TMCO1在泛癌中的表達(dá)模式及其與預(yù)后、免疫浸潤的相關(guān)性分析

董 媛,李佳璐,王 宇,張曉莉

跨膜和螺旋結(jié)構(gòu)域1(transmembrane and coiled-coil domains 1,TMCO1)是一種高度保守的跨膜蛋白,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。作為一種鈣離子選擇性陽離子通道,TMCO1被發(fā)現(xiàn)能夠防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細(xì)胞內(nèi)鈣庫過度充盈,并維持鈣穩(wěn)態(tài)[1]。TMCO1與腦面胸骨骼發(fā)育和青光眼有關(guān)[2,3]。文獻(xiàn)[4]表明,TMCO1在結(jié)腸癌中是一種新型的腫瘤促進(jìn)因子,iASPP-TMCO1 軸抑制促進(jìn)細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子超載誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡,減少體外和體內(nèi)腫瘤的生長。TMCO1與肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)治療有潛在相關(guān)性,抑制 TMCO1 表達(dá)水平可負(fù)調(diào)控肺腺癌細(xì)胞A549的凋亡和遷移[5]。此外,TMCO1被發(fā)現(xiàn)能夠維持顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子穩(wěn)態(tài),TMCO1的破壞能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加,從而導(dǎo)致卵巢的卵泡發(fā)育受損[6]。本研究綜合利用多種數(shù)據(jù)庫分析泛癌組織中TMCO1的表達(dá)水平差異,初步探討其對腫瘤預(yù)后的預(yù)測價值及其與腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)的關(guān)聯(lián),為明確潛在的腫瘤免疫治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TMCO1基因表達(dá)量 TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)是分析不同癌癥類型的免疫浸潤及基因差異表達(dá)的網(wǎng)站[7],可以分析33種腫瘤中TMCO1的表達(dá)。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的一個新開發(fā)和交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器,能夠獲取不同分子在正常樣本和癌癥樣本中的差異表達(dá)情況[8]。GEPIA用于補充TIMER的數(shù)據(jù)。

1.2 與預(yù)后指標(biāo)相關(guān)性 在GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku. cn/)中獲取臨床資料,將樣本以基因表達(dá)中位數(shù)分為高低表達(dá)組,并分析TMCO1與腫瘤總生存期(overall survival,OS)和無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival,RFS)相關(guān)性,同時計算log-rankP值、95%置信區(qū)間(CI)和風(fēng)險比率(HRs)。從UCSC(https://xenabrowser.net/)數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的泛癌數(shù)據(jù)集:TCGA TARGET GTEx (PANCAN,N=19131,G=60499),進(jìn)一步從中提取TMCO1基因在各個樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù),對每一個表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2(x+0.001)變換,剔除樣本數(shù)小于10個的癌種后進(jìn)行可視化和統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 與免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點基因表達(dá)相關(guān)性 通過sangerbox數(shù)據(jù)庫(http://sangerbox.com/Tool)探索TMCO1表達(dá)與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中免疫檢查點基因(immune checkpoint,ICP)相關(guān)性。根據(jù)先前研究選擇免疫檢查點基因[9]。本研究通過TIMER2.0數(shù)據(jù)庫下載38種癌癥的6種免疫細(xì)胞的評分?jǐn)?shù)據(jù),分析其與TMCO1表達(dá)的免疫細(xì)胞評分相關(guān)性,使用R軟件包psych(version 2.1.6)的corr.test函數(shù)計算各個腫瘤中基因與免疫細(xì)胞浸潤評分的相關(guān)性并進(jìn)行可視化。

1.4 在腫瘤相關(guān)基因的功能富集分析 在String蛋白網(wǎng)絡(luò)平臺(https://string-db.org/)收集蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息,包括TMCO1經(jīng)實驗評估的40個結(jié)合蛋白。從GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中收集并分析100個TMCO1共表達(dá)基因,最終展示6個與TMCO1相關(guān)性最強的分子,結(jié)果以散點圖和熱圖表示。通過基因本體論數(shù)據(jù)庫(gene ontology,GO)和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG)將上文得到的140個TMCO1的潛在相關(guān)分子進(jìn)行富集分析。二者分析均通過R語言實現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 泛癌中TMCO1的mRNA和蛋白差異表達(dá) 結(jié)果顯示,在33種腫瘤中,TMCO1 mRNA表達(dá)量在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌和胃癌中表達(dá)較正常組織顯著升高(圖1A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫為TIMER2.0數(shù)據(jù)庫中沒有配對的正常組織癌癥的補充結(jié)果。結(jié)果顯示,TMCO1 mRNA在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、卵巢漿液性囊腺癌、皮膚黑色素瘤、胸腺癌中表達(dá)顯著升高(圖1B)。

圖1 TMCO1在泛癌中的表達(dá)差異

2.2 泛癌中TMCO1預(yù)后價值 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了基因表達(dá)與腫瘤的預(yù)后關(guān)系,其中TMCO1高表達(dá)與宮頸鱗癌、腺癌和肺腺癌的OS和RFS均相關(guān)(圖2A);TMCO1高表達(dá)與頭頸鱗狀細(xì)胞癌和腦低級別膠質(zhì)瘤的腫瘤OS相關(guān),TMCO1低表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的OS相關(guān)。TMCO1高表達(dá)與膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細(xì)胞癌的RFS相關(guān)(圖2B)。單因素Cox回歸分析函數(shù)分析基因表達(dá)與每個腫瘤的預(yù)后關(guān)系,結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、急性髓細(xì)胞樣白血病、乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、白血病、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、腎上腺皮質(zhì)癌中,TMCO1高表達(dá)提示較差預(yù)后;在腎透明細(xì)胞癌中,TMCO1低表達(dá)提示較差預(yù)后。森林圖結(jié)果與GEPIA結(jié)果趨勢相同(圖3)。

2.3 與人類癌癥的免疫檢查點基因、免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性 免疫檢查點基因(ICPA)對免疫細(xì)胞浸潤和免疫治療有較大影響[10]。本研究發(fā)現(xiàn)TMCO1表達(dá)密切相關(guān)的多種癌癥類型,如葡萄膜黑色素瘤、卵巢漿液性囊腺癌、混合腎癌、睪丸癌、乳腺浸潤癌、肺腺癌、胸腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、黑色素瘤、腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌和膀胱尿路上皮癌。其中,TMCO1表達(dá)與葡萄膜黑色素瘤、卵巢漿液性囊腺癌、混合腎癌、腦低級別膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤的免疫檢查點呈正相關(guān)。以葡萄膜黑色素瘤為例,TMCO1與其50個免疫檢查點相關(guān)。TMCO1表達(dá)與睪丸癌和肺腺癌的免疫檢查點呈負(fù)相關(guān)(圖4)。以上表明TMCO1可能在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中協(xié)調(diào)ICP基因活性,并有可能成為免疫治療靶點。TMCO1高表達(dá)可能預(yù)示著針對ICP基因的免疫療法取得更好的治療效果。本研究通過sangerbox網(wǎng)站(http://sangerbox.com/Tool)探索了TMCO1表達(dá)與人類癌癥TME中6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性,最終獲得38個腫瘤的6種免疫細(xì)胞浸潤評分,發(fā)現(xiàn)TMCO1與34個癌種存在顯著相關(guān)。TMCO1與21種腫瘤的B細(xì)胞、19種腫瘤的CD4+細(xì)胞、19種腫瘤的CD8+細(xì)胞、22種腫瘤的中性粒細(xì)胞、17種腫瘤的巨噬細(xì)胞和20種腫瘤的樹突狀細(xì)胞有較強關(guān)聯(lián)性(圖5)。

2.4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與免疫反應(yīng)相關(guān) 用String獲得TMCO1結(jié)合蛋白并做成互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖6A),通過GEPIA獲得100個TMCO1相關(guān)基因,并進(jìn)行相關(guān)性分析。其中6個代表性靶基因在TMCO1表達(dá)中與多種腫瘤呈正相關(guān)(圖6B、C)。使用GO和KEGG對TMCO1結(jié)合與共表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示,TMCO1共表達(dá)基因與霍亂弧菌感染、蛋白質(zhì)輸出、核糖體等信號通路相關(guān),TMCO1共表達(dá)基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、SRP-依賴的靶向膜的共翻譯蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)定位的建立等密切相關(guān)(圖6D)。

A.TMCO1在宮頸癌和肺腺癌中的生存曲線;B.TMCO1在頭頸鱗癌、腦低級別膠質(zhì)瘤和腎透明細(xì)胞癌的OS曲線,在膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細(xì)胞癌的RFS曲線。

3 討 論

TMCO1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,其作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),防止細(xì)胞內(nèi)鈣庫過度充盈,維持鈣穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn),TMCO1可通過多種途徑影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文研究了TMCO1在泛癌表達(dá)、預(yù)后、免疫檢查點和免疫細(xì)胞浸潤方面的相關(guān)性,收集其共表達(dá)基因及相關(guān)蛋白并進(jìn)行富集分析,發(fā)現(xiàn)TMCO1可能與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有關(guān),或因此成為潛在的預(yù)后預(yù)測因子。

本研究首先使用GEPIA數(shù)據(jù)庫及TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析TMCO1在泛癌中的表達(dá)水平。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明,TMCO1在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌和胃癌中表達(dá)較正常組織顯著升高。GEPIA補充了沒有配對正常組織的癌癥的差異結(jié)果。結(jié)果顯示,TMCO1在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、腦低級別膠質(zhì)瘤、卵巢漿液性囊腺癌、皮膚黑色素瘤和胸腺癌中表達(dá)顯著升高。預(yù)后分析顯示,TMCO1高表達(dá)與宮頸鱗癌、腺癌和肺腺癌的OS和RFS相關(guān),與頭頸鱗狀細(xì)胞癌和腦低級別膠質(zhì)瘤的OS相關(guān),與膀胱尿路上皮癌和腎乳頭狀細(xì)胞癌的RFS相關(guān);TMCO1低表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的OS相關(guān)。綜合各類數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果,TMCO1在肺腺癌、宮頸鱗癌和腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腦低級別膠質(zhì)瘤、膀胱尿路上皮癌和腎乳頭細(xì)胞癌中高表達(dá)預(yù)后較差,TMCO1在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)預(yù)后好。基于上述結(jié)果我們推測TMCO1表達(dá)量可能與腫瘤預(yù)后有一定相關(guān)性。

圖5 TMCO1表達(dá)與免疫浸潤相關(guān)性

與傳統(tǒng)的化療和靶向治療相比,免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)可以阻斷免疫檢查點基因,緩解腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抑制作用,并在增強對癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)方面具有持久的效果和療效。常見的ICIs如PD-1/PD-L1的療效已在多種腫瘤中被驗證[11]。本文研究了TMCO1表達(dá)與免疫檢查點基因表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果提示TMCO1可能通過調(diào)節(jié)特定免疫檢查點基因表達(dá)來調(diào)節(jié)腫瘤免疫模式。TMCO1在葡萄膜黑色素瘤中上調(diào),高表達(dá)的TMCO1與免疫檢查點基因HMGB1、TNFSF4、BTN3A1、CXCL10的表達(dá)正相關(guān);TMCO1在OV中上調(diào),高表達(dá)的TMCO1與免疫檢查點基因HMGB1、ENTPD1、BTN3A1、BTN3A2等表達(dá)正相關(guān);TMCO1在DLBC中上調(diào),高表達(dá)的TMCO1與免疫檢查點基因TLR4、BTN3A1、ENTPD1、TNFSF4等表達(dá)正相關(guān)。這提示高表達(dá)TMCO1的腫瘤中,阻斷特定免疫檢查點或為免疫治療提供新思路。

腫瘤微環(huán)境被認(rèn)為是影響腫瘤預(yù)后的重要因素,并為腫瘤免疫治療提供指導(dǎo)幫助[12]。癌細(xì)胞與各種腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞之間的相互作用是腫瘤微環(huán)境重要組成部分,通過促進(jìn)腫瘤免疫逃逸來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[13]。本文研究了TMCO1與免疫細(xì)胞的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)TMCO1與34個癌種存在顯著相關(guān)。其中,TMCO1與21種腫瘤B細(xì)胞、19種腫瘤CD4+細(xì)胞、19種腫瘤CD8+細(xì)胞、22種腫瘤中性粒細(xì)胞、17種腫瘤巨噬細(xì)胞和20種腫瘤的樹突狀細(xì)胞有較強相關(guān)性。該結(jié)果提示,TMCO1與中性粒細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞浸潤有關(guān),其可能成為泛癌預(yù)后生物標(biāo)志物。作為抵御病原體的首道防線,中性粒細(xì)胞可能與先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組成部分互相作用,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14,15]。腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor associated neutrophils,TANs)是一組依賴于腫瘤的、不同種類的中性粒細(xì)胞,其對腫瘤發(fā)展有雙重作用[16]。在結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膽管癌、肝細(xì)胞癌和宮頸癌等癌種中發(fā)現(xiàn),其對腫瘤發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用[17-22],這與高表達(dá)TMCO1預(yù)測較差腫瘤預(yù)后的腫瘤結(jié)果部分重合。因此推測TMCO1與中性粒細(xì)胞作用顯著相關(guān)潛在機(jī)制可能與TANs有關(guān),這能夠為靶向免疫治療提供新思路。

圖6 TMCO1表達(dá)與人類癌癥共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激出現(xiàn)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時,其具體表現(xiàn)為錯誤折疊、未折疊的蛋白質(zhì)(UPR)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小室內(nèi)積聚和細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂[23]。UPR已被證實能夠介導(dǎo)腫瘤與非腫瘤之間的串?dāng)_[24]。TMCO1已確定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子泄露通道,丟失后可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存鈣超載和細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加[25]。TMCO1在腫瘤中與激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、染色體1開放閱讀框43(C1orf43)、SCY1 樣假激酶 3(SCYL3)、琥珀酸脫氫酶復(fù)合亞基C(SDHC)、TOR 信號通路調(diào)節(jié)因子樣蛋白(TIPRL)、U2 相關(guān)因子同源基序激酶 1(UHMK1)的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。ATF6是一種II型跨膜糖蛋白,它能夠通過減少對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力來保護(hù)胰腺β細(xì)胞[26],是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要成員之一。此外,ATF6介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已經(jīng)導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生[27,28]。提示了TMCO1發(fā)揮作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。SDHC被報道在乳腺癌中成為藥物開發(fā)有吸引力的靶標(biāo)[29]。這為研究TMCO1在腫瘤中差異表達(dá)的機(jī)制提供了可能方向。TMCO1表達(dá)在多腫瘤中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、SRP依賴的靶向膜的共翻譯蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位建立等密切相關(guān),并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)定位的建立相關(guān)[30,31],說明其可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。目前TMCO1與SRP依賴的靶向膜的共翻譯蛋白關(guān)聯(lián)尚未有報道,其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

綜上所述,筆者認(rèn)為TMCO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)因子作用,該過程可能與中性粒細(xì)胞有關(guān),TMCO1可能成為未來的腫瘤預(yù)后預(yù)測因子。