嵌合抗原受體T細胞治療結腸癌的研究進展

龍赤榮 張 露 彭 上 閔靜婷 李正紅

蚌埠醫(yī)學院1.基礎醫(yī)學院；2.生命科學學院，安徽 蚌埠 233030

結腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤之一，是世界上第三大發(fā)病和第二大致命的癌癥[1］。化療、放療或手術是大多數(shù)癌癥患者的治療選擇[2］，然而，傳統(tǒng)療法沒有表現(xiàn)出很好的治療效果。嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法是目前有效的血液惡性腫瘤治療方式之一[3-5］，其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的療效已經(jīng)得到證實。然而，對于包括CRC在內的實體腫瘤，由于缺乏腫瘤特異性抗原、靶向非腫瘤效應、CAR-T對腫瘤的浸潤水平較低和免疫抑制腫瘤微環(huán)境的存在等因素，難以達到如同血液瘤那樣的治療效果。因此，了解近年來CAR-T療法在結腸癌方面的研究是非常重要的，為未來應對結腸癌治療提供參考。

1 CAR-T細胞療法

1.1 CAR-T細胞療法的概述

Gross 等[6］最早提出嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的概念。CAR 包括1 個賦予抗原特異性的靶結合細胞外區(qū)域，包括單鏈抗體（single-chain Fv，ScFv）片段、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)，以及1 個主要通過CD3ζ 信號鏈介導T 細胞激活的細胞內區(qū)域[7-8］。

目前，CAR 的發(fā)展可分為4 代。已經(jīng)使用的初級刺激信號鏈，例如Fc受體γ鏈（Fc receptor gamma chain，F(xiàn)cεRIγ 鏈）、CD3 分子ζ 鏈（zeta chain of the CD3 molecule，CD3ζ）、DNAX 相關蛋白10（DNAXassociated protein 10，DAP10）、ζ 鏈 相 關 蛋 白-70（zata chain associated protein-70，ZAP70）、淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte specific protein tyrosine kinase，LCK）和Src 家族酪氨酸激酶（src family tyrosine kinases，F(xiàn)YN），它們是第1 代CAR[9］。第2 代在胞內區(qū)域有1 個共刺激域，如CD28 分子、CD137 分子等。這些結構域加強了CAR-T 細胞在體內的增殖、細胞毒性、持續(xù)反應和持久性。在第3代中，CAR受體包含2個共刺激域，以增加細胞因子的產(chǎn)生和抗腫瘤作用[10］。在第4代中，將CAR 與細胞因子白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）等結合在一起[11］。這一代能夠增加T 細胞的活化，招募和激活腫瘤的內源性固有免疫細胞，改變腫瘤微環(huán)境并增加T 細胞持久性[12］。

1.2 CAR-T細胞療法的作用機制及優(yōu)勢

當單鏈抗體與抗原結合時，CAR-T細胞通過細胞內結構域啟動細胞破壞機制。CAR-T 細胞通過3條主要途徑使腫瘤細胞發(fā)生死亡[13］：（1）快速反應釋放穿孔素和顆粒酶，是腫瘤細胞死亡的主要機制[14］。當激活的CAR-T細胞在腫瘤細胞的刺激下，會釋放出含有穿孔素的細胞毒性顆粒，這些顆粒能夠溶解腫瘤細胞并使腫瘤細胞發(fā)生死亡；（2）動作緩慢的Fas-FasL 途徑，F(xiàn)asL 在CAR-T 細胞高表達，而Fas 在腫瘤細胞表達，F(xiàn)asL 與Fas 相互識別后，活化了它們之間連接的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，使腫瘤細胞發(fā)生程序性細胞死亡；（3）細胞因子，活化的CAR-T產(chǎn)生的細胞因子能夠抑制腫瘤細胞生長，調節(jié)腫瘤微環(huán)境，起到抗腫瘤的作用。由于先天免疫的激活，這些細胞因子的激活將觸發(fā)CAR-T細胞殺傷腫瘤[15］。

CAR-T 細胞是在T 細胞的基礎上改造而成的，T 細胞是人體內消滅腫瘤細胞的主力軍。具體而言，從患者自己的血液或健康提供者的血液中獲取的T細胞，通過基因工程技術，使T細胞表達腫瘤特異性識別的CAR，將抗原抗體結合機制和T 細胞的殺傷作用結合，從而讓患者具有抗腫瘤的能力[16］。CAR-T 細胞療法在抗腫瘤活性方面顯示出強大的優(yōu)勢。作為一種以主要組織相容性復合體抑制的方式引導T 細胞特異性的方法，它最近被應用于增強免疫系統(tǒng)在自然反應失敗時對腫瘤細胞的反應[17］。CAR-T表達工程受體和嵌合結構，以主要組織相容性復合體獨立的方式識別癌抗原，并能對其產(chǎn)生特異性反應[18］。

1.3 CAR-T療法的局限性

使用CAR-T 細胞也存在一些局限性。（1）細胞因子釋放綜合征。在接受CD19 CAR-T細胞治療的患者中，在輸注后的第1 周，發(fā)生了細胞因子釋放綜合征[19］。這種效應是CAR-T 細胞在受到刺激后引起過度激活的免疫反應的結果，它與給藥劑量無關，而是與治療反應和腫瘤負擔相關[20］。（2）神經(jīng)毒性。腦病患者在輸注CD19 CAR-T 細胞治療后的5 ～ 7 d，可能會出現(xiàn)定向障礙、局部神經(jīng)功能缺損和癲癇發(fā)作[21］。但神經(jīng)毒性僅在靶向CD19 和CD20的CAR-T細胞治療中被報道，到目前為止，沒有證據(jù)表明其在實體腫瘤治療中產(chǎn)生神經(jīng)毒性。（3）靶向非腫瘤效應。這是指CAR-T細胞可以被表達靶向抗原的正常組織激活，從而破壞非腫瘤細胞。如CD19在B 細胞中廣泛表達[22］，使用CD19靶向CAR-T細胞不僅會破壞CD19+的腫瘤細胞，還會破壞正常的B 細胞，從而導致B 細胞再生障礙[23］。（4）CAR-T細胞的質量和數(shù)量。生產(chǎn)CAR-T細胞需要大量T 細胞的供應。不幸的是，CAR-T 細胞目前僅被批準用于血液惡性腫瘤，而一些患者缺乏足夠數(shù)量的T 細胞來制造CAR-T。此外，許多患者之前接受過化療，導致CAR-T 細胞的數(shù)量和質量較低[24］。

2 CAR-T治療CRC的靶點

CAR-T 細胞治療癌癥的一個關鍵問題是識別特定于每種癌癥類型的靶抗原。在腫瘤細胞中，腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA）過度表達，這些TAA很容易識別，并且被許多患者共享，但是使用CAR-T細胞靶向TAA，可能會由于其低特異性而產(chǎn)生副作用。對于TAA，CAR-T細胞治療CRC常見的靶點有癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、腫瘤相關糖蛋白-72（tumor-associated glycoprotein-72，TAG-72）和鳥苷酸環(huán)化酶C（guanylate cyclase C，GUCY2C）。

CEA在98.8%的CRC組織中過表達，它不僅可以作為腫瘤診斷和預后的標志物，同時也是一種有希望的CRC治療的新靶點[25］。

HER-2 常與人表皮生長因子受體-3（human epidermal growth factor receptor-3，HER-3）組成異源二聚體，通過與配體結合被激活[26］。研究表明，HER-2 過表達約占所有CRC 的2%，其過表達通常由基因擴增引起，HER-2可能成為CRC靶向治療的潛在預測生物標志物[27］。

TAG-72在大多數(shù)正常組織中不表達，與正常黏膜相比，80%的CRC中TAG-72過表達，CRC患者血清中發(fā)現(xiàn)TAG-72 表達升高[28］。關于靶向TAG-72的CAR-T細胞治療CRC的研究中結果證明了CART細胞的相對安全性[29］。

GUCY2C 屬于黏膜環(huán)化酶受體家族，GUCY2C在近95%的CRC中過度表達，該受體催化三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）轉化為環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），觸 發(fā)cGMP 相關信號通路的激活，從而調節(jié)腸內穩(wěn)態(tài)過程，如上皮細胞增殖、分化和凋亡[30］。信號軸的失調將會出現(xiàn)炎癥性腸病和腸道運輸障礙，并促進癌癥的發(fā)展。在腫瘤發(fā)生的早期階段，GUCY2C 結合配體的丟失，導致信號通路沉默并促進腸道轉化[31］。

除了以上靶點，CAR-T細胞治療CRC的靶點還有上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）、造血干細胞抗原CD133和細胞間質上皮轉換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）等，這些靶點都有可能成為CAR-T治療的選擇。

3 CAR-T細胞療法的應用

3.1 臨床前研究

體外研究結果顯示，靶向不同CRC 抗原的CAR-T 細胞的細胞毒性效應已被證明針對多種人類CRC 細胞系，包括LoVo、SW620、HT-29 和DLD-1等。Zhang 等[32］研究表明，針對特定類型的CAR-T細胞，每個細胞系表達不同的抗原與不同的抗原密度將影響抗腫瘤的效果。

Ang 等[33］于2017 年發(fā)表了在異種移植模型方面的第1項臨床前研究，重點研究了EpCAM靶向的CAR-T細胞的細胞毒性效應。該研究表明，通過信使RNA（messenger RNA，mRNA）電穿孔產(chǎn)生的抗EpCAM CAR-T 細胞的多次重復輸注延緩了攜帶CRC 異種移植物的免疫缺陷小鼠的疾病進展。此外，關于結腸癌患者來源的異種移植小鼠模型，已經(jīng)被證明反映了患者的臨床和分子異質性，并重建了腫瘤免疫抑制微環(huán)境[34］，并被用于抗CRC CAR-T細胞的2個臨床前研究。其中1種在使用以間皮素（mesothelin，MSLN）為靶點的第3代CAR-T治療后，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，并且在給藥后至少10 d細胞持續(xù)存在[35］。另1 項研究表明，HER-2 CAR-T細胞能夠在CRC 人來源腫瘤異種移植于免疫缺陷小鼠模型中誘導腫瘤消退甚至消除，并保護治療動物免受腫瘤再次攻擊[36］。

作為CAR-T 細胞治療CRC 研究最多靶點之一的CEA，靶向CEA 的第2代CAR-T細胞在體外和體內均顯示出良好的抗腫瘤效果，當與IL-12結合時，抗腫瘤效果增強[37］。

由于在臨床前研究中獲得了有希望的結果，許多CAR-T 細胞治療CRC 已經(jīng)在臨床試驗中進行了抗腫瘤療效和安全性評估。

3.2 臨床試驗

在臨床試驗中，CAR-T療法在癌癥方面的應用逐漸增加，提供了許多臨床證據(jù)。尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得良好的效果。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）在2017年至2021年間批準上市的靶向CD19的CAR-T細胞療法共有4 種[38-39］，分別是Kymriah、Yescarta、Tecartus 和Breyanzi，它們被用于治療B 細胞急性淋巴細胞白血病或B細胞非霍奇金淋巴瘤。

關于CRC，一些針對各種腫瘤抗原的臨床試驗已被批準。在2014年，開始了第1個CRC的CAR-T臨床試驗（NCT02349724），研究第2 代CEA CAR-T細胞在CRC 患者中的安全性和有效性。在接受CAR-T細胞后，觀察到10例先前接受治療的進行性疾病患者中有7 例病情穩(wěn)定，2 例病情持續(xù)超過30 周，并顯示腫瘤縮小。此外，大多數(shù)患者的血清CEA 水平降低。關于安全性，發(fā)熱被認為是與CAR-T 細胞輸注相關的最重要事件。10 例接受治療的患者中有2例在CAR-T細胞治療后數(shù)小時內出現(xiàn)高熱（39 ～ 40 ℃），并且在細胞注射后的1 ～ 4 d內再次出現(xiàn)高燒。同樣類型的抗CEA CAR-T 細胞已經(jīng)在CEA 陽性腺癌伴肝轉移患者中進行了研究（NCT02416466 和NCT02850536 試驗），通過肝動脈灌注來改善CAR-T 細胞向肝轉移的轉運。在NCT02416466 試驗中，所有患者中觀察到不同的癥狀，但是這些患者均未出現(xiàn)與CAR-T細胞治療相關的嚴重不良事件[40］。在NCT02850536試驗中，通過使用壓力驅動的藥物輸送系統(tǒng)，該裝置旨在克服腫瘤內壓力，將CAR-T 細胞向肝轉移的輸送提高5.2倍，研究者報道了1名患者的治療情況，顯示總生存期增加和完全代謝反應，與之前的試驗一樣，CAR-T輸注與任何嚴重不良事件無關[41］。

4 展 望

CAR-T 細胞免疫療法是一種非常有前途的腫瘤治療方法，特別是對B細胞等血液惡性腫瘤的治療。CAR-T 細胞在治療CRC 的臨床研究中取得了較好的療效，未來的CAR-T 細胞治療的方向是研究個性化的CAR-T 細胞治療產(chǎn)品。由于患者具有個體差異性，在使用CAR-T 細胞免疫療法治療腫瘤時，CAR-T細胞的劑量和輸液方式以及合適的治療方案是需要進一步探討的問題。此外，通過改變和優(yōu)化CAR-T 自身的結構，尋找合適的腫瘤特異性抗原等策略，可使CAR-T 細胞達到精準靶向殺傷腫瘤的目的。相信未來的CAR-T 細胞免疫療法在治療CRC 方面將邁出新的步伐，其在臨床實踐的應用將會達到更加高效和安全的水平，最終將會延長CRC 患者的生命和提高患者的生存質量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突