苦瓜多糖和皂苷對秀麗隱桿線蟲脂代謝的調(diào)節(jié)作用

賈董浩,周心雨,詹恩琪,歐陽子安,祝 瑩

江蘇大學 食品與生物工程學院 (鎮(zhèn)江 212013)

隨著人民生活水平的提高,高糖高脂食物攝入偏多,導致肥胖人口比例顯著增高。肥胖不僅影響著人體的身心發(fā)育,還可能引發(fā)高血壓、高血脂、心血管疾病、脂肪肝和糖尿病等多種慢性疾病[1]。但長期服用降脂藥物的會產(chǎn)生肝功能損害等毒副作用。因此,從天然作物中探索具有防治脂代謝異常的有效成分將具有重要意義。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)含有多糖、皂苷、多肽、類黃酮以及生物堿等活性成分,長期以來作為一種藥食同源的食品被用來預防和改善肥胖、糖尿病等代謝綜合征[2]?？喙隙嗵鞘且环N苦瓜中重要的生理活性成分[3]。已有研究表明,苦瓜多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降膽固醇、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]?？喙显碥帐且环N植物糖苷,存在于苦瓜的根、莖、葉及果實中,以三萜皂苷為主,具有調(diào)脂降糖的作用[5]。但對于苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合改善脂代謝、緩解脂質(zhì)沉積的研究較少,為了對苦瓜資源的開發(fā)提供更科學的數(shù)據(jù),可深入研究其活性成分聯(lián)合降脂活性。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種非寄生、可獨立生存且無毒無害的線蟲,具有結(jié)構(gòu)簡單、遺傳信息清楚、基因組測序完成、生長周期短、繁殖量大、易于培養(yǎng)觀察、無害等特點[6]。線蟲脂代謝通路被證實與人類高度相似,且關(guān)鍵調(diào)控基因相似度極高,是一種優(yōu)良的模式生物。線蟲脂代謝調(diào)控的核心通路有胰島素信號通路和 TGF-β信號通路、核激素受體介導的信號通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 SREBP 調(diào)節(jié)的信號通路、5-羥色胺介導的信號通路等[7]。

因此,本實驗旨在利用添加葡萄糖建立秀麗隱桿線蟲肥胖模型,探討苦瓜多糖與苦瓜皂苷聯(lián)合作用對秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)沉積的影響,并探究苦瓜多糖與皂苷調(diào)節(jié)脂代謝是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜,購自揚中綠健苦瓜種植基地;線蟲 N2野生型菌株、大腸桿菌E.coliOP50,實驗室保存。

油紅O染色液,購于上海生工生物工程有限公司;甘油三酯(TG)和蛋白檢測試劑盒,購于南京建成生物工程研究所;其他生化試劑,購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

體視顯微鏡,南京江南永新光學有限公司;多功能酶標儀,賽默飛世爾科技;正置顯微鏡,尼康光學儀器(中國)有限公司;線蟲培養(yǎng)箱,上海一恒有限公司;FD-8型真空冷凍干燥機,北京博醫(yī)康有限公司;超凈臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1苦瓜多糖和苦瓜皂苷的制備

苦瓜多糖的提取:采用熱水浸提-乙醇沉淀的經(jīng)典方法。稱取25 g苦瓜凍干粉,95%乙醇回流2 h得濾渣,濾渣經(jīng)90 ℃熱水浸提3次,收集濾液,濃縮后采用Sevage法除蛋白,經(jīng)醇沉、透析、凍干后即得苦瓜多糖(BPS)。

苦瓜皂苷的提取:稱取苦瓜凍干粉100 g,石油醚脫脂,殘渣加入75%乙醇80 ℃回流提取2次,收集濾液,用水飽和的正丁醇萃取3 次,取正丁醇相濃縮至呈褐色粘稠狀時冷卻,甲醇溶解后加入丙酮充分攪拌使之產(chǎn)生沉淀,離心,重復2 次,冷凍干燥得到苦瓜皂苷(BMS)。

1.3.2線蟲培養(yǎng)

線蟲以大腸桿菌OP50 為食,在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

線蟲同步化處理:用M9 緩沖液將處于產(chǎn)卵期的線蟲清洗至EP 管中,離心棄上清,再加入M9 緩沖液清洗兩遍。洗凈之后加入裂解液(0.5 mol/L NaOH 溶液和體積分數(shù)2.5% NaClO),渦旋震蕩。線蟲裂解充分后,離心棄上清,M9 緩沖液反復清洗3 次,將蟲卵轉(zhuǎn)移至20 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜得L1 期幼蟲,待試驗所用。

1.3.3模型的建立及試驗分組

配置含100 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基,將同步化處理的L1期線蟲轉(zhuǎn)到高糖培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48 h,即可建立肥胖線蟲模型[8]。試驗分為正常組、模型組、BPS組(1 000 μg/mL BPS)、BMS組(100 μg/mL BMS)、BPS+BMS組(500 μg/mL BPS和50 μg/mL BMS),將BPS和BMS分別與大腸桿菌OP50菌液1∶1混勻,在高糖培養(yǎng)皿中加入混合液100 μL/個,將處于L1期幼蟲轉(zhuǎn)到各組NGM培養(yǎng)皿上,恒溫培養(yǎng)48 h,即可進行試驗處理。

1.3.4線蟲體長和體寬的測定

BPS和BMS處理線蟲48 h 后,隨機挑取30條左右線蟲到M9緩沖液中,60%異丙醇固定后,采用正置顯微鏡拍照,并用Image J對線蟲體長和體寬進行定量。

1.3.5線蟲運動指標的測定

BPS和BMS處理線蟲48 h 后,參考白娟等[9]的方法測定頭部擺動頻率和身體彎曲頻率。頭部擺動頻率:記錄1 min 內(nèi)線蟲頭部擺動次數(shù),一個往返為擺動1次;身體彎曲頻率:記錄1 min 內(nèi)線蟲身體彎曲次數(shù),假設(shè)以咽泵的方向規(guī)定為y軸,在爬行過程中,線蟲身體沿著x軸方向完成1次正弦運動即為1個身體彎曲。每組測定30 條線蟲。

1.3.6油紅O染色

M9 緩沖液收集BPS和BMS處理48 h 后的線蟲,離心棄上清,加入60%異丙醇脫水固定,離心棄上清,加入500 μL 油紅O 染色液,室溫避光震蕩6～18 h后離心棄上清,加入0.01%Triton-X100,在正置顯微鏡下拍照。

1.3.7甘油三酯含量測定

BPS和BMS 處理同步化L1 線蟲48 h 后,用M9 緩沖液洗線蟲3 遍,自然沉降,棄上清,加入適量M9 重懸,超聲破碎后離心取上清液。根據(jù)甘油三酯試劑盒說明書測定含量,蛋白質(zhì)含量根據(jù)Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定。每組3 個平行試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果用平均值±標準誤差表示。采用ANOVA 單因素方差分析比較多組間的差異顯著性,p<0.05 為具有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦瓜多糖和皂苷對線蟲體長和體寬的影響

秀麗隱桿線蟲的基礎(chǔ)生理指標如體長、體寬會受到食物和生長環(huán)境的影響,可反映其生長狀態(tài)[10]。圖1展示的是苦瓜多糖和皂苷添加后對線蟲體長和體寬的影響。從圖1(a)可知,添加葡萄糖后,線蟲的體長顯著高于正常組(p<0.05),可能是因為高糖環(huán)境刺激了線蟲,導致體長應激性增加?？喙显碥仗砑雍?線蟲體長顯著減小(p<0.05),但苦瓜多糖不能降低高糖誘導的線蟲體長增加;苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合作用后,線蟲的體長有減小的趨勢,與正常組線蟲無顯著差異,說明苦瓜多糖和皂苷對線蟲的生長無抑制作用。從圖1(b)可知,添加葡萄糖后,線蟲的體寬顯著增加,而苦瓜多糖和苦瓜皂苷單獨添加或聯(lián)合添加均能降低線蟲的體寬,且與模型組具有顯著差異。結(jié)果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效地降低線蟲的體寬,且具有一定協(xié)同作用。

圖1 苦瓜多糖和皂苷對線蟲體長和體寬的影響

2.2 苦瓜多糖和皂苷對線蟲運動行為的影響

線蟲的頭部擺動和身體彎曲是考查其運動能力的重要指標,而線蟲的運動能力可以反映其能量消耗的情況[11]。從圖2(a)中可看出,各組線蟲的頭部擺動頻率無較大差異,但模型組頭部擺動頻率略低于正常組;而添加苦瓜多糖、苦瓜皂苷培養(yǎng)的線蟲頭部擺動頻率均高于模型組。如圖2(b)所示,各組線蟲的身體彎曲頻率有一定差異,其中模型組線蟲身體彎曲頻率與正常組相比也有降低的趨勢,但無顯著差異(p>0.05);添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷培養(yǎng)的線蟲身體彎曲頻率均顯示出高于模型組的現(xiàn)象,且苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合添加的線蟲身體彎曲頻率的升高最為顯著(25.79 次數(shù)/min 對比 18.42 次數(shù)/min)(p<0.05)。以上結(jié)果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能通過增加線蟲運動行為增加能量消耗,且二者聯(lián)合添加時效果最優(yōu),具有協(xié)同增加線蟲能量消耗的作用。預示苦瓜多糖和皂苷可能具有協(xié)同調(diào)節(jié)脂代謝的作用。

圖2 苦瓜多糖和皂苷對線蟲運動行為的影響

2.3 苦瓜多糖和皂苷對線蟲脂肪沉積的影響

秀麗隱桿線蟲的脂肪主要位于皮下組織及腸道,呈脂滴狀。脂溶性染料油紅O可特異性地附著于中性脂肪分子而使其呈現(xiàn)紅色,因此可直接觀察到線蟲體內(nèi)脂肪沉積的情況。通過油紅O染色,可以初步判斷脂肪沉積情況。如圖3所示,與正常組相比,模型組線蟲體內(nèi)紅色較深且染色面積較大。BPS100組和BMS100組體內(nèi)紅色均變淺,BPS+BMS組體內(nèi)紅色較淺且染色面積較小。通過Image J軟件進一步分析油紅O染色圖像,測定線蟲脂肪占比,可以較為準確的分析功能成分對線蟲的脂肪沉積影響。從圖4可以看出,模型組的相對脂肪含量相較正常組有顯著增加(54.24% 對比62.88%);經(jīng)過苦瓜多糖和皂苷處理后的線蟲相對脂肪含量較模型組均顯著降低(p<0.05),其中苦瓜皂苷處理過的線蟲相對脂肪含量降低最明顯(55.80%對比62.88%)。這表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效減少線蟲體內(nèi)的脂肪沉積,且苦瓜多糖和皂苷可以聯(lián)合降低線蟲體內(nèi)脂肪沉積。

圖3 線蟲油紅O染色圖

圖4 苦瓜多糖和皂苷對線蟲脂肪沉積的影響

2.4 苦瓜多糖和皂苷對線蟲甘油三酯含量的影響

油紅O染色結(jié)果已顯示苦瓜多糖和皂苷可以協(xié)同降低高糖誘導的肥胖線蟲體內(nèi)的脂肪沉積,為進一步研究苦瓜多糖和皂苷的協(xié)同降脂作用,我們繼續(xù)測定線蟲體內(nèi)甘油三酯水平。如圖5所示,模型組線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量明顯高于正常組(0.82 mg/gprot 對比 1.69 mg/gprot),而添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷后線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量均不同程度地低于模型組(p<0.05),且添加BPS+BMS組線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量最低(0.52 mg/gprot)。線蟲體內(nèi)甘油三酯含量的變化與線蟲脂肪沉積的結(jié)果一致,均表明苦瓜多糖和皂苷可以協(xié)同調(diào)節(jié)線蟲脂代謝。前期研究表明,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能調(diào)節(jié)HepG2細胞和線蟲的脂代謝[4-5],而本研究進一步證實了苦瓜多糖和皂苷可以發(fā)揮協(xié)同降脂作用。

圖5 苦瓜多糖和皂苷對線蟲甘油三酯含量的影響

3 結(jié)論

綜上所述,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均對N2野生型線蟲的生長無抑制作用,且能降低線蟲的體寬、增加身體彎曲頻率,具有一定的協(xié)同作用;同時還能減少N2野生型線蟲體內(nèi)的脂肪堆積,降低體內(nèi)的甘油三酯含量,且二者聯(lián)合添加時效果最優(yōu),具有協(xié)同調(diào)節(jié)脂代謝的作用。研究結(jié)果為我們開發(fā)以苦瓜為主要成分的降脂功能食品提供了依據(jù)。