與帕金森病、抑郁癥、阿爾茲海默癥、糖尿病以及腫瘤疾病等具有密切聯(lián)系,神經(jīng)遞質(zhì)可作為這些疾病的潛在生物標(biāo)志物[3-5]。對生物機體以及生物樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)進行準確定量檢測,可以為疾病的檢測與治療提供重要信息,反映藥物療效。因此,有必要開發(fā)有效的分析技術(shù),對生物樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)進行準確定量分析。目前,用于生物樣本中神經(jīng)遞質(zhì)檢測的儀器分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、電化學(xué)傳感法、高效毛細管電泳法(HPCE)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等[6-8]。盡管目前用于檢測神經(jīng)遞質(zhì)的分析方法取得了一定進展,但神經(jīng)遞質(zhì)在體內(nèi)含量極低,基質(zhì)干擾大,活體取樣存在極大挑戰(zhàn)。因此在分析時需要進行樣品預(yù)處理從而達到富集目標(biāo)物而消除基質(zhì)效應(yīng)的目的。

活體檢測腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究具有重要的意義。然而,由于待測組織的復(fù)雜性,在保證所需的分析性能的同時,還要保持待測組織的完整性,活體分析在實踐中面臨巨大的挑戰(zhàn)。微透析技術(shù)是目前使用最廣泛的活體取樣技術(shù)之一,然而,微透析技術(shù)的透析液中存在的鹽和緩沖液可能會對質(zhì)譜檢測產(chǎn)生影響。此外,微透析探針的植入可能會對神經(jīng)組織造成損傷,引起神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變[9]。電化學(xué)方法雖然具有優(yōu)異的時間分辨率和極高的靈敏度,但容易受到細胞外酸堿度變化的干擾。生物傳感器不能同時用于多種神經(jīng)遞質(zhì)的分析,并且由于蛋白質(zhì)和其他代謝物的干擾,可能不適于復(fù)雜生物樣品的分析[10]。固相微萃取(SPME)是一種集樣品制備、分離和富集于一體的新技術(shù),其克服了上述方法的缺點。體內(nèi)SPME技術(shù)簡化了分析過程中樣本收集的步驟,減少了樣品制備時間,更綠色環(huán)保[11]。SPME由于具有低侵入性、微創(chuàng)性、低成本、無溶劑、高通量等優(yōu)點,已成功應(yīng)用于動物、人類和植物組織的活體研究中[12,13]。例如,Reyes-Garcés等[14]利用SPME-HPLC-MS/MS技術(shù)研究了深度腦刺激后大鼠海馬區(qū)的多種代謝物的變化。該研究使用了兩種SPME纖維,C18/聚丙烯腈SPME纖維提供了強疏水相互作用,混合模式/聚丙烯腈SPME纖維提供了疏水相互作用和強陽離子交換作用。Aslam等[15]使用聚丙烯腈/反相酰胺SPME纖維研究了暴露于各種應(yīng)激噪聲條件下的大鼠兩個腦區(qū)中阿那達胺和2-花生酰甘油的含量變化。研究表明,大鼠不同腦區(qū)對應(yīng)激的反應(yīng)不同,其不同腦區(qū)的阿那達胺和2-花生酰甘油的含量變化也不同,這可能是由于新環(huán)境引起腦部化學(xué)物質(zhì)的變化,從而產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng)。

SPME優(yōu)異的性能為活體樣品的分析提供了可行的新技術(shù),然而,在體內(nèi)SPME方法的開發(fā)中,所用的富集材料起著至關(guān)重要的作用。共價有機骨架(covalent organic frameworks, COFs)是一種由有機骨架單元通過強共價鍵構(gòu)造而成的多孔結(jié)晶聚合物,具有低密度、高比表面積、永久孔隙率以及優(yōu)異的化學(xué)/熱穩(wěn)定性和易于功能化的特點[16,17]。這些優(yōu)點使COFs材料在氣體儲存和分離、催化、光電器件和化學(xué)傳感器等領(lǐng)域都顯示出巨大的應(yīng)用潛力。此外,COFs在分析學(xué)科中也得到了越來越多的應(yīng)用。在我們課題組的研究中,基于碳氮化物(MXene),通過原位生長的方式合成了COF@MXene復(fù)合材料,并將其用作SPME的涂層用于從蜂蜜樣品中富集分離多環(huán)芳烴[18]。另外,我們課題組還通過共價鍵合的方法制備了基于三聚氰胺的磁性COFs材料(M-CTF-TPC),將該復(fù)合材料用作磁性固相萃取吸附劑,建立了減肥茶中蒽醌類化合物的分析方法,在優(yōu)化條件下,所提出的方法得到了較低的檢出限(0.010～0.077 μg/g)[19]。李慧等[20]報道了一種以亞胺連接的多孔共價有機骨架材料(IL-COF-1),該復(fù)合材料用做固相萃取吸附劑,結(jié)合HPLC-MS建立了快速檢測蜂蜜樣品中痕量雌激素的方法。Zhuang等[21]使用一種高效吸附劑TPB-DMTP-COF去除了水溶液中的磺胺嘧啶。除此之外,COFs材料也被用來富集分離生物樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)。Wang等[22]制備了含氨基核殼結(jié)構(gòu)的COFs(Fe3O4@TpBD(NH2)2),并利用2-甲?；脚鹚釋ζ溥M行改性,合成了一種新型的磁性硼酸吸附劑(Fe3O4@COF@2-FPBA),使用該納米復(fù)合材料在中性pH條件下富集了5種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,COFs材料也展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景,包括藥物遞送、免疫治療、腫瘤診療等。Zhou等[23]通過席夫堿縮合反應(yīng)合成了COF@ICG@OVA納米粒子,并將其作為光敏劑和載體。獲得的COF@ICG@OVA納米粒子經(jīng)激光照射可以殺死癌細胞,同時釋放抗原,激活機體的免疫應(yīng)答,再進一步聯(lián)合免疫檢查點阻斷療法,阻斷癌細胞逃逸。這些報道充分表明COFs材料具有良好的生物相容性,是富集神經(jīng)遞質(zhì)的優(yōu)質(zhì)候選材料。

本研究選用具有強陽離子交換作用的磺酸功能化COFs涂層纖維(COF-SO3H)來富集活體小鼠腦部海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)。COF-SO3H萃取纖維豐富的孔隙率、較大的比表面積增加了其與目標(biāo)分析物的接觸面積,縮短了擴散路徑,增強了離子交換作用,實現(xiàn)了對目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的富集萃取。結(jié)合UPLC-MS/MS建立了活體腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的富集分析方法,為神經(jīng)遞質(zhì)活體檢測和定量分析提供了一種切實可行的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜、TSQ Altis高分辨質(zhì)譜儀、ESCALAB XI+X射線光電子譜、Nicolet iS20傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Scientific公司); 3-18KS高速冷凍離心機(中國西格瑪-奧德里奇有限公司); 2020HD88比表面及孔徑分析儀(美國Micromeritics公司); JEM-2010F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社(JEOL)); D2 PHASER X射線多晶衍射儀(XRD,北京布魯克科技有限公司); HT7700透射電子顯微鏡(日本日立公司);腦立體定位儀(北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司)。

本實驗使用的所有試劑均為分析級,三醛基間苯三酚、1,4-二氨基-2-硝基苯、四氫呋喃(THF)、甲酸(FA)、連二亞硫酸鈉、1,3-丙磺酸內(nèi)酯、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(EP)、多巴胺(DA)、膽堿(Cho)、異丙醇(IPA)、乙醇(EtOH)、L-谷氨酸-15N (L-Glu-15N)、β-淀粉樣多肽1-42 (Aβ1-42)均購自阿拉丁試劑有限公司(中國);乙酸(HAc)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、5-羥色胺(5-HT)、氯化膽堿-三甲基-d9(Cho-d9)、天麻素等均購自麥克林試劑有限公司(中國);聚丙烯腈(PAN)、甲苯、鹽酸(HCl)、DA-1,1,2,2-d4、瓊脂均購自西格瑪-奧德里奇有限公司(中國);乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)購自美國Fisher Scientific公司;γ-GABA-d6購自加拿大Toronto Research Chemicals公司。

藥品制備:用生理鹽水將Aβ1-42稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL,儲存在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中老化7 d,將老化后的Aβ1-42置于-20 ℃條件下備用。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

Acquity UPLC BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相由0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成,流速為0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～4 min, 5%B～6%B; 4～7 min, 6%B～5%B; 7～11 min, 5%B。柱溫為25 ℃,進樣量為2 μL。

電噴霧電離源(ESI),利用選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描(SRM)模式進行正離子掃描,噴霧電壓3.5 kV,毛細管溫度350 ℃,加熱溫度325 ℃,鞘氣25 arb,輔助通氣10 arb,反吹氣0 arb,氮氣被用作碰撞氣和C-trap的阻尼氣。其他優(yōu)化參數(shù)如表1所示。

表1 7種NTs及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 COF-SO3H材料的制備

對文獻[24]報道的COFs合成方法進行改進,合成COF-SO3H材料,其制備過程及萃取過程如圖1所示。

圖1 磺酸功能化COFs涂層纖維的制備流程及SPME過程圖

COF-NO2的制備:將210 mg三醛基間苯三酚和230 mg 1,4-二氨基-2-硝基苯粉末分散于5 mL ACN中,超聲混合溶解均勻后,再加入0.5 mL 12 mol/L HAc,振蕩10 s混合均勻,將得到的混合溶液在室溫下靜置反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后,通過離心(1 min, 12 000 r/min)收集得到紅色沉淀,并分別用丙酮、THF和EtOH洗滌3次,60 ℃下真空干燥12 h后得到紅色粉末狀COF-NO2。

COF-NH2的制備:將600 mg COF-NO2置于100 mL圓底燒瓶中,加入3.6 g Na2S2O4、30 mL EtOH和6 mL H2O,將混合物在50 ℃下攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后,離心(1 min, 12 000 r/min)收集沉淀,再分別用H2O和EtOH交替洗滌2次,除去未反應(yīng)的Na2S2O4。最后,在60 ℃下真空干燥12 h后得到COF-NH2紅色固體。

COF-SO3H的制備:將200 mg合成的COF-NH2加入到250 mL三頸燒瓶中,再加入100 mL無水甲苯和10 mL 1,3-丙磺酸內(nèi)酯,裝上冷凝裝置,混合物在120 ℃下磁力攪拌12 h。反應(yīng)結(jié)束后,用MeOH清洗材料,并在50 ℃下真空干燥12 h,得到COF-SO3H材料。

COF-SO3H萃取纖維的制備:取20 mg PAN和30 mg COF-SO3H材料加入0.3 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),磁力攪拌4 h后,得到均勻的COF-SO3H懸浮液。將處理好的不銹鋼絲蝕刻端(直徑刻蝕120 μm)重復(fù)浸入裝有COF-SO3H懸浮液的小瓶中,直至達到所需涂層厚度(涂層段的總直徑(195±5) μm),涂層長度為2.5 mm。SPME纖維制備完成后,將其放入MeOH-ACN-IPA(40∶30∶30, v/v/v)的混合溶液中超聲清洗20 min,除去在制造過程中產(chǎn)生的未固化的PAN膠和松散的聚合物顆粒。

1.4 小鼠腦替代基質(zhì)制備

瓊脂凝膠和生物體間質(zhì)液的黏度非常相似。因此,使用瓊脂凝膠模擬生物體間質(zhì)液,用瓊脂凝膠(瓊脂與PBS緩沖液按質(zhì)量與體積1∶50(g/mL)混合均勻)和鼠腦勻漿以體積∶質(zhì)量2∶1(mL/g)的比例混合制備腦替代基質(zhì)。

1.5 動物實驗

KM小鼠(體重(35±5) g)購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,飼養(yǎng)于溫度(22±3) ℃、濕度55%±5%、每12 h明暗交替一次的清潔級環(huán)境中,自由攝食飲水,分籠喂養(yǎng)。本實驗獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(No. DWLL202103189)。

在實驗前喂養(yǎng)所有KM小鼠一周,以適應(yīng)新的環(huán)境。挑選健康的小鼠隨機分成對照組、模型組和天麻素給藥組,每組6只。第8天所有小鼠通過手術(shù)進行造模并植入單側(cè)留置導(dǎo)管。用異氟烷麻醉KM小鼠后,將其固定在腦立體定位儀上,保持顱骨水平,劃開小鼠頭部皮膚,剝離顱骨表面結(jié)締組織。以前囟點(bregma)為0點,用顱骨鉆0點向后2.5 mm、中線向右2 mm鉆孔。微調(diào)微量注射器位置與鉆孔位置相同,將連接微玻管的注射針緩慢下移2 mm。Aβ1-42溶液(模型組和給藥組)或生理鹽水溶液(對照組)于5 min內(nèi)注射完畢,留針5 min以確保藥物完全吸收分散。之后將定制的套管固定在孔中,在導(dǎo)管植入后,插入延伸至導(dǎo)管下方1 mm的探針,并擰緊防塵帽,以保持其清潔和通暢。在上述實驗24 h后,給動物灌胃給藥(正常組和模型組:生理鹽水;給藥組:天麻素,25 g/kg),一天一次,之后每周取樣檢測神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化。

1.6 活體SPME過程

將小鼠用異氟烷麻醉后,COF-SO3H萃取纖維通過留置導(dǎo)管插入小鼠頭部,調(diào)整纖維深度,確保纖維萃取涂層完全進入小鼠腦部海馬區(qū)后,靜態(tài)萃取15 min后取出,將纖維用300 μL超純水沖洗10 s,隨后將其浸泡于100 μL的甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50,v/v/v)中超聲解吸15 min,將解吸液進行UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 COF-SO3H材料和COF-SO3H萃取纖維表征

COF-SO3H SPME纖維的橫截面SEM形貌如圖2a所示,可以看出COF-SO3H SPME纖維中COF-SO3H分散在由PAN聚合形成的孔中,纖維涂層的厚度約為40 μm。圖2b為纖維表面的SEM圖,可以看到纖維表面有豐富的孔隙。此外,相應(yīng)的元素映射分析顯示,COF-SO3H材料中C、O、N、S元素分布均勻,C含量為60.06%, O含量為13.77%, N含量為24.94%, S含量為1.24%。

圖2 COF-SO3H纖維(a)橫截面和(b)表面的SEM圖及其材料的(c)FT-IR光譜和(d)XRD表征圖

利用紅外光譜對制備的COF-NO2、COF-NH2和COF-SO3H進行官能團結(jié)構(gòu)表征。如圖2c所示,COF-NO2的紅外圖譜中在1 600 cm-1和1 379 cm-1處出現(xiàn)了硝基吸收峰,在3 342 cm-1和3 463 cm-1處出現(xiàn)了氨基的特征吸收峰。COF-NO2被Na2S2O4還原成COF-NH2后,硝基的特征峰消失,伯胺的特征吸收峰減弱。在COF-SO3H的圖譜中發(fā)現(xiàn)了1 033 cm-1處的S=O伸縮振動峰和733 cm-1處的C-S伸縮振動峰,結(jié)合SEM和元素映射分析結(jié)果,表明COF-SO3H材料的成功合成。用XRD對制備的COF-SO3H的晶型進行研究。如圖2d所示,3種COF材料在7.07°、9.30°、11.6°和24.97°處有弱峰,結(jié)果表明合成的材料為典型的COFs結(jié)構(gòu)。

通過測量77 K下的N2吸附-解吸等溫線來研究球形COFs的多孔結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,吸附劑的氮吸附等溫線與Ⅳ等溫線一致,表明材料主要具有介孔結(jié)構(gòu)。然后基于Brunauer-Emmett-Teller模型分析比表面積,COF-SO3H的比表面積為46.17 m2/g,在p/p0=0.990 0時計算的孔體積為0.38 cm3/g,根據(jù)BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方法計算孔的平均直徑為33.2 nm。

2.2 萃取條件優(yōu)化

2.2.16種萃取纖維萃取效果的比較

首先,考察了所制備的COF-SO3H萃取纖維與HLB、C18、MCX、Amino、PXC 5種不同類型的萃取纖維對目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的萃取效果。根據(jù)萃取到的所有神經(jīng)遞質(zhì)的相對含量對萃取纖維進行評估。由于每種萃取纖維的性能不同,對目標(biāo)物的吸附機理不同,為了保證每種材料都能得到最好的脫附結(jié)果,使用了3種不同類型的脫附溶劑(甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)、氨水-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)、甲醇-水(50∶50, v/v))對萃取后的涂層纖維進行脫附。在添加有200 ng/mL的NE、EP、DA和5-HT, 20 μg/mL的GABA、Glu和Cho的腦替代基質(zhì)中進行優(yōu)化實驗,靜態(tài)萃取10 min后,用300 μL水沖洗10 s,隨后將其浸泡于100 μL的脫附溶劑中超聲10 min以解吸目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)。結(jié)果如圖3所示,當(dāng)氨水-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)為脫附溶劑時,COF-SO3H萃取神經(jīng)遞質(zhì)的相對含量較HLB、C18、MCX、Amino要高,但低于PXC;當(dāng)脫附溶劑為甲醇-水(50∶50, v/v)時,COF-SO3H纖維萃取神經(jīng)遞質(zhì)的相對含量較HLB、C18、Amino要高,略低于PXC和MCX;當(dāng)脫附溶劑為酸性的甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)時,COF-SO3H纖維萃取效果最好。選用酸性脫附溶劑還可避免兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)(NE、EP、DA和5-HT)被氧化,增加目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性,同時防止目標(biāo)分析物穿透涂層表面的保護層并被反萃取。因此,COF-SO3H纖維在滿足目標(biāo)分析物穩(wěn)定性的同時比其他萃取纖維萃取效果更好。

圖3 微萃取纖維對神經(jīng)遞質(zhì)萃取量的影響

2.2.2脫附溶劑的優(yōu)化

為了達到COF-SO3H纖維最好的萃取效果,優(yōu)化了7種不同類型的酸性脫附溶劑,分別是甲酸-水-甲醇-乙腈(0.4∶39.6∶30∶30, v/v/v/v)、1%乙酸水溶液、1%甲酸水溶液、乙酸-水-甲醇-乙腈(0.4∶39.6∶30∶30, v/v/v/v)、1%甲酸甲醇溶液、1%乙酸甲醇溶液和甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)。結(jié)果如圖4a所示,脫附溶劑為甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)時,脫附效果最好。因此,后續(xù)實驗用甲酸-甲醇-水(0.5∶49.5∶50, v/v/v)來解吸COF-SO3H纖維上的神經(jīng)遞質(zhì)。

圖4 (a)脫附溶劑、(b)萃取時間和(c)解吸時間的優(yōu)化

2.2.3萃取時間和解吸時間的優(yōu)化

萃取時間和解吸時間是SPME中的關(guān)鍵因素,會顯著影響萃取效率。為了確定和選擇最佳平衡萃取時間,采用腦替代基質(zhì)進行萃取時間和解吸時間的優(yōu)化,如圖4b所示,在5～15 min內(nèi),纖維上萃取神經(jīng)遞質(zhì)的量隨著萃取時間的增加而增加,15 min后萃取量處于動態(tài)平衡狀態(tài)。在5～30 min內(nèi)對解吸時間進行了優(yōu)化,如圖4c所示,隨著解吸時間的增加,目標(biāo)物的萃取量迅速增加并趨于平衡,在15 min后洗脫量基本保持不變。因此,以萃取時間15 min和解吸時間15 min進行后續(xù)實驗。

2.3 方法驗證

在最佳的萃取條件下,通過在500 μL的小鼠腦替代基質(zhì)中加入質(zhì)量濃度為1～3 000 μg/mL的GABA、Glu和Cho,以及0.001～2 μg/mL的NE、EP、DA和5-HT來考察方法的線性。在所有樣品中DA-d4和L-Glu-15N的質(zhì)量濃度保持在20 ng/mL,Cho-d9和GABA-d6保持在1.25 μg/mL。通過目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度與其峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的關(guān)系,獲得校準曲線。如表2所示,所有標(biāo)準曲線具有良好的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99),單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的定量限(S/N≥5)[25]分別為0.003～0.005 μg/mL和3～5 μg/mL,一日內(nèi)連續(xù)制備4組同一質(zhì)量濃度的樣品進行分析,4次檢測的RSD低于20%。以每個水平下的3次重復(fù)測量的RSD值評估該方法的精密度,以|(實測分析物濃度-理論加標(biāo)濃度)/理論加標(biāo)濃度|×100%計算準確度[25],用下列公式計算絕對基質(zhì)效應(yīng)[25]:

表2 7種NTs的線性范圍、線性方程、定量限和相關(guān)系數(shù)

其中,Ca+b(ng/mL)為加標(biāo)小鼠腦勻漿樣品中分析物的實測含量,Ca(ng/mL)為腦勻漿樣品中分析物的含量,Cb(ng/mL)為純解吸溶劑中加標(biāo)分析物的實測含量。

如表3所示,該方法的精密度(0.80%～9.50%)和準確度(2.08%～17.72%)良好,絕對基質(zhì)效應(yīng)為82.22%～117.92%,表明復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)分析物的準確測定影響較小。

表3 7種NTs在小鼠腦勻漿中3個水平下的準確度、精密度和絕對基質(zhì)效應(yīng)(n=3)

2.4 方法應(yīng)用

為了評估COF-SO3H萃取纖維的實用性,將該纖維應(yīng)用于測定小鼠腦部海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)含量。使用1.5節(jié)的方法對小鼠進行造模和留置導(dǎo)管后,第2周開始對小鼠腦部海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)進行分析,結(jié)果如圖5所示。從第2周開始,與對照組相比,模型組小鼠腦內(nèi)海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯降低;與模型組相比,隨著給藥時間周期的增加,天麻素治療組可明顯升高小鼠腦部海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果表明,所建立的活體SPME-UPLC-MS/MS的分析方法為活體神經(jīng)遞質(zhì)的富集分析提供了一種切實可行的方案。其次,天麻素對阿爾茲海默癥具有潛在的治療效果,為阿爾茲海默癥的臨床治療提供了參考。

圖5 小鼠腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化(n=3)

3 結(jié)論

在室溫下制備了具有強陽離子交換作用的COF-SO3H吸附材料,并將其制備成SPME纖維,結(jié)合UPLC-MS/MS用于小鼠腦部神經(jīng)遞質(zhì)的檢測。與其他5種商品化的纖維材料相比,COF-SO3H具有較好的吸附效果,這可歸因于其獨特的孔隙結(jié)構(gòu)和豐富的基團,以及π-π作用和離子交換作用等。為了確保其在小鼠腦部應(yīng)用的準確性,選擇腦替代基質(zhì)進行萃取條件的優(yōu)化。在最優(yōu)的萃取條件下,基于COF-SO3H的SPME-UPLC-MS/MS方法精密度良好,準確度高。此外,COF-SO3H具有較好的生物相容性,不會引起毒性反應(yīng)和副作用,在留置導(dǎo)管的幫助下,可成功應(yīng)用于小鼠腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的檢測。