靜脈導(dǎo)管用的涂層改性硅橡膠材料制備及應(yīng)用效果

趙 素,王茜茜,姚 瑤,王 婷

(瀘州市人民醫(yī)院,四川 瀘州 646000)

靜脈導(dǎo)管作為現(xiàn)代最常用的一種介入型醫(yī)用器械,對(duì)材料的要求也更加嚴(yán)苛。硅橡膠由于其良好的生物相容性,高度的生物惰性,超疏水和柔軟易變形等性質(zhì),是較為重要的導(dǎo)管制作材料之一。但由于硅橡膠極易吸附細(xì)菌的特性,當(dāng)其作為植入性材料使用時(shí),易在人體內(nèi)造成細(xì)菌感染,造成一些不好的結(jié)果。這就使得硅橡膠的使用受到了很大的限制。尋找一種適合的醫(yī)用導(dǎo)管材料是目前醫(yī)學(xué)鄰域較為重要的研究,基于此,試驗(yàn)以王立蓉[5]論文中的方法為參考,制備了一種新型功能涂層對(duì)硅橡膠進(jìn)行改性,提升硅橡膠的抗菌性和生物安全性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

主要材料:丙酮(AR),前衍化學(xué);無水乙醇(AR),銘信化工;硅橡膠(生物級(jí) 達(dá)澤希新材料 );TRIS(AR),德諾弘成化工;稀鹽酸(AR),漢羽化工;戊二醛(AR),翰月化工;乙酸(AR),乾耀科技;殼聚糖(AR),亞圖生物科技;多巴胺(AR),凱新生物;硫酸銅(AR),眾成化工。

主要設(shè)備:TP-50C型搖床(靳瀾儀器);ZEM15型掃描電鏡(澤鏡科技);HM-3020型紅外光譜儀(恒美電子科技);6880型ICP-MS(美析儀器);YK-SY96A 型酶標(biāo)儀(云科智能科技)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1硅橡膠預(yù)處理

(1)提前將硅橡膠制成面積為1×1 cm,厚度為2 mm的片狀,然后通過去離子水進(jìn)行超聲清洗,清洗時(shí)間和次數(shù)分別為20 min和 2次。依次用丙酮和無水乙醇進(jìn)行超聲清洗,清洗時(shí)間分別為5、20 min,清洗次數(shù)均為2次;

(2)將在100 mL蒸餾水中溶入0.121 14 gTRIS,通過HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5,得到濃度為1 mol/L的 Tris-HCI 溶液;

(3)將20 mg多巴胺粉末溶于10 mL“步驟(2)”配制溶液中,充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的多巴胺溶液;

(4)將硅橡膠放入“步驟(3)”制備的多巴胺溶液中浸泡,然后在TP-50C型搖床的作用下進(jìn)行振蕩,振蕩時(shí)間為48 h。倒出反應(yīng)液后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行超聲清洗3 min;

(5)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中浸泡樣品1 d,沖洗干凈后自然晾干。

1.2.2功能涂層的制備

(1)將0.602 5 g殼聚糖溶入40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的乙酸水溶液中;

(2)在5 mL蒸餾水中溶入0.060 7 g硫酸銅粉末,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的硫酸銅溶液;

(3)按照不同的體積比混合殼聚糖溶液和硫酸銅溶液,并調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5,具體配比如表1所示;

表1 功能涂層配比設(shè)計(jì)

(4)將制備涂層通過浸提法覆涂在硅橡膠材料上,自然晾干后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干,烘干溫度和時(shí)間分別為40 ℃和6 h。

1.3 性能測試

1.3.1微觀形貌

通過掃描電鏡觀察材料的微觀形貌。

1.3.2紅外光譜

通過紅外光譜儀分析材料的官能團(tuán)。

1.3.3抗菌性測試

參照ISO 10993—5:2009標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行抗菌性能測定[6-7]。

抗菌率表達(dá)式為:

N=C×d×1000/1

(1)

R=(Nc-Nm)/Nc×100%

(2)

式中:N為樣品表面菌液濃度,CFU/mL;R為抗菌率,%;Nc為對(duì)照組平均菌落數(shù);Nm為實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù);C為每種樣品表面平均菌落數(shù);d為稀釋倍數(shù)。

1.3.4抗菌持久性測試

參照GB/T 16886.12—2005/ISO10993—12:2005進(jìn)行試驗(yàn)[8-9]。

1.3.5細(xì)菌粘附試驗(yàn)

將樣品與50 μL濃度為107CFU/mL的菌液共同培養(yǎng),培養(yǎng)溫度和時(shí)間分別為37 ℃和24 h。取出樣品并用PBS進(jìn)行清洗后,通過1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,固定溫度和時(shí)間分別為4 ℃和4 h。經(jīng)過乙醇對(duì)固定后的樣品進(jìn)行脫水,然后常溫放置過夜,噴金后通過掃描電鏡對(duì)細(xì)菌粘附情況進(jìn)行觀察。

1.3.6銅離子溶出試驗(yàn)

參照ISO 10993—12 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)[10]。先將樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液中浸泡一段時(shí)間,然后通過ICP-MS6880型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對(duì)浸出液中銅離子濃度進(jìn)行測試。

1.3.7細(xì)胞毒性試驗(yàn)

通過細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性,一般來說,RGR超過75%即可認(rèn)定該材料符合植入標(biāo)準(zhǔn)要求[11-12]。

細(xì)胞相對(duì)增值率表達(dá)式:

RGR=OD實(shí)/OD對(duì)×100%

(3)

式中:RGR為細(xì)胞相對(duì)增殖率,%;OD實(shí)、OD對(duì)為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組酶標(biāo)儀在450 nm 波長的 OD 值。

1.3.8細(xì)胞遷移試驗(yàn)

通過Transwell 實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞遷移能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 官能團(tuán)結(jié)構(gòu)表征

圖1為紅外光譜結(jié)果。

圖1 紅外光譜測試結(jié)果

由圖1可知,CS/Cu復(fù)合功能涂層中,在1 636.3 cm-1和 636.6 cm-1處存在屬于CS的NH2特征峰。同時(shí),羥基的吸收峰發(fā)生紅移,這是由于殼聚糖與銅離子發(fā)生配位反應(yīng)后,銅取代部分羥基上的氫引起的。而C—O 鍵的振動(dòng)吸收峰發(fā)生藍(lán)移,這是C—O—Cu 鍵合引起的官能團(tuán)變化[14-17]。綜上,銅離子與殼聚糖上的活性基團(tuán)成功發(fā)生配位反應(yīng),即成功制備出了CS/Cu復(fù)合功能涂層。

2.2 抗菌性能研究

2.2.1抗菌性能測試結(jié)果

圖2為抗菌性能測試結(jié)果。

(a)接觸24 h后抗菌作用結(jié)果

由圖2可知,單一CS涂層具備一定的抗菌效果,抗菌率約為65%。而CS/Cu復(fù)合功能涂層對(duì)兩種細(xì)菌抗菌率均達(dá)到了95%以上,表現(xiàn)出良好的抗菌效果。

2.2.2抗菌持久率測試結(jié)果

將樣品經(jīng)過生理鹽水浸泡不同時(shí)間后,再與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)1 d,表征涂層的抗菌持久率,結(jié)果見圖3。

(a)抗菌作用結(jié)果

由圖3可知,經(jīng)過生理鹽水浸泡后,CS/Cu復(fù)合功能涂層的抗菌性幾乎不受影響,對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率仍舊超過95%。這說明生理鹽水浸泡不會(huì)對(duì)CS/Cu復(fù)合功能涂層的抗菌性產(chǎn)生影響,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌持久性。

2.2.3銅離子溶出試驗(yàn)結(jié)果

通過浸提液中銅離子累積釋放曲線對(duì)銅離子溶出情況進(jìn)行表征,結(jié)果見圖4。

圖4 銅離子溶出情況

由圖4可知,隨浸泡時(shí)間的增加,浸提液中銅離子的釋放量也有一定增加。同時(shí)還從圖4中觀察到,當(dāng)CS/Cu復(fù)合功能涂層中含銅量較多時(shí),銅離子的釋放量也隨之增加。當(dāng)CS/Cu復(fù)合功能涂層中CS∶Cu比例為100∶1時(shí),銅離子溶出量基本不變。而CS∶Cu比例為10∶1時(shí),28 d銅溶出量超過220 mg/L。

2.3 生物安全性試驗(yàn)結(jié)果

由于試驗(yàn)制備的材料主要用于靜脈導(dǎo)管,因此需要對(duì)其生物相容性和生物穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果見圖5。

(a)涂層與 HUVECs 細(xì)胞共同培養(yǎng)

由圖5(a)可知,涂層與 HUVECs 細(xì)胞共同培養(yǎng)后,細(xì)胞濃度并未發(fā)生較明顯的變化,這就說明內(nèi)皮細(xì)胞可以很好的作用于涂層表面,也就是說制備的涂層表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性,并未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。由圖5(b)、(c)可觀察到,浸提液與 HUVECs 和 HUSMCs 細(xì)胞共同培養(yǎng)后,細(xì)胞濃度并沒有出現(xiàn)較大的變化,這就說明涂層浸提液中的銅離子不對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制或者促進(jìn)作用。以上結(jié)論證明了試驗(yàn)研究的3種配比功能涂層浸提液中,銅離子濃度均在生物安全范圍內(nèi),可以作為生物植入材料使用[18-20]。

3 結(jié)語

(1)紅外光譜結(jié)果表明,CS/Cu復(fù)合功能涂層中,銅取代部分羥基上的氫引起羥基的吸收峰發(fā)生紅移,C—O 鍵特征峰藍(lán)移,證明成功制備出CS/Cu復(fù)合功能涂層;

(2)抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明,CS/Cu復(fù)合功能涂層對(duì)對(duì)細(xì)菌的抑菌率超過95%,抗菌效果良好;

(3)生理鹽水浸泡后,CS/Cu復(fù)合功能涂層的抗菌性幾乎不受影響,對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率仍舊超過95%,表現(xiàn)出良好的抗菌持久性;

(4)CS/Cu復(fù)合功能涂層表面附著的細(xì)菌數(shù)量明顯減少,且細(xì)菌的分布較為零散。同時(shí),部分細(xì)菌出現(xiàn)皺縮,塌陷,細(xì)胞壁破口的現(xiàn)象。證明銅離子能很好的抑制細(xì)菌的生長,表現(xiàn)出很好的抑菌性;

(5)當(dāng)CS/Cu復(fù)合功能涂層中CS∶Cu比例為100∶1時(shí),銅離子溶出量變化較小。