復發(fā)性流產(chǎn)患者宮腔微環(huán)境對早期妊娠的影響

藺凱麗，郭潔，張崴，宋殿榮，張繼雯，懷其娟，趙琳

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見的病理性妊娠，發(fā)生率為1%～5%，且隨著流產(chǎn)次數(shù)增加，再次妊娠流產(chǎn)的風險顯著增加，給患者帶來嚴重的經(jīng)濟負擔和心理壓力，成為生殖健康領域亟待解決的重要問題[1]。RSA 病因復雜，除生殖道解剖結構異常、內(nèi)分泌疾病、染色體異常和免疫性疾病等因素外，生殖道感染也是重要的病因之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，正常早孕女性宮腔優(yōu)勢菌為卷曲乳桿菌，而RSA 患者宮腔優(yōu)勢菌為惰性乳桿菌，且RSA 患者宮腔菌群中兩歧雙歧桿菌和不能培養(yǎng)的不動桿菌相對豐度顯著降低，而擬桿菌屬、大腸埃希菌/志賀菌屬和瘤胃菌屬團顯著增加[2]。本研究利用宮腔灌洗液模擬宮腔微環(huán)境干預子宮內(nèi)膜細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞，初步探討RSA 患者宮腔微環(huán)境對早期妊娠的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2021 年10 月—2022 年1 月就診于天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院（我院）擬行清宮術的RSA 患者（6 例）和同期擬行人工流產(chǎn)術的正常早孕女性（6 例）。RSA納入標準：連續(xù)2 次或2 次以上在妊娠28 周之前胎兒丟失的患者；年齡＜35 歲，孕周＜12 周，無妊娠合并癥及并發(fā)癥；48 h 內(nèi)無性生活、陰道操作及沖洗史；30 d 內(nèi)無抗生素應用史；3 個月內(nèi)無泌尿生殖道或身體其他部位感染史；簽署知情同意書。排除標準：解剖結構異常、染色體異常、血栓前狀態(tài)、抗磷脂綜合征和內(nèi)分泌疾病等；患有高血壓、免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤等重大器質(zhì)性疾病或嚴重精神心理疾病者。

1.2 標本采集

1.2.1 獲取宮腔灌洗液 采集2 組患者的宮腔灌洗液。常規(guī)消毒外陰、陰道，打開無菌窺器，宮腔內(nèi)置入一次性子宮造影通水管（湛江市事達實業(yè)有限公司，湛江），球囊內(nèi)注入適量空氣，另用注射器取5 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，康寧生命科學亞洲分銷中心，上海）注入宮腔，停留1 min 后，反復抽吸2 次以沖洗內(nèi)膜，最后抽吸出約4.8 mL 宮腔灌洗液，立即置于15 mL 無菌離心管（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海）中，封口膜（畢瑪時軟包裝有限公司，蘇州）封口，迅速轉(zhuǎn)移至實驗室（不超過15 min），進行實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 采集正常育齡期女性子宮內(nèi)膜組織進行原代子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)。術前常規(guī)消毒陰道、宮頸，將刮匙刮出的子宮內(nèi)膜組織用含有雙抗的PBS 洗滌至無肉眼可見的血跡，迅速轉(zhuǎn)移至實驗室，無菌眼科剪剪成體積約1～2 mm3組織塊，加入適量復合消化酶（1 mg/mL 膠原酶I∶0.25%胰蛋白酶=1∶1）（北京索萊寶科技有限公司，北京），37 ℃消化10 min，取上清，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，上海煊翎生物科技有限公司，上海）的培養(yǎng)基（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海）終止消化，70 目篩網(wǎng)過濾，重復消化2～3 次，直至將子宮內(nèi)膜組織消化呈云霧狀，混合消化液，1 000 r/min室溫離心5 min，棄上清，加入適量紅細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司，北京），除去紅細胞，無菌PBS 洗滌細胞團2 次，全培基重懸細胞團，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，取5 mL 細胞懸液接種于T75 培養(yǎng)瓶（碧迪醫(yī)療器械有限公司，上海）中培養(yǎng)。另購買人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞株（HTR-8/SVneo，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，河南）進行培養(yǎng)。

1.2.3 細胞免疫熒光鑒定 將子宮內(nèi)膜細胞接種于24 孔板（碧迪醫(yī)療器械有限公司，上海）中，待生長融合至50%時棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌后加入適量4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司，上海）固定10 min；PBS 復洗3 次后加入適量0.3%通透液透化（上海碧云天生物技術有限公司，上海）10～15 min；PBS 浸泡洗滌3 次后用10%牛血清蛋白（北京索萊寶科技有限公司，北京）37 ℃靜置封閉1 h；吸棄牛血清蛋白，以100 μL/孔添加抗波形蛋白抗體（蘇州睿瀛生物技術有限公司，江蘇）和抗角蛋白抗體（蘇州睿瀛生物技術有限公司，江蘇）至24 孔板中，封口膜封閉細胞（各封閉2 孔），陰性對照組用PBS 封閉2 孔，置于4 ℃冰箱過夜；PBS 浸泡洗滌3 次后避光下加入熒光二抗（蘇州睿瀛生物技術有限公司，江蘇）100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBS 浸泡洗滌3 次后4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核3 min；PBS 浸泡復洗3 次后倒置熒光顯微鏡拍照、記錄。

1.3 觀察指標

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測宮腔灌洗液脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）濃度 分別取正常早孕女性和RSA 患者宮腔灌洗液0.8 mL 分裝到1.5 mL 的離心管中，按照ELISA 試劑盒（LPS：上海嵐派生物科技有限公司，上海；TNF-α、IL-2、IFN-γ：江蘇酶免實業(yè)有限公司，江蘇）說明書步驟檢測2 組宮腔灌洗液LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ 的濃度。

1.3.2 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR）法檢測宮腔灌洗液對子宮內(nèi)膜細胞TNF-α、IL-2、IFN-γ mRNA 表達的影響 將生長狀態(tài)良好的子宮內(nèi)膜細胞接種于6 孔板中（3×105個/孔）培養(yǎng)24 h 后隨機分為2 組，正常早孕組加入正常早孕女性宮腔灌洗液與培養(yǎng)基的混合液（宮腔灌洗液∶培養(yǎng)基=1∶1）1.5 mL，RSA 組中加入RSA 患者宮腔灌洗液與培養(yǎng)基的混合液（宮腔灌洗液∶培養(yǎng)基=1∶1）1.5 mL，共培養(yǎng)24 h 后，按照試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司，北京）說明書步驟采用qPCR法檢測2 組細胞TNF-α、IL-2、IFN-γ mRNA 的表達。

1.3.3 Transwell 實驗檢測宮腔灌洗液對絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲能力的影響 將生長狀態(tài)良好的絨毛外滋養(yǎng)細胞接種于6孔板中（3×105個/孔）培養(yǎng)24 h，然后再饑餓培養(yǎng)24 h，之后隨機分為2 組。用預冷的無血清培養(yǎng)基（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海）按1∶5 稀釋Matrigel 基質(zhì)膠（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海），取20 μL 鋪到Transwell 小室（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海），37 ℃培養(yǎng)箱凝膠處理30 min 后，把Transwell 小室放入預先放置700 μL 含20% FBS 培養(yǎng)基的24 孔板中（注意不要產(chǎn)生氣泡）。然后，消化2 組6 孔板中的細胞，收集細胞團，分別用各組宮腔灌洗液與培養(yǎng)基的混合液（宮腔灌洗液∶培養(yǎng)基=1∶1）重懸細胞團，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，分別取200 μL 細胞懸液鋪在Transwell 小室中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，4%多聚甲醛固定10 min，Gimusa 染液染色30 min，PBS 漂洗后，顯微鏡（×200）[10×（目鏡）×20（物鏡）]下每孔隨機選擇6 個視野進行細胞計數(shù)，取侵襲細胞的平均數(shù)來表示細胞侵襲能力。

1.3.4 劃痕實驗檢測宮腔灌洗液對絨毛外滋養(yǎng)細胞遷移能力的影響 在6 孔培養(yǎng)皿背面均勻劃橫線（間隔為0.5～1.0 cm，每孔有4 條橫線貫穿），然后將生長狀態(tài)良好的絨毛外滋養(yǎng)細胞接種于6 孔板中（3×105個/孔），培養(yǎng)24 h，饑餓培養(yǎng)24 h 后隨機分為2 組，待細胞融合至90%時，用200 μL（康寧生命科學亞洲分銷中心，上海）槍頭進行劃痕（與孔板背面橫線垂直，從頂端劃至底端不間斷），PBS 輕輕洗滌以除去劃下的細胞，然后分組干預。各組分別加入宮腔灌洗液與培養(yǎng)基的混合液（宮腔灌洗液∶培養(yǎng)基=1∶1）1.5 mL 繼續(xù)培養(yǎng)。隨機選取6 個交叉點，分別在12 h、24 h、36 h 時于光學顯微鏡下采圖，計算細胞遷移面積。

1.4 統(tǒng)計學方法采用Image J 軟件對圖片進行處理，SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（）表示，連續(xù)變量比較采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 軟件繪圖。

2 結果

2.1 ELISA 法檢測宮腔灌洗液中LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ 濃度的結果RSA 患者宮腔灌洗液中LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ 的濃度均高于正常早孕女性，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 2 組宮腔灌洗液中細胞因子濃度的比較（）

注：EU=Endotoxin Unit，專指“內(nèi)毒素單位”。

2.2 原代人子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)及鑒定結果

2.2.1 形態(tài)學鑒定結果 子宮內(nèi)膜腺上皮細胞貼壁后呈蝌蚪形或多角形，邊界清楚，排列緊密，約3～4 d呈旋渦狀排列生長，5～6 d 逐漸融合成片，見圖1。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞貼壁后呈長梭形、三角形或星形，具有成纖維細胞形態(tài)，4～5 d 融合成片，易傳代，傳代后多數(shù)為梭形，見圖2。

圖1 光鏡下子宮內(nèi)膜腺上皮細胞（×40）

圖2 光鏡下子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞（×20）

2.2.2 免疫熒光鑒定結果 子宮內(nèi)膜腺上皮細胞特異性表面蛋白角蛋白19 表達陽性（+），見圖3。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞特異性表面蛋白波形蛋白表達陽性（+），見圖4。

圖3 子宮內(nèi)膜腺上皮細胞免疫熒光圖（×40）

圖4 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫熒光圖（×40）

2.3 宮腔灌洗液對子宮內(nèi)膜細胞TNF-α、IL-2、IFN-γ mRNA 表達的影響RSA 患者的宮腔灌洗液干預子宮內(nèi)膜細胞后，TNF-α、IL-2、IFN-γ mRNA的表達均較正常早孕女性宮腔灌洗液干預組升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 2 組宮腔灌洗液影響子宮內(nèi)膜細胞促炎因子mRNA 表達的比較 （）

2.4 宮腔灌洗液對絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲能力的影響正常早孕女性和RSA 患者宮腔灌洗液干預絨毛外滋養(yǎng)細胞后，每個高倍視野下侵襲細胞數(shù)分別為（236.50±24.90）個和（158.50±16.96）個。RSA 患者宮腔灌洗液干預絨毛外滋養(yǎng)細胞較正常早孕女性宮腔灌洗液干預后侵襲細胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.343，P=0.000）。

2.5 宮腔灌洗液對絨毛外滋養(yǎng)細胞遷移能力的影響RSA 患者宮腔灌洗液干預絨毛外滋養(yǎng)細胞較正常早孕女性宮腔灌洗液干預后，細胞遷移面積在12 h、24 h、36 h 均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 2 組宮腔灌洗液影響絨毛外滋養(yǎng)細胞遷移能力的比較 （μm2，）

3 討論

在胚胎植入和胎盤血管形成階段，良好的子宮內(nèi)膜功能和形態(tài)，以及穩(wěn)定的宮腔微環(huán)境有利于子宮內(nèi)膜血管重塑，促進滋養(yǎng)細胞生長并適度侵襲至子宮肌層，對胚胎植入和胎盤血管形成至關重要，是妊娠維持的重要因素[3-4]。而在此過程中，宮腔共生菌群、相關細胞因子、子宮內(nèi)膜細胞及滋養(yǎng)細胞共同組成一個影響胚胎著床和發(fā)育的環(huán)境，即宮腔微環(huán)境。

人體內(nèi)居住著數(shù)萬億的微生物，共生菌群是人體內(nèi)固有的正常菌群。正常情況下，宮腔菌群構成一個有機整體，始終維持著健康穩(wěn)定的狀態(tài)。前期研究發(fā)現(xiàn)，RSA 患者宮腔菌群與正常早孕女性的宮腔菌群組成不同，且RSA 患者宮腔差異菌為擬桿菌屬、大腸埃希菌/志賀菌屬和瘤胃菌屬團，大多為革蘭陰性菌[3]。革蘭陰性菌細胞壁重要組成部分LPS 是介導炎癥反應的重要因子。LPS 屬于內(nèi)毒素，可引發(fā)局部炎癥反應。TNF-α 為炎癥早期最重要的前炎癥因子，具有廣泛生物活性和多種免疫功能。IL-2 是由活化的輔助性T 細胞產(chǎn)生的細胞因子，可誘導或促進多種細胞毒活性。IFN-γ 是巨噬細胞重要的激活劑，在固有免疫中發(fā)揮作用[5]。本研究通過向?qū)m腔置入一次性子宮造影通水管獲得宮腔灌洗液，并檢測宮腔灌洗液中LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ 的濃度，結果顯示，RSA 患者宮腔灌洗液中LPS 含量可達（57.31±3.48）EU/L，顯著高于正常早孕女性，且RSA 患者宮腔灌洗液中促炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ 也均顯著高于正常早孕女性。提示與正常早孕女性相比，RSA 患者宮腔微環(huán)境發(fā)生改變，且宮腔灌洗液可以反映宮腔微環(huán)境。

研究表明，宮腔灌洗液中增多的LPS 可與子宮內(nèi)膜細胞膜上高表達的Toll 樣受體4 結合，激活信號通路，活化的Toll 樣受體信號通路誘導TNF-α、IL-2、IFN-γ 的分泌，導致宮腔呈現(xiàn)微炎癥狀態(tài)[6]。微炎癥狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜組織局部高水平TNF-α、IL-2的持續(xù)存在會呈現(xiàn)細胞毒性作用，破壞子宮內(nèi)膜結構與功能，致使胞飲突發(fā)育遲緩，降低子宮內(nèi)膜容受性，不利于受精卵著床[7-8]；且圍著床期，高濃度的TNF-α 會通過磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路抑制滋養(yǎng)細胞侵襲，導致滋養(yǎng)細胞侵襲程度不足[8-11]。而妊娠早期滋養(yǎng)細胞正常的侵襲遷移對母-胎循環(huán)成功建立十分重要，若侵襲程度不夠會導致胎盤淺著床，影響胚胎發(fā)育，易致流產(chǎn)發(fā)生[12-13]。本研究結果也顯示，RSA 患者宮腔灌洗液干預子宮內(nèi)膜細胞后，TNF-α、IL-2、IFN-γ mRNA 的表達均較正常早孕女性宮腔灌洗液干預后顯著升高；RSA 患者宮腔灌洗液干預絨毛外滋養(yǎng)細胞較正常早孕女性宮腔灌洗液干預后，侵襲細胞數(shù)目、細胞遷移面積均顯著降低。提示RSA 患者宮腔呈現(xiàn)微炎癥狀態(tài)，且宮腔微炎癥狀態(tài)下，絨毛外滋養(yǎng)細胞的侵襲遷移能力降低，不利于妊娠維持，從而導致RSA 的發(fā)生。

盡管RSA 發(fā)生的原因可能很多，但宮腔微環(huán)境的變化是影響胚胎著床與發(fā)育的最直接因素，其中宮腔菌群的改變可導致宮腔微環(huán)境變化，進而影響妊娠維持。本研究為RSA 的病因及防治提供了新的切入點。