覆蓋對連作半夏根際土壤微生物多樣性的影響

羅 敏，章文偉，徐 廣，羅 川，盧勝鄂，任星宇，鄧才富*

（1.重慶市藥物種植研究所 重慶 南川408400；2.重慶中醫(yī)藥學院，重慶 璧山402760）

半夏來源于天南星科（Araceae）植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.） Breit.］的干燥地下塊莖，是一味應用廣泛的大宗傳統(tǒng)中藥材，為我國藥材市場上的主流品種。半夏入藥歷史悠久，已有兩千多年的臨床用藥歷史，且倍受歷代醫(yī)家推崇。據(jù)中國醫(yī)學科學院統(tǒng)計，在558種傳統(tǒng)中藥處方中，半夏為最廣泛應用的30種中藥之一，其使用頻率居第22位［1］。

半夏野生資源近于枯竭，人工栽培雖在多省有發(fā)展，但多年連續(xù)種植半夏導致土壤環(huán)境惡化，人工種植發(fā)生嚴重的連作障礙，成為制約半夏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因。隨著栽種藥用植物年齡增加或重茬、連作，植物生長欠佳，中藥材質(zhì)量和產(chǎn)量大幅度下降，如三七、人參、當歸、地黃等［2-5］，已成為制約中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的老大難問題。目前緩解中藥材連作障礙的主要方法包括合理耕種模式、土壤管理及生物防治等。研究表明，通過調(diào)整根際微生態(tài)環(huán)境可以從根源上抑制病原菌的生長，從而緩解連作問題［6-8］。因此，本研究以連續(xù)種植2 年的半夏根際微生物為研究對象，探究覆蓋措施對半夏根際土壤微生物多樣性的影響，以期為尋求半夏連作障礙的緩解措施提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏種源購買自貴州省畢節(jié)市，經(jīng)重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定為天南星科植物半夏。

1.2 試驗設計

試驗地位于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)鐵橋種植基地，海拔620 m，前茬作物為厚皮菜。試驗設4 個處理：常規(guī)栽種（T1）、稻草覆蓋（T2）、玉米稈覆蓋（T3）、對照未栽種（CK），各3 次重復；每小區(qū)起壟栽種，壟寬1.3 m，長1.0 m，半夏行距15 cm，株距8 cm，覆土5 cm。第1年春季栽種，出苗、倒苗2次；第2年春出苗前實施覆蓋措施（年前未采挖，覆蓋前人工拔草），玉米稈（截成壟面寬度）、稻草密集在壟面覆蓋一層，約厚2 cm；大田管理同常規(guī)管理。供試土壤樣品為試驗地小區(qū)連作2 年的半夏根際土壤，于第2 年秋季采集；CK 于同地塊未栽種區(qū)五點法采集；土壤采集后撿去植物殘體等，裝入封口袋，避光存儲，帶回室內(nèi)分析。

1.3 T-RFLP分析

采用末端限制性片段長度片段多態(tài)性（T-RFLP）技術分析土壤細菌、真菌菌群結(jié)構，具體方法如下。

1.3.1 土壤微生物群落總DNA提取

采 用 Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene，Carlsbad， CA，USA）提取半夏根際土壤總DNA，方法參照試劑盒說明書。

1.3.2 土壤細菌16S rDNA及真菌ITS區(qū)PCR擴增

土壤細菌16S rDNA 擴增引物為27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’）與1492R（5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）［9］。反應體系：25 μL PCR Master Mix，1 μL DNA模板，引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，加入ddH2O 至終體積50 μL。反應程序：94℃預變性4 min，再94℃變性30 s，后55℃退火30 s，溫度72℃延伸1 min，共進行30 個循環(huán)，再72℃延伸10 min，最終于4℃恒溫保存。取2.0 μL PCR 擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc Documentation System， Bio-Rad， USA）拍照檢測。

土壤真菌ITS 區(qū)PCR 擴增引物為ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）與ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）［10］。 反應體系：25 μL PCR Master Mix，1 μL DNA 模板，引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，加入ddH2O 至終體積50 μL。反應程序：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，后55℃退火30 s，溫度72℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)，再72℃延伸10 min，最終于4℃恒溫保存。取2.0 μL PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像 系 統(tǒng)（Gel Doc Documentation System，Bio-Rad，USA）拍照檢測。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物酶切處理

細菌采用限制性內(nèi)切酶HhaI 和HaeⅢ對純化后的PCR 產(chǎn)物進行酶切。反應體系：限制性內(nèi)切酶（10 U）1 μL，相應緩沖液1 μL，PCR 產(chǎn)物7 μL，超純水補足至10 μL。反應條件：限制性內(nèi)切酶在37℃水浴中溫育12 h，酶切完畢后65℃水浴20 min 終止反應。真菌采用限制性內(nèi)切酶HhaI 對純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切。反應體系：限制性內(nèi)切酶（10 U）1 μL，相應緩沖液1 μL，PCR 產(chǎn)物7 μL，超純水補足至10 μL。反應條件：限制性內(nèi)切酶在37℃水浴中溫育12 h，酶切完畢后65℃水浴20 min 終止反應。將酶切產(chǎn)物送至擎科生物有限公司（成都）進行基因掃描測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)整理

選擇TRF 的一般原則是：峰高 ＞ 80，相對誤差不超過10%。T-RFLP 圖譜中限制性片段（T-RF）范圍細菌在35～550 bp，熒光值超過100 RFU，在平行試驗的圖譜中重復再現(xiàn)的峰納入統(tǒng)計分析，并去除OTU 豐度 ＜ 1%的T-RF。T-RFLP 圖譜中每1 個限制性片段（T-RF）為1 個OTU，T-RF 段大小 ± 1 bp 被認為是同一個OTU。

1.4 統(tǒng)計分析

T-RFLP 圖譜中OTU 的數(shù)目及其豐度用PCORD程序進行多樣性指數(shù)計算，包括多樣性指數(shù)（Shannon diversity，H）、均勻度指數(shù)（Shannon evenness，E）及豐富度指數(shù)（Species richness index，SR）［11］。土壤理化性質(zhì)、T-RFLP 測定結(jié)果均為3 次重復的平均值。使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計描述、方差分析（One-way ANOVA）、Duncan 檢驗和Pearson 相關分析。采用 CANOCO4.5 中的冗余法（Redundancy analysis， RDA）分析群落結(jié)構與土壤理化性質(zhì)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作半夏根際土壤細菌和真菌T-RFLP多態(tài)性分析

采用T-RFLP 技術對細菌群落結(jié)構分析如圖1所示。采用Hha I 和HaeⅢ 酶切得到5 種T-RFs 優(yōu)勢片段。常規(guī)栽種T1 處理170 bp、190 bp 菌種占優(yōu)勢地位；稻草覆蓋T2處理170 bp、214 bp菌種占優(yōu)勢地位；玉米稈覆蓋T3處理170 bp、190 bp 和214 bp 菌種占優(yōu)勢地位；未栽種CK 處理 214 bp 菌種占優(yōu)勢地位。與未栽種CK 相比較，連作后常規(guī)栽種T1 未出現(xiàn)214 bp 菌種，連作后214 bp 菌種消失了，而經(jīng)稻草覆蓋T2 和玉米稈覆蓋T3 處理后又出現(xiàn)該菌種，并成為優(yōu)勢菌種。

圖1 連作半夏不同措施下根際土壤細菌群落的T-RFLP多態(tài)性分析Fig.1 T-RFLP polymorphism analysis of rhizosphere soil bacterial community under different continuous cropping Pinellia ternata treatments

采用T-RFLP 技術對真菌群落結(jié)構分析如圖2所示。采用Hha I 酶切得到6 種T-RFs 優(yōu)勢片段。常規(guī)栽種T1處理317 bp菌種占優(yōu)勢地位，稻草覆蓋T2 處理214 bp 和317 bp 菌種占優(yōu)勢地位，玉米稈覆蓋T3處理317 bp、383 bp菌種占優(yōu)勢地位，未栽種區(qū)域CK處理214 bp 、383 bp菌種占優(yōu)勢地位。常規(guī)栽種T1、稻草覆蓋T2和玉米稈覆蓋T3均有317 bp菌種為優(yōu)勢菌種，與未栽種區(qū)域CK 相較，說明半夏連作后317 bp 菌種不斷繁殖擴大，逐漸成為優(yōu)勢菌種。而通過稻草覆蓋和玉米稈覆蓋之后，原優(yōu)勢菌種214 bp 和383 bp 菌種逐漸擴大并有占據(jù)優(yōu)勢的趨勢。

圖2 連作半夏不同措施下根際土壤真菌群落Hha I酶切的T-RFLP多態(tài)性分析Fig.2 T-RFLP polymorphism analysis of fungal community in rhizosphere soil under different measures of continuous cropping Pinellia ternata treatments

2.2 連作半夏根際土壤細菌和真菌多樣性分析

以T-RFLP 圖譜為基礎，連作半夏不同覆蓋措施下根際土壤細菌和真菌多樣性分析結(jié)果如表1和2 所示。由表1 可知，連作后常規(guī)栽種T1 與未栽種區(qū)域CK 相較，半夏連作2 年后其根際土壤細菌的Shannon 多樣性指數(shù)和均勻度均呈下降趨勢，但二者間差異不顯著。由表2 可知，連作后常規(guī)栽種T1與CK 相較，半夏連作2 年后其根際土壤真菌的Shannon 多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈上升趨勢，且連作后常規(guī)栽種T1的根際土壤真菌Shannon 多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均顯著高于未栽種區(qū)域CK（P＜ 0.05）。以上表明，半夏連作后其根際土壤細菌多樣性水平下降，土壤真菌多樣性水平升高，土壤微生物出現(xiàn)從細菌型向真菌型轉(zhuǎn)化的趨勢。

表1 連作半夏不同措施下根際土壤細菌多樣性指數(shù)Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil under different continuous cropping measures

表2 連作半夏不同措施下根際土壤真菌多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of fungi in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

比較不同覆蓋措施，土壤細菌多樣性和豐富度表現(xiàn)為T2 ＞ T3 ＞ CK ＞ T1，經(jīng)稻草和玉米稈覆蓋之后，連作半夏根際土壤細菌菌群的Shannon 多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)明顯升高，高于常規(guī)栽種T1和未栽種區(qū)域CK，且與常規(guī)栽種T1 間差異達顯著水平（P＜ 0.05）；而根際土壤真菌菌群的Shannon 多樣性指數(shù)表現(xiàn)為T1 ＞ T3 ＞ T2 ＞ CK，且稻草覆蓋T2 與玉米稈覆蓋T3 均顯著低于常規(guī)栽種T1。以上標明，通過覆蓋稻草或玉米稈后，連作半夏根際土壤微生物菌群發(fā)生了改變，細菌多樣性水平升高，真菌多樣性水平有所下降，逐漸調(diào)節(jié)了土壤微生物菌群的轉(zhuǎn)化趨勢。

2.3 連作半夏根際土壤細菌和真菌群落與土壤養(yǎng)分的關聯(lián)分析

運用RDA 分析進行不同處理半夏根際土壤細菌群落結(jié)構與土壤養(yǎng)分參數(shù)的相關性分析，獲得二者關系圖，如圖3 所示。冗余分析圖中箭頭表示環(huán)境因子，箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負相關性，箭頭連線長度代表某個環(huán)境因子與樣本分布相關程度的大小。連線越長，相關性越大，代表這個環(huán)境因子對研究對象的分布影響越大；反之越小。箭頭連線與排序軸的夾角代表著某個環(huán)境因子與排序軸的相關性大小，夾角越小，相關性越高；反之越低［12］。

圖3 連作半夏根際土壤細菌菌落與土壤養(yǎng)分的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of bacterial colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

分析結(jié)果顯示，第1 排序軸的特征值為0.751，第2排序軸特征值為0.024。由圖3可知，第1排序軸與N 關系最為密切，均達到極顯著水平（P＜ 0.01）。本試驗中N 對細菌群落結(jié)構的影響最顯著（P＜0.05，蒙特卡羅算法）。

運用RDA 分析進行不同處理半夏根際土壤真菌群落結(jié)構與環(huán)境參數(shù)的相關性分析，獲得二者關系圖，如圖4 所示。分析結(jié)果顯示，第1 排序軸的特征值為0.856，第2 排序軸特征值為0.009。由圖4 可知，第1 排序軸與N 關系最為密切，均達到極顯著水平（P＜ 0.01）。本試驗中N 對真菌群落結(jié)構的影響最顯著（P＜ 0.05）。

圖4 連作半夏根際土壤真菌菌落與土壤養(yǎng)分的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of fungi colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata

3 討論與結(jié)論

3.1 連作對半夏根際土壤細菌和真菌多樣性的影響

土壤微生物多樣性及其組成的改變會打破根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)功能，破壞土壤健康，土傳病害等加劇，進而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［13-15］。連作障礙的發(fā)生與根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡密切相關，長期連作可導致根際微生物群落結(jié)構和功能多樣性的改變［16，17］，且病原菌增加，益生菌減少，影響了土壤的生產(chǎn)力［16，18］。

本試驗結(jié)果表明，半夏連作后，其根際土壤細菌和真菌菌群的多樣性水平發(fā)生了變化，細菌的多樣性水平呈下降趨勢，而真菌的多樣性水平則呈現(xiàn)相反的變化趨勢。相關研究表明，連作會導致微生物區(qū)系組成發(fā)生變化，由細菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)變；細菌型土壤是土壤肥力提高的一個生物指標，而真菌型土壤是地力衰竭的一個標志［19］。隨著連作年限的增加，土壤質(zhì)量逐漸變差，細菌菌群結(jié)構簡單、多樣性水平下降，真菌則升高［20］。本試驗的研究結(jié)果與之相一致。由此可見，半夏連作改變了土壤細菌、真菌的菌群結(jié)構及多樣性水平，這可能是半夏連作障礙發(fā)生的主要原因之一。因此，進一步研究連作對土壤微生物功能及活性的影響，可為減緩連作障礙提供重要的科學依據(jù)。

3.2 覆蓋對連作半夏根際土壤細菌和真菌多樣性的影響

相關秸稈覆蓋的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不覆蓋的耕作方式相比，玉米秸稈覆蓋會改變土壤中微生物的種類和結(jié)構，改善土壤質(zhì)量，可在植物生長過程中持續(xù)提供營養(yǎng)物質(zhì)［21］；稻草覆蓋后土壤細菌豐富度和Shannon 多樣性指數(shù)增加，稻草覆蓋措施是增加土壤細菌多樣性的主要影響因素［22，23］，可顯著增加土壤微生物數(shù)量［24］。本研究覆蓋試驗結(jié)果表明，通過覆蓋玉米稈或者稻草后，連作半夏根際土壤微生物群落結(jié)構發(fā)生了改變，與連作后常規(guī)栽種相比較，細菌菌群的多樣性水平顯著提高，而真菌菌群多樣性水平明顯下降，這說明秸稈覆蓋措施對連作后土壤微生物菌群的改變具有一定調(diào)節(jié)作用，這一發(fā)現(xiàn)或許能夠為進一步研究連作障礙的緩解措施提供思路與前期基礎。另外，相關研究表明，土壤微生物群落與土壤氮含量呈極顯著相關［25］。本實驗中也發(fā)現(xiàn)土壤氮對根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構具有顯著影響，說明土壤氮是影響微生物生長和發(fā)育的重要因素，那么是否可以進一步研究土壤氮對微生物的影響機制，進而通過調(diào)節(jié)土壤氮含量來調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境，以此來緩解連作導致的土壤微生態(tài)失衡問題；以上推測將有待綜合多學科進行深入研究與解釋。

綜上所述，半夏連作后，根際土壤細菌多樣性水平下降，土壤真菌多樣性水平升高，土壤微生物出現(xiàn)從細菌型向真菌型轉(zhuǎn)化的趨勢；玉米稈或者稻草覆蓋對連作半夏土壤微生物菌群的改變具有一定調(diào)節(jié)作用，細菌多樣性水平顯著提高，真菌多樣性下降，且能夠恢復原優(yōu)勢菌種；秸稈覆蓋對連作土壤微生態(tài)失衡具有一定緩解效果；土壤中氮含量對根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構具有顯著影響，土壤氮是影響微生物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因素。