野生多花蘭的快速繁殖與保存

唐映紅，文 雯，李佳娜，龍 圓，陳建榮

（1.湖南文理學院 生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000；2.長沙學院 生物與化學工程學院，湖南 長沙 410022；3.常德市人工智能與生物醫(yī)藥研究中心，湖南 常德 415000；4.常德市農業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000）

多花蘭（Cymbidium floribundumLindl.）又稱蜜蜂蘭，是蘭科（Orchidaceae）蘭屬（CymbidiumSw.）的一種附生植物，是《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄二物種中的一員，是國家Ⅱ級保護野生植物，國內多花蘭主要分布在浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、海南、重慶、貴州、云南等地［1］。多花蘭葉革質肥厚，具有光澤，花芽易分化，花朵多達40 朵以上，色澤鮮艷，花期長，觀賞價值極高［2］。多花蘭根可作藥用，滋陰清肺，化痰止咳［3］。多花蘭株型、花朵數(shù)及花色等均有豐富的變異，能耐高溫和低溫，《國際蘭花新品種名錄（New Orchid Hybrids）》和國內發(fā)現(xiàn)的蘭屬原生種的雜交利用情況均顯示多花蘭雜種數(shù)量排在前5 名［4］，其在雜交育種中具有重要應用價值。然而，由于生境退化或喪失、砍伐或直接采挖等，實際的開發(fā)水平使多花蘭種群在過去10 年減少大于30%［1］，野生多花蘭植物資源急劇減少，加強野生多花蘭及其他蘭科植物的保護和種質資源的保存迫在眉睫［5］。

目前，我國栽培的國蘭品種絕大多數(shù)都是由野生種類引種馴化而來。蘭科以分株繁殖為主，但繁殖速度慢；蘭科種子很小，內含一些發(fā)育不完全的球形胚，無胚乳，自然狀態(tài)下很難萌發(fā)。自種子無菌萌發(fā)技術如建蘭［Cymbidium ensifolium（L.）Sw.］［6］、蕙蘭（Cymbidium faberiRolfe）［7］、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphroditeH.G.Reichenbach）［8］等獲得成功后，已建立起部分蘭科植物的快繁體系，部分品種已達到產業(yè)化生產階段，并已逐漸深入分子研究方面［9，10］。目前無多花蘭種質資源保存方案的報道，有關多花蘭種子無菌萌發(fā)和組織培養(yǎng)有少量報道，但培養(yǎng)基中除了添加植物生長調節(jié)劑，還多添加辣木（Moringa oleiferaLam.）葉汁、枸杞（Lycium chinenseMiller）葉汁、椰汁等營養(yǎng)劑［11，12］，或硝酸銀或香蕉（Musa nanaLour.）等［13］，或采用升汞消毒種子，加大了繁殖成本和環(huán)境污染。因此，本研究以獲得的一種野生多花蘭蒴果為材料，研究其種子無菌萌發(fā)、原球莖增殖和出芽、芽生根的培養(yǎng)方案，擬建立和優(yōu)化多花蘭快速繁殖體系，并利用組織培養(yǎng)技術進行常規(guī)繼代培養(yǎng)保存其種質資源，為多花蘭種苗工廠化生產、多花蘭科研者的野外回歸工作提供重要保障，對多花蘭野生資源的保護和保存具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野生多花蘭發(fā)現(xiàn)于湖南省桑植縣野外常綠闊葉林下（圖1A， B），由中南林業(yè)科技大學劉昂鑒定［14］，采其接近成熟且未開裂的蒴果（圖1C， D）為外植體。

1.2 方法

1.2.1 種子無菌萌發(fā)

將多花蘭蒴果用自來水沖洗后，先用75%乙醇浸泡3 min；再用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡10 min；然后無菌水浸泡沖洗6 次，每次1～2 min；最后用無菌濾紙吸干表面水分，將蒴果兩端切去，剖開果實，分成多份數(shù)量相同的種子，均勻撒在培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：花寶一號（Hyponex，HP） +4.00 g·L-1蛋白胨（Peptone） + 0.10 g·L-1活性炭（Activated carbon， AC） + 瓊脂（Agar），其中HP 有4 個水平：2.00、3.00、4.00 和5.00 g·L-1；瓊脂有2 個水平5.00 和7.00 g·L-1。每個處理4 次重復，隨機單位組設計，記錄種子的污染情況、萌發(fā)時間、萌發(fā)數(shù)量和種子形態(tài)變化。

1.2.2 原球莖增殖培養(yǎng)

以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，設計α-萘乙酸（α-Naphthalene acetic acid， NAA）、6-芐基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine， 6-BA）和水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate， LH）3 個因素，每個因素設4 個水平，NAA 濃度為0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA和LH 濃度均為0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，進行正交試驗，每個處理2次重復，隨機單位組設計。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計增殖率（%） = 增殖的原球莖個數(shù) / 接種的原球莖個數(shù) × 100。

1.2.3 原球莖分化出芽培養(yǎng)

以原球莖為材料、1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加NAA 濃度為0.01、0.50 和1.00 mg·L-1，6-BA 濃度為1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，每個處理3 次重復，隨機單位組設計。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計單個原球莖的出芽個數(shù)。

1.2.4 多花蘭種質資源的保存

將多花蘭原球莖分化出的芽，轉接到保存培養(yǎng)基中。以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基（含7.00 g·L-1瓊脂和20.00 g·L-1蔗糖），NAA 濃度為0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA 和LH 濃度均為0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，設計16 組試驗，每個處理2 次重復，隨機單位組設計。統(tǒng)計芽增殖倍數(shù) = 增殖后的芽個數(shù) / 接種的芽個數(shù)、芽生根率（%） = 生根的芽數(shù) / 接種的芽數(shù) × 100、芽生長高度。

1.2.5 培養(yǎng)條件

除特殊說明外，上述培養(yǎng)基中均含30.00 g·L-1蔗糖，5.00 g·L-1瓊脂，pH值為5.4～5.6，培養(yǎng)溫度25 ±1℃，光照時間為白天/黑夜12 h / 12 h，光照強度為1 000 Lx。種子萌發(fā)先置于黑暗下培養(yǎng)30 d 后，再轉入光照培養(yǎng)，光照強度為2 000 Lx。

1.2.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據用平均值±標準誤差表示，采用SPSS 26.0 軟件進行方差分析，采用新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對種子無菌萌發(fā)的影響

F 測驗結果顯示（表1），各因子的效應主次為HP ＞ 瓊脂，其中瓊脂的效應無顯著性。顯著性測驗顯示，HP 的4 個水平差異顯著，以3.00 g·L-1種子萌發(fā)效果最佳，種子萌發(fā)數(shù)量為43.88，顯著高于其他水平，其他3 個水平之間無顯著差異。HP 與瓊脂存在互作，以處理組3種子萌發(fā)效果最佳，最適培養(yǎng)基為：3.00 g·L-1HP + 4.00 g·L-1蛋白胨 + 0.10 g·L-1AC +5.00 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)60 d 后種子萌發(fā)數(shù)量為55.25（萌發(fā)率約55.00%）（表2）。乳白色種子膨大形成淺綠色或深綠色的圓球（圖1E），然后將圓球轉移到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d 后，大部分綠色圓球形成愈傷組織（圖1F）或原球莖（圖1G）。

表1 不同培養(yǎng)基對種子無菌萌發(fā)的方差分析Tab.1 Variance analysis of different medium on aseptic germination of seeds

表2 不同培養(yǎng)基對種子無菌萌發(fā)的影響（培養(yǎng)60 d）Tab.2 Effects of different medium on aseptic germination of seeds（60 d）

2.2 不同激素及其配比對原球莖增殖的影響

F 測驗結果顯示（表3），各因子的效應主次為NAA ＞ 6-BA ＞ LH，各因子的效果均極顯著。

表3 6-BA、NAA和LH對原球莖增殖的方差分析Tab.3 Variance analysis of NAA， 6-BA and LH on protocorm proliferation

各效應顯著性測驗顯示，NAA、6-BA 和LH 的4個水平均差異顯著，均以1.00 mg·L-1增殖效果最好，顯著高于其他水平（表4）。不同激素濃度配比間產生正互作使得增殖率升高，以處理組9增殖率最高，達94.00%，顯著高于其他處理組（表5），且原球莖基部膨大，原球莖增殖明顯、較大且緊促（圖2A）。其次為處理組11，增殖率約81.50%，且個別原球莖有少量出芽（圖2B）。不同激素濃度配比間產生負互作使得增殖率下降，處理組8 僅為1.25%，僅1/2 MS培養(yǎng)基則無增殖（圖2C）。綜上所述，多花蘭原球莖增殖的最適培養(yǎng)基為：1/2 MS + 1.00 mg·L-1NAA +2.00 g·L-1LH，培養(yǎng)30 d增殖率達94.00%。

圖2 多花蘭原球莖增殖培養(yǎng)Fig.2 Propagation culture of protocorm of C. floribundum

2.3 6-BA 和NAA 及其配比對原球莖分化出芽的影響

根據前期原球莖增殖有出芽情況的研究基礎，設計6-BA和NAA 2個因素3個水平的原球莖分化出芽培養(yǎng)方案。F測驗結果顯示（表6），各因子的效應主次為NAA ＞ 6-BA，其中6-BA的效應無顯著性。

表6 6-BA和NAA對原球莖分化出芽的方差分析Tab.6 Variance analysis of NAA and 6-BA on protocorm budding

顯著性測驗顯示，NAA的3個水平差異顯著，對原球莖分化出芽的效果呈先增后減的趨勢，以0.50 mg·L-1出芽效果最好，單個原球莖分化約5 個芽，顯著高于其他水平。6-BA 和NAA 之間存在互作效應，以處理組4分化出的芽數(shù)最多，單個原球莖分化約8個芽（表7）。綜上所述，多花蘭原球莖分化出芽的最適培養(yǎng)基為：1/2 MS + 0.50 mg·L-1NAA +1.00 mg·L-16-BA，培養(yǎng)7 d 后，單個原球莖同時分化出多個芽點（圖3A），培養(yǎng)30 d 后，芽伸長約1～2 cm（圖3B）。培養(yǎng)30 d后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，原球莖增殖并不斷分化出新的芽，芽葉片展開（圖3C）。

圖3 多花蘭原球莖分化出芽的培養(yǎng)過程Fig.3 Process of protocorm differentiation and budding of C.floribundum

表7 不同培養(yǎng)基對原球莖分化出芽的影響（培養(yǎng)30 d）Tab.7 Effects of different media on protocorm budding（30 d）

2.4 多花蘭種質資源的保存研究

不同處理對芽生根、增殖和伸長均表現(xiàn)出極顯著。培養(yǎng)5 個月后，處理13 對芽生根和伸長效果均較好，芽生根率為92.50%、芽增殖倍數(shù)約為8.50、芽伸長約4.35 cm；處理9 芽增殖效果最好，增殖倍數(shù)約為9.07。僅1/2 MS 的培養(yǎng)基芽生根率和芽伸長均是最低的，且無芽增殖情況（表8）。因此，綜合考慮，選擇多花蘭組培苗保存的最適培養(yǎng)基為1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA。將單個芽（圖4A）接種在最適保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前3 個月，芽生長較快，芽伸長4 cm 左右，之后開始出現(xiàn)根點（圖4B），芽增殖和伸長較慢，根點不斷伸長，培養(yǎng)5 個月之后根伸長約1 cm，根呈乳白色或淺綠色（圖4C）。直至6 個月后組培苗因營養(yǎng)不夠的原因，開始慢慢褐化死亡，因此6 個月后應及時更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)保存組培苗。此外，最適保存培養(yǎng)基中加入1.00 g·L-1AC 時，芽增殖和生根率基本保存不變，但芽生根時間縮短為30 d，基部形成的根較長，呈深綠色（圖4D）。

圖4 多花蘭種質資源的保存Fig.4 Conservation of Germplasm Resources of C. floribundum

3 討論

從古至今，我國栽培蘭花已有2000 年的歷史，盡管歷史悠久，但由于某些蘭花的人工栽培體系至今還不成熟，所以對蘭花的利用基本仍是從自然界直接索取獲得。因此，加強對蘭科植物的研究至關重要［15］。根據蘭花產業(yè)化發(fā)展的需求，著重從種質資源創(chuàng)新和產業(yè)化生產關鍵技術兩個方面開展工作，通過組織培養(yǎng)技術培育和保存種質資源是一種有效的方式［16］。目前已經有70 個屬的蘭花植物可采用組織培養(yǎng)技術進行快速繁殖，大量洋蘭的組織培養(yǎng)和工廠化得到了發(fā)展，部分國蘭也在組織培養(yǎng)方面的研究取得了很大的成功［15］。有關多花蘭組織培養(yǎng)研究報道較早，其野生種質資源的快速繁殖缺乏研究報道。本研究從種子的無菌萌發(fā)到獲得組培苗進行快速繁殖。多花蘭種子從接種到胚開始轉綠的培養(yǎng)時間為60 d，相比唐鳳鸞等［17］研究的多花蘭種子萌發(fā)時間縮短30 d 左右、萌發(fā)率差異不大。值得注意的是本研究多花蘭原球莖分化出芽途徑是小球體經原球莖發(fā)育成小苗，與冬鳳蘭（Cymbidium dayanumRchb.F）和多花脆蘭等類似，但比多花脆蘭［Acampe rigida（Buch.-Ham.ex J.E.Smith） P.F.Hunt］形成小球體（40～45 d）培養(yǎng)時間短［18］，不同于其他大多數(shù)蘭科的根狀莖分化出芽途徑。最優(yōu)多花蘭增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d 后的原球莖增殖率為90.00%（增殖倍數(shù)約9），相比已報道的多花蘭原球莖增殖培養(yǎng)基，如：王鄭昊等［11］培養(yǎng)90 d增殖倍數(shù)5.50、唐鳳鸞等［17］培養(yǎng)的增殖倍數(shù)6.5倍/60 d、丁長春等［13］培養(yǎng)的增殖率82.00%/60 d，本研究在增殖倍數(shù)和增殖時間上得到明顯優(yōu)化。本研究獲得的最優(yōu)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d左右生根率達92.50%，比唐鳳鸞等［17］培養(yǎng)50 d生根率100%的生根時間要縮短較多。

蘭科種質資源的保存主要有栽培保存、離體保存（無菌保存）、花藥、種子和DNA 保存等形式［21］，有低溫、玻璃化保存等技術［22，23］。但不管哪種保存形式都有其優(yōu)點和缺陷，較為理性的的保存方式則是結合栽培保存和離體保存，通過栽培保存的方式為離體保存提供穩(wěn)定保存品種特性的材料，為離體保存材料的更新提供保障；通過離體保存節(jié)約種質資源圃所需要的空間、人員等投入，同時也能夠為所栽培的種質材料提供更新?lián)Q代的材料［21］。目前關于多花蘭種質資源的保存缺乏報道。本研究獲得的保存培養(yǎng)基1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA（含7g·L-1瓊脂和20 g·L-1蔗糖），不同于與大多數(shù)其他蘭科的保存培養(yǎng)基，如鐵皮石斛（Dendrobium candidumLindl.）、苞舌蘭（Spathoglottis pubescensLindl.）使用1/2 MS，獨蒜蘭［Pleione bulbocodioides（Franch.） Rolfe］則為MS + 1 mg/L BA + 2 mg/L NAA + 0.5 g/L AC［22］。

此外，本研究篩選的培養(yǎng)基僅使用基本培養(yǎng)基添加6-BA、NAA 和/或LH［24］，相比其他研究中除了添加植物生長調節(jié)劑外，還不同程度的添加了馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）水煮液、硝酸鑭、硝酸銀、椰乳、椰汁和活性炭等其他試劑［2，11，13，17］，大大減少了繁育成本。

4 結論

綜上所述，一方面，相比已報道的其他蘭科的組培快繁技術，本研究建立的多花蘭組培快繁體系，在種子萌發(fā)、原球莖增殖和分化出芽、芽生根等的時間和數(shù)量上均得到一定的優(yōu)化，從種子萌發(fā)到獲得大量組培苗僅需120 d左右，種子萌發(fā)途徑也不同于大多數(shù)蘭科，大大減少了繁育成本，降低了對環(huán)境的污染，為多花蘭種苗工廠化生產提供依據。另一方面，獲得了多花蘭叢生芽同時緩慢生長、增殖和生根的培養(yǎng)方案，能夠保證1顆叢生芽在50 mL培養(yǎng)基中生長6 個月左右，并獲得約10 棵的多花蘭組培苗，保證了多花蘭種質資源的長期保存，對多花蘭野生資源的保護和保存具有重要意義。