投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚生長影響的代謝組學(xué)分析

程學(xué)文，史存卓，劉鷹，傅松哲，張磊，田野，熊玉宇*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點試驗室(大連海洋大學(xué))，遼寧 大連 116023；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；4.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023)

投喂頻率是養(yǎng)殖管理中的重要環(huán)節(jié)，對養(yǎng)殖魚類的攝食、生長、飼料利用和代謝等具有重要影響[1-3]。適宜的投喂頻率可以提高魚類的生長速率，降低飼料系數(shù)，減少水質(zhì)污染物[4]。在魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，飼料成本約占總成本的60%，因此，開展投喂策略研究，可以大幅降低飼料成本，提高養(yǎng)殖效益[5]。

珍珠龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)，又稱“龍虎斑”或“珍珠斑”，是由棕點石斑魚(E.fuscoguttatus♀)與鞍帶石斑魚(E.lanceolatus♂)雜交繁育的新品種，在溫度為14～35 ℃、鹽度為1～55的海水中均能存活和攝食，最適宜溫度為25～35 ℃，最適宜海水鹽度為4～45[6]。珍珠龍膽石斑魚生長速率較快，同時擁有母本良好的抗病能力和肉質(zhì)細嫩的特點，是適宜工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的重要對象之一[7]。對珍珠龍膽石斑魚最適投喂頻率的研究表明，在飽食投喂條件下，投喂頻率為2～4次/d時，珍珠龍膽石斑魚具有較高的特定生長率和較低的飼料系數(shù)[4，8-9]。在魚類工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖中，高投喂頻率有利于水質(zhì)穩(wěn)定，且實際投喂率低于飽食投喂率，但在低投喂率條件下提高投喂頻率對魚類生長的影響及機制尚不清楚。

代謝組學(xué)能揭示基因型和表型之間的聯(lián)系，基因組和蛋白質(zhì)組的細微功能變化可以在代謝層面上放大，使檢測更容易[10]。利用代謝組學(xué)技術(shù)方法，可以清晰地研究外界因子如何影響魚類的代謝和生長。如Zhang等[11]使用代謝組學(xué)技術(shù)研究了溫度對歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)生長發(fā)育和肝臟代謝的影響。代謝組學(xué)技術(shù)在黃姑魚(Nibeaalbiflora)對寒冷和饑餓的生理反應(yīng)[12]，以及易逝期貝類活品品質(zhì)變化機制[13]等研究中也得到了廣泛應(yīng)用。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)，可為研究投喂頻率對水產(chǎn)動物生長的影響提供新的方法，但有關(guān)該方面的研究尚未見報道。

本研究中，模擬工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)條件，在低于飽食投喂率條件下，比較了高、中、低3種不同投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚生長的影響，并采用TM廣靶代謝組學(xué)方法進行代謝組學(xué)分析，以期解析投喂頻率影響魚類生長的代謝機制，為科學(xué)制定工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖珍珠龍膽石斑魚的適宜投喂頻率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用珍珠龍膽石斑魚由大連富谷水產(chǎn)有限公司于2019年繁育，并于當年11月運回設(shè)施漁業(yè)教育部重點試驗室(大連海洋大學(xué))，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)。試驗魚在暫養(yǎng)期間，每天投喂2次(8：00和17：00)海水魚膨化配合飼料，飼料營養(yǎng)成分：粗蛋白質(zhì)43.0%，粗脂肪5.0%，粗灰分15.0%，賴氨酸2.2%，水分12.0%，總磷1.00%，鈣1.00%～4.00%，氯化鈉0.50%～3.00%(均為質(zhì)量分數(shù))。2021年4月15日挑選出180尾健康無傷的試驗魚進行投喂頻率試驗。試驗魚的初始體質(zhì)量為(469±75)g，體長為(245±14)mm。為追蹤個體生長信息，所有試驗魚均注射電子芯片標記(PIT)。

1.2 方法

1.2.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng) 為了保持養(yǎng)殖環(huán)境穩(wěn)定一致，試驗使用了3套相同的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，每個養(yǎng)殖系統(tǒng)包括3個相同的養(yǎng)殖桶(圖1)。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由養(yǎng)殖桶、旋渦式固液分離器、履帶式微濾機、蛋白分離器、生物濾池、調(diào)溫冷暖機、增氧裝置、紫外線殺菌器、LED燈、水質(zhì)在線監(jiān)測系統(tǒng)和自動控制系統(tǒng)等單元組成。養(yǎng)殖桶為藍色塑料(PVC)材質(zhì)，上部為圓柱體，下部近似圓錐體，直徑為0.93 m，最大水深為1.00 m，有效養(yǎng)殖水體為0.64 m3，進水量為0.8 m3/h。養(yǎng)殖系統(tǒng)自動排污補水，源水為經(jīng)過沉淀的天然海水。養(yǎng)殖桶上方加蓋以遮蔽室內(nèi)光源，養(yǎng)殖光源為全光譜LED燈，燈的開關(guān)自動控制，光照時間設(shè)定為7：30—19：30，水面最大光照強度為372 lx。試驗期間，水溫為(25.7±1.3)℃，溶解氧為(4.19±0.85)mg/L，鹽度為(31.43±0.34)，pH為(7.61±0.14)。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)Fig.1 Recirculating aquaculture system

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗設(shè)置F1組(1次/d，8：00，低頻率投喂組)、F2組(2次/d，8：00，17：00，對照組)和F4組(4次/d，8：00，11：00，14：00，17：00，高頻率投喂組)3個投喂頻率組，每組設(shè)置3個平行，每個平行放試驗魚20尾。3組分別在3套循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d。為了滿足試驗期間投喂率低于飽食投喂率，參照仇登高等[7]飽食投喂條件下珍珠龍膽石斑魚(體質(zhì)量為298～503 g)的攝食率(1.07%～1.24%)，各處理組的投喂率均設(shè)定為0.90%。投喂過程中觀察攝食情況，并記錄投喂飼料量和剩余飼料量，用于計算攝食量。分別在試驗的第0、17、30、45、60天時測量每個養(yǎng)殖桶每尾試驗魚的體質(zhì)量，并進行生長性能分析，取第60天時F1和F4組魚的肝臟組織，液氮中速凍后于-80 ℃下保存，用于代謝組學(xué)分析(表1)。測量前一天和當天禁食，測量后根據(jù)每個養(yǎng)殖桶魚的總體質(zhì)量調(diào)整投喂量，各組日投喂率均為0.90%。試驗魚先用丁香酚麻醉后再進行體質(zhì)量測量。

表1 生長測量和取樣流程

1.2.3 攝食與生長性能指標計算 攝食率(RC，%)、特定生長率(RSG，%/d)和飼料系數(shù)(RFC)計算公式為

RC=(F-R)/Wt1×100%，

RSG=(lnWt2-lnWt1)/(t2-t1)×100%，

RFC=(F-R)/(Wt2-Wt1)。

式中：F和R分別為投喂飼料量和剩余飼料量(g)；Wt2和Wt1分別為t2和t1時對應(yīng)的體質(zhì)量(g)。

1.2.4 代謝組學(xué)分析

1)樣品提取。從-80 ℃超低溫冰箱中取出樣品置于冰上解凍，將樣品切碎混勻，多點取樣稱量(20±1)mg置于對應(yīng)編號離心管中；加入一粒鋼珠，用球磨儀(30 Hz)勻漿20 s，4 ℃條件下以3 000 r/min離心30 s；棄去上清液后，加入體積分數(shù)為70%的甲醇水內(nèi)標提取液400 μL，以1 500 r/min振蕩5 min，冰上靜置15 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，移取上清液300 μL到另一對應(yīng)編號離心管中，-20 ℃下靜置30 min；4 ℃下以12 000 r/min再離心3 min，移取上清液200 μL到對應(yīng)進樣瓶內(nèi)襯管中，用于上機分析。

2)數(shù)據(jù)采集儀器。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC，ExionLC AD，https：//sciex. com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry，MS，QTRAP?sciex.com/)。

3)數(shù)據(jù)檢測與分析。采用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)?；谶~維(武漢)生物技術(shù)有限公司自建靶向標品數(shù)據(jù)庫MVDB 及整合公共數(shù)據(jù)庫MHK、MetDNA進行定性分析，并提取出鑒定代謝物的多離子對信息及保留時間RT (retention time)，結(jié)合靶標數(shù)據(jù)庫，同時在Q-Trap進行定量分析。利用R軟件(www.r-project.org)對兩組樣品進行主成分分析(PCA)、聚類分析(HCA)。采用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)分析相關(guān)性較小的變量，并對模型進行驗證[14]。代謝物差異倍數(shù)值(fold change)為2倍以上或0.5以下時，認為有顯著性差異。采用KEGG數(shù)據(jù)庫[15]對篩選出的差異代謝物進行注釋、分類、聚類、富集分析和代謝通路整體變化分析。采用Pearson相關(guān)系數(shù)描述相關(guān)分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長與攝食

從表2可見：經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚生長有顯著性影響(P<0.05)；各組體質(zhì)量均隨養(yǎng)殖時間的延長而增大，自30 d開始，高頻率投喂組F4的體質(zhì)量顯著高于其他兩組(P<0.05)；隨著投喂頻率增加，珍珠龍膽石斑魚各時間段的SGR總體有升高趨勢。

表2 投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚體質(zhì)量和特定生長率的影響Tab.2 Effects of feeding frequency on the body weight and specific growth rate of pearl gentian grouper

從表3可見：投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚的攝食率無顯著性影響(P>0.05)，各組的攝食率均隨魚體生長逐漸降低；不同生長階段的FCR波動較大，各組FCR隨養(yǎng)殖時間延長總體呈現(xiàn)升高趨勢，即在0～17 d時FCR較低，在45～60 d時FCR較高，但組間差異隨養(yǎng)殖時間延長而減小，F(xiàn)4組在0～17 d時的FCR顯著低于F1和F2組(P<0.05)，但在17～30 d、30～45 d和45～60 d時的FCR與其他兩組無顯著性差異(P>0.05)。

表3 投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚攝食率和飼料系數(shù)的影響Tab.3 Effects of feeding frequency on the consumption rate and feed conversion ratio of pearl gentian grouper

2.2 代謝組學(xué)分析

基于邁維自建靶標數(shù)據(jù)庫MVDB，對肝臟樣品代謝物進行質(zhì)譜定性和定量分析，共檢測到1 213個代謝物。

通過OPLS-DA等方法對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)1組和F4組組內(nèi)聚集性較好，組間存在顯著性差異(圖2)。

圖2 F1組和F4組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的OPLS-DA得分Fig.2 OPLS-DA score plot of metabolomics data in groups F1 and F4

根據(jù)OPLS-DA分析結(jié)果，對F1組和F4組間的差異代謝物進一步進行篩選和分類，共發(fā)現(xiàn)157個差異代謝物。從圖3可見，121個差異代謝物相對含量上調(diào)，36個差異代謝物相對含量下調(diào)。

圖3 F1組和F4組差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of differential metabolites in groups F1 and F4

為方便觀察代謝物相對含量的變化規(guī)律，對應(yīng)用篩選標準鑒定得到的差異代謝物的原始相對含量采用標準化處理(unit variance scaling，UV scaling)，通過R軟件的Heatmaply和ComplexHeatmap包繪制聚類熱圖(圖4)，F(xiàn)1組和F4組差異代謝物種類主要有脂肪酰類(14.0%)、有機酸及其衍生物(11.4%)、氨基酸及其代謝物(10.1%)和核苷酸及其代謝物(7%)。隨著投喂頻率增加，肝臟代謝物中二十碳四烯酸、L-乳酸、丙二酸、L-甲狀腺素、D-甘露醇、?；悄懰帷ⅫS嘌呤核苷、馬尿酸、犬尿氨酸、亞葉酸、戊二酸、L-蘋果酸和UDP葡萄糖等121個差異代謝物相對含量上調(diào)，莽草酸、乳清酸、L-天冬氨酸、胍基乙酸和5-氨基戊酸等36個差異代謝物相對含量下調(diào)。

Scale為代謝物相對含量標準化處理后得到的數(shù)值(顏色越紅表示含量越高)。Scale is the value obtained by standardizing the relative content of metabolites (the redder the color is，the higher the content is).圖4 F1組和F4組差異代謝物聚類熱圖Fig.4 Heatmap of differential metabolites in groups F1 and F4

為探索珍珠龍膽石斑魚肝臟對不同投喂頻率響應(yīng)的潛在代謝途徑，將篩選出的差異代謝物與KEGG數(shù)據(jù)庫中的代謝途徑相關(guān)聯(lián)，以識別與投喂頻率相關(guān)的潛在生物標記物的代謝途徑。對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行處理，繪制差異代謝物KEGG分類(圖5)和KEGG富集圖(圖6)。從圖5可見，F(xiàn)1組和F4組肝臟差異表達代謝物的相關(guān)代謝通路分為5類，即生物體系統(tǒng)(organismal systems)、新陳代謝(metabolism)、人類疾病(human diseases)、遺傳信息處理(genetic information processing)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)。其中，代謝類中的代謝途經(jīng)和生物合成輔助因子通路的差異代謝物個數(shù)較多，分別為45、13個。

圖5 F1和F4組肝臟樣品差異代謝物KEGG分類Fig.5 KEGG classification of differential metabolites in liver samples in groups F1 and F4

點的顏色為P value，其顏色越紅表示差異代謝物富集越顯著；點的大小代表富集到的差異代謝物的個數(shù)。The color of the point indicates the P-value，and the redder means the more significant the enrichment.The size of the dot represents the number of differential metabolites enriched.圖6 F1和F4組肝臟樣品差異代謝物KEGG富集通路(前20)Fig.6 KEGG enrichment path way of differentially expressed metabolites in liver samples of groups F1 and F4(top 20)

由圖6可見，差異代謝物被顯著地富集到維生素消化吸收、淀粉與糖代謝、5-羥色胺神經(jīng)元、丙酮酸代謝、氧化磷酸化、葉酸一碳單位庫、果糖與甘露糖代謝、葉酸生物合成、精氨酸與鳥氨酸代謝、生物合成輔助因子、β-丙氨酸代謝和花生四烯酸代謝等代謝通路。其中，與新陳代謝相關(guān)的氧化磷酸化、葉酸一碳單位庫、果糖與甘露糖代謝和花生四烯酸代謝4個信號通路的富集程度較大。

根據(jù)篩選出的肝臟差異代謝物代謝途徑的相關(guān)性，繪制F1組和F4組肝臟樣品KEGG代謝通路圖(圖7)。其中，主要涉及的代謝通路包括半乳糖代謝、糖酵解/糖異生代謝、苯丙氨酸代謝、?；撬岽x、膽汁分泌代謝和鳥氨酸循環(huán)代謝等，均與能量代謝和生長有關(guān)。共識別出8個關(guān)鍵差異代謝物，其中，?；悄懰帷DP-葡萄糖、L-乳酸和L-甲狀腺素4個差異代謝物相對含量上調(diào)，莽草酸、天冬氨酸、乳清酸和胍基乙酸4個差異代謝物相對含量下調(diào)。UDP-葡萄糖相對含量上調(diào)，可促進葡萄糖的合成，通過糖酵解增加能量供應(yīng)。其中，L-乳酸相對含量上調(diào)，經(jīng)多步酶促反應(yīng)形成磷酸烯醇丙酮酸，經(jīng)糖異生合成葡萄糖，提供能量儲備。UDP-葡萄糖和L-乳酸相對含量上調(diào)，通過多步反應(yīng)，最終促進合成L-甲狀腺素。L-甲狀腺素相對含量上調(diào)，可促進生長代謝。而天冬氨酸相對含量下調(diào)，可減少精氨酸合成，從而減少胍基乙酸合成。胍基乙酸相對含量下調(diào)，可減少肌酸合成。?；悄懰嵯鄬可险{(diào)，可增加腺苷蛋氨酸的消耗，從而減少肌酸合成。表明這些代謝物相對含量上調(diào)或者下調(diào)，可能減少氨基酸代謝供能，增加了糖代謝供能，從而促進魚類生長。

相對含量上調(diào)的代謝物用紅色表示，相對含量下調(diào)的代謝物用綠色表示；實線表示可以通過一步酶促反應(yīng)得到對應(yīng)代謝物，虛線表示通過多步酶促反應(yīng)得到對應(yīng)代謝物。Up-regulated metabolites are shown in red，and down-regulated metabolites are shown in green；The solid line indicates that the corresponding metabolite can be obtained by one-step enzymatic reaction，and the dotted line means that the corresponding metabolite can be obtained by multi-step enzymatic reaction.圖7 F1組和F4組肝臟樣品KEGG代謝通路Fig.7 Metabolic pathway diagram of KEGG in liver samples of groups F1 and F4

2.3 生長與代謝的關(guān)系

為了探討生長與代謝的關(guān)系，對代謝組學(xué)分析樣品的SGR與關(guān)鍵差異代謝物的豐度進行了相關(guān)性分析。從表4可見：對6個樣品生長信息進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，0～60 d時，F(xiàn)4組的SGR顯著高于F1組(P<0.05)，在此期間，SGR的組間差異隨著養(yǎng)殖時間的延長而減小，在前期(0～30 d)和后期(30～60 d)，F(xiàn)4和F1組SGR的差值分別為0.47和0.12。

表4 用于肝臟靶向代謝組學(xué)分析的6尾試驗魚個體體質(zhì)量及生長的跟蹤測量

關(guān)鍵差異代謝物中，L-甲狀腺素和胍基乙酸分別與生物合成和能量代謝有關(guān)。Pearson相關(guān)性分析表明，6個樣品的SGR(0～60 d)與L-甲狀腺素豐度呈顯著正相關(guān)(r=0.929)，與胍基乙酸豐度呈顯著負相關(guān)(r=-0.809)。

3 討論

3.1 投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚生長的影響

投喂頻率對大多數(shù)魚類的生長具有顯著影響[16]。本研究表明，在低于飽食投喂率條件下，珍珠龍膽石斑魚特定生長率隨投喂頻率的增大呈逐漸升高趨勢，這與朱曉芳等[4]對珍珠龍膽石斑魚幼魚投喂頻率的研究結(jié)果一致。但本研究中，珍珠龍膽石斑魚的最大特定生長率出現(xiàn)在投喂頻率為4次/d時，且4次/d組顯著高于2次/d組(表2)，這與珍珠龍膽石斑魚最佳投喂頻率為2次/d的觀點不一致[8]。有關(guān)珍珠龍膽石斑魚最佳投喂頻率研究大多在飽食投喂條件下進行。王成桂等[8]研究表明，當投喂頻率為2次/d時，特定生長率達到最大值，且在一定范圍內(nèi)，攝食率隨投喂頻率增加而升高。而特定生長率又隨攝食率的升高呈先升高后下降的變化規(guī)律[1]，故在飽食投喂條件下，4次/d組攝食率比2次/d組高，其特定生長率反而比2次/d組低。本研究中，投喂率低于飽食投喂率，各組的投喂率相同，而且實際攝食率組間無顯著性差異，排除了投喂率或攝食率的影響，所測定的特定生長率變化能夠更好地反映投喂頻率的影響。唐懷慶等[9]研究表明，投喂頻率對魚類生長的影響與投喂率或攝食率有關(guān)，珍珠龍膽石斑魚幼魚在投喂水平為81.24%飽食條件下的特定生長率最高。因此，在珍珠龍膽石斑魚工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)中，鑒于實際投喂率通常低于飽食投喂率，建議將投喂頻率增加到4次/d，以提高其生長率。

從生物能量學(xué)角度看，生長可看作食物能與能量收支其他組分之差，同種魚類不同個體生長差異主要是由攝食率差異或者攝食代謝占食物能比例的差異造成的[17]。珍珠龍膽石斑魚為肉食性兇猛魚類，存在明顯的集群現(xiàn)象，在高密度養(yǎng)殖條件下，攻擊搶食現(xiàn)象明顯[18]。其生長受投喂頻率影響，一般認為與攝食率不同有關(guān)[7-9]。本研究中，不同投喂頻率組試驗魚的攝食率相同，但生長率仍有顯著性差異。因此，低投喂率條件下，珍珠龍膽石斑魚幼魚生長差異可能主要是由攝食代謝差異造成的。從攝食代謝方面看，相對于1次/d組，4次/d組的投喂間隔時間較短，饑餓導(dǎo)致的餌料競爭可能較小，從而降低了用于攝食活動的能量消耗。

3.2 投喂頻率對肝臟代謝的影響

在不同的投喂頻率條件下，魚體的能量代謝可能不同。本研究中，通過肝臟代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，投喂頻率組間的差異代謝物主要為新陳代謝類，主要富集在代謝途徑和生物合成輔助因子代謝通路，且顯著富集于氧化磷酸化、葉酸一碳單位庫、果糖與甘露糖代謝及花生四烯酸代謝等與能量代謝相關(guān)的代謝通路。隨著投喂頻率增加，?；悄懰帷DP-葡萄糖、L-乳酸和L-甲狀腺素4個差異代謝物相對含量上調(diào)，莽草酸、天冬氨酸、乳清酸和胍基乙酸4個差異代謝物相對含量下調(diào)。這些結(jié)果表明，投喂頻率對珍珠龍膽石斑魚的能量代謝有顯著影響。

肝臟是糖脂代謝調(diào)控的中樞器官，糖脂代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控是維持機體基本生命活動的基礎(chǔ)。本研究中發(fā)現(xiàn)，珍珠龍膽石斑魚花生四烯酸代謝通路受投喂頻率的影響顯著，其中，二十碳四烯酸、二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸在4次/d組中下降為不足原來的三分之一。不同投喂頻率條件下，試驗魚受到的饑餓脅迫程度不同，投喂頻率對脂代謝的影響可能與饑餓程度不同有關(guān)。張彥坤等[19]在劍尾魚(Xiphophorushelleri)饑餓脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，肝臟不飽和脂肪酸的生物合成代謝通路受饑餓脅迫影響?；ㄉ南┧崾且环Nω-6多不飽和脂肪酸，在生物體內(nèi)主要以磷脂的形式存在于細胞膜上，在細胞內(nèi)主要通過環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細胞色素P450單氧化酶途徑等進行代謝[20]。提高投喂頻率，可能會降低相應(yīng)代謝通路的物質(zhì)能量消耗。

UDP-葡萄糖可以通過糖原合酶合成糖原，作為動物細胞中的次要短期能量儲存。劍尾魚遭受饑餓脅迫后，肝臟中UDP-葡萄糖相對含量顯著下調(diào)[19]。與此研究結(jié)果一致，本研究中，高投喂頻率組的UDP-葡萄糖相對含量上調(diào)，表明糖原合成減少，或者其短期能量儲存較少。這是因為高投喂頻率組與低投喂頻率組相比，受到的饑餓脅迫程度較小。因此，UDP-葡萄糖相對含量上調(diào)或下調(diào)不僅能夠指示饑餓程度，還能反映投喂頻率對糖代謝的影響。蔡春芳等[3]研究結(jié)果表明，增加投喂頻率能顯著改善彭澤鯽對飼料糖的利用。孫金輝等[21]研究表明，在固定日投喂率的情況下，飼料糖水平為10%時，最佳投喂頻率為4次/d。在飼料中添加有機酸(如丁酸鈉)可以增加鯉機體對葡萄糖的耐受力，從而促進其生長[22]。因此，提高投喂頻率促進魚類生長，可能與飼料糖的利用效率提高有關(guān)。

牛磺酸與抗氧化、線粒體代謝調(diào)控有關(guān)。在飼料中添加?；撬釋π睅唪~(Epinepheluscoioides)肝臟組織代謝有積極調(diào)控作用[23]，對魚腸組織中的代謝物也有顯著影響[24]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，高投喂頻率組?；悄懰犸@著上調(diào)，說明增加投喂頻率能夠改善肝臟組織代謝。

胍基乙酸是肌酸的直接前體物質(zhì)，而肌酸是肌肉和神經(jīng)組織能量代謝中的一種重要化合物[25]。胍基乙酸廣泛分布在動物全身的各個器官中[26]，肝臟中的胍基乙酸，在腺苷甲硫氨酸-胍基乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成肌酸[27]。肌酸和磷酸肌酸一起組成磷酸原系統(tǒng)，促進能量代謝。本研究中，高投喂頻率組胍基乙酸相對含量下調(diào)，表明增加投喂頻率可減少體內(nèi)胍基乙酸合成。在植物蛋白源飼料中添加胍基乙酸，對卵形鯧鲹生長有促進作用[28]。因此，筆者認為，通過提高投喂頻率，與飼料中添加胍基乙酸一樣，能夠減少體內(nèi)胍基乙酸合成，從而促進魚類生長。

綜上，花生四烯酸、UDP-葡萄糖、?；悄懰岷碗一宜岬却x物均與能量代謝通路相關(guān)，因此，本研究結(jié)果支持投喂頻率影響魚類攝食能量代謝的觀點，為解析投喂頻率影響魚類生長的機制提供了新的試驗證據(jù)。

3.3 投喂頻率影響魚類生長的機制

投喂頻率影響魚類的攝食量和覓食活動能量消耗。投喂頻率增加，在一定范圍內(nèi)可以增加攝食量，從而影響魚類生長。但在攝食量相同的情況下，投喂頻率對生長的影響可能主要與食物消化代謝和合成代謝有關(guān)。本研究中，在相同的低投喂率(0.9%)條件下，發(fā)現(xiàn)投喂頻率對生長仍然具有顯著影響。通過肝臟代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，L-甲狀腺素、胍基乙酸與生長速率有關(guān)，前者隨生長速率增大相對含量表現(xiàn)上調(diào)，且在高投喂頻率組中的含量較高；后者隨生長率增高相對含量表現(xiàn)下調(diào)，且在低投喂頻率組中含量較高。降低投喂頻率可能迫使魚類分配更多的能量用于合成胍基乙酸，為攝食活動供能，導(dǎo)致生長較慢。L-甲狀腺素具有促進生長的功能[29]，而胍基乙酸可通過一系列的生化反應(yīng)增加能量的消耗，從而減慢魚類生長[27]。因此，增加投喂頻率，可能通過改變攝食節(jié)律，促進甲狀腺素分泌及減少胍基乙酸合成，從而促進魚類生長；降低投喂頻率，可能減少了甲狀腺素的分泌，并迫使魚類分配更多的能量用于合成胍基乙酸為攝食活動供能，從而導(dǎo)致生長減慢。

4 結(jié)論

1)在低于飽食投喂率條件下，投喂頻率增加到4次/d，有利于工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖珍珠龍膽石斑魚的生長。

2)在固定投喂率條件下，投喂頻率對生長的影響主要與能量代謝差異有關(guān)。

3)L-甲狀腺素和胍基乙酸等差異代謝物與投喂頻率引起的生長差異相關(guān)，可以作為生物標志物，用于最佳投喂頻率研究。