復合微生態(tài)制劑對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)老化生物濾池的在線修復作用

張康，李秋芬，崔正國，胡清靜，王慶奎

(1.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津 300392；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害重點實驗室，山東 青島 266071)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(recirculating aquaculture system，RAS)是一種以水的綜合循環(huán)利用為主要特征的新型高效養(yǎng)殖模式，具有節(jié)水、節(jié)地、節(jié)能和減排的優(yōu)點，同時又能為水產(chǎn)動物提供健康的生長環(huán)境[1-2]。RAS是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的重點領域[3]，從20世紀80年代至今，中國循環(huán)水養(yǎng)殖水產(chǎn)經(jīng)濟物種已超過100種[4]。

循環(huán)水養(yǎng)殖動物會產(chǎn)生大量排泄物，如氨氮、亞硝酸鹽、多種電解質(zhì)和尿素等，其中，氮是大多數(shù)養(yǎng)殖魚類排泄最多的物質(zhì)[5]。此外，殘餌在水體中大量分解，最終會在循環(huán)水中造成大量有害物質(zhì)積累，影響?zhàn)B殖魚類生長，甚至會造成魚類死亡[6]。生物濾池(biological filter，BF)作為循環(huán)水中水質(zhì)凈化處理的一個環(huán)節(jié)，具有重要的生物除氮作用，目前，應用最為廣泛的生物濾池是浸沒式生物濾池，其特點是濾料全部浸沒在水下[7]。RAS生物濾池內(nèi)的介質(zhì)應用較多的是表面積相對較大的塑料纖維絲和生物濾料，作用是提高生物膜上微生物承載量[8-9]。RAS中的微生物能夠?qū)⑾到y(tǒng)中有害物質(zhì)降解為無毒的物質(zhì)，如將氨氮、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為無害的分子氮、硝酸鹽[10-11]。生物濾池凈化水體的性能取決于所附著微生物的活性及溶解氧(DO)濃度、溫度、pH和鹽度等[12]。循環(huán)水系統(tǒng)運行時間過長會出現(xiàn)老化問題，同時微生物膜脫落會導致難聞氣味及處理效率降低等問題[13]。生物濾池重新掛膜及更換濾料不僅成本較大，周期也較長，會影響水產(chǎn)動物養(yǎng)殖生產(chǎn)[14]。目前，已有利用微生態(tài)制劑進行修復水體的相關報道，即通過微生物固定化技術，使微生物附著在生物濾池介質(zhì)表面，固定化微生物具有較強的耐受能力，從而能更好地凈化水質(zhì)及豐富生物膜組成[15]。改進水處理工藝與微生態(tài)制劑的配合使用，可加快水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展，然而，循環(huán)水養(yǎng)殖過程中通過在老化生物濾池中添加微生態(tài)制劑，達到在線快速修復老化生物濾池的報道尚不多見。本研究中，以養(yǎng)殖云龍石斑魚(Epinehelusmoara♀×E.lanceolatus♂)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)老化生物濾池為研究對象，在養(yǎng)殖池及老化的生物濾池潑灑復合微生態(tài)制劑，通過監(jiān)測生物濾池進水口和出水口的水質(zhì)和細菌等指標變化，考察復合微生態(tài)制劑對生物濾池的修復效果，以期為海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的高效運行提供技術保障，并為微生態(tài)制劑在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中應用推廣提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：2216E瓊脂培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司生產(chǎn))；濃硫酸(ρ=1.84 g/mL)、碘酸鉀、硫代硫酸鈉、磺胺、鹽酸萘乙二胺、鹽酸溶液(ρ=1.19 g/mL)、氫氧化鈉和次溴酸鈉等試劑均為分析純(國藥集團生產(chǎn))。

儀器：生化培養(yǎng)箱SHP-250(上海精宏實驗設備有限公司)，UV-2800A型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)

1.2 方法

1.2.1 試驗復合微生態(tài)制劑 試驗所用微生態(tài)制劑(HS-CP-XXX系列水體修復復合菌群)為本研究團隊與青島宏洋生物科技有限公司共同研發(fā)，其由多個互利共生、協(xié)同作用菌群共同發(fā)酵的液態(tài)微生態(tài)制劑組成，包括芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和放線菌等，有效菌量為109～1010CFU/mL，具有快速形成優(yōu)勢菌群并凈化水質(zhì)的特點。

1.2.2 試驗設計 試驗設置試驗池和對照池，分別為山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司7號車間的7號和8號循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖品種均為云龍石斑魚。試驗和對照系統(tǒng)均包括10個6 m×6 m的養(yǎng)殖池和1個4 m×4 m介質(zhì)為塑料纖維絲的4級曝氣生物濾池(biological aerated filter，BAF)。7號循環(huán)水系統(tǒng)出現(xiàn)生物濾池老化、水質(zhì)惡化現(xiàn)象，氨氮、亞硝酸和CODMn質(zhì)量濃度分別達到0.517、0.483、7.28 mg/L，已無法正常投餌養(yǎng)殖。8號為正常生物濾池。每天向7號系統(tǒng)生物濾池和養(yǎng)殖池水體中潑灑復合微生態(tài)制劑，每次1 000 mL，早、晚各一次，連續(xù)潑灑15 d。試驗期間，每3 d采集一次水樣，監(jiān)測生物濾池進水口、出水口的水質(zhì)指標；停止添加微生態(tài)制劑之后，繼續(xù)跟蹤監(jiān)測，試驗周期為39 d。

1.2.3 指標的測定

1)水質(zhì)指標。利用水質(zhì)檢測儀(AZ86031，蘇州羅伯克測控技術有限公司)每天實時測定水體的溫度(℃)、DO、pH和鹽度等指標。

采集循環(huán)水系統(tǒng)生物濾池進水口及出水口水樣，測定氨氮、亞硝酸鹽和溶解性有機物含量。依據(jù)GB 17378.4—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范第四部分：海水分析》，采用次溴酸鹽氧化法測定氨氮含量，采用萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽含量，于543 nm波長下測定吸光值，采用堿性高錳酸鉀法測定化學需氧量(CODMn)。

2)弧菌及異養(yǎng)菌。采集循環(huán)水系統(tǒng)生物濾池進水口及出水口水樣，依據(jù)GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范第七部分：近海生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測》中的方法測定異養(yǎng)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量。對水樣進行合適梯度稀釋，取100 μL涂布2216E和TCBS平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，進行菌落計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用Origin 2018軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Ducan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 修復期間循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)指標的變化

從表1可見，試驗池和對照池水體的水溫均在22.5 ℃左右，鹽度約為31.50，pH為7.30～7.50，DO>5.70 mg/L，兩個循環(huán)水系統(tǒng)的這些水質(zhì)指標無顯著性差異(P>0.05)。

表1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物凈化池及養(yǎng)殖池水質(zhì)指標Tab.1 Water quality indices of biological purification pond and aquaculture pond in the circulating water aquaculture system

2.2 修復期間生物濾池亞硝酸鹽去除效率的變化

從圖1可見：加入微生態(tài)制劑3 d后，試驗組生物濾池亞硝酸鹽去除率開始上升，15 d時從修復前(0 d)的28.34%提高至47.24%，提高了18.90%，略高于對照組平均值(45.69%)；隨著加入復合微生態(tài)制劑時間的延長，試驗組生物濾池進水口亞硝酸鹽的濃度不斷下降，從修復前的0.483 mg/L顯著降至15 d時的0.352 mg/L(P<0.05)。這表明，通過向生物濾池添加復合微生態(tài)制劑，使其在3 d內(nèi)恢復去除亞硝酸氮的能力，15 d后去除率提高至47.24%，并保持穩(wěn)定。

標有不同字母者表示同一水池位置不同時間點間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Note：The means with different letters in different time in the same pool location are significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letter in different time in the same group are not significant differences，et sequentia.圖1 復合微生態(tài)制劑對生物濾池亞硝酸鹽去除效率的影響Fig.1 Effects of compound probiotics on nitrite purification efficiency in the biofilter

2.3 修復期間生物濾池氨氮去除效率的變化

從圖2可見：加入復合微生態(tài)制劑6 d后，試驗組生物濾池對氨氮的去除率開始升高，15 d時去除率由修復前的27.28%提高至46.07%(P<0.05)，較修復前提高了18.79%，略低于對照組平均值(52.29%)；通過添加復合微生態(tài)制劑，生物濾池進水口氨氮含量同樣不斷下降，從修復前的0.517 mg/L顯著降至15 d時0.417 mg/L(P<0.05)，養(yǎng)殖水質(zhì)得以提高。

圖2 復合微生態(tài)制劑對生物濾池氨氮去除效率的影響Fig.2 Effects of compound probiotics on ammonia nitrogen purification efficiency in the biofilter

2.4 修復期間生物濾池水體中有機物含量的變化

從圖3可見：添加復合微生態(tài)制劑可顯著降低生物濾池水體中的有機物含量(P<0.05)，添加微生態(tài)制劑3 d時水體中CODMn質(zhì)量濃度由修復前的7.28 mg/L上升至8.17 mg/L，之后開始下降，12 d時降至5.70 mg/L，較添加微生態(tài)制劑前顯著降低21.70%(P<0.05)；與對照組相比，修復9 d后的生物濾池水體中有機物含量顯著降低(P<0.05)。

標有不同大寫字母者表示同一時間下不同組間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同小寫字母者表示同一組內(nèi)不同時間點間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Note：The means with different capital letters in same time are significantly different in different groups at the 0.05 probability level，means with different letters in different time in the same group being significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences，et sequentia.圖3 復合微生態(tài)制劑對生物濾池水體中化學需氧量去除能力的影響Fig.3 Effects of composite probiotics on chemical oxygen demand removal capacity in the biofilter

2.5 修復期間生物濾池水體中異養(yǎng)菌和弧菌數(shù)量的變化

從圖4可見：添加復合微生態(tài)制劑3 d后，試驗系統(tǒng)水體內(nèi)的弧菌數(shù)量開始下降，15 d時弧菌數(shù)量由修復前的7.9×103CFU/mL下降至4.5×103CFU/mL，弧菌數(shù)量減少43.04%；對照組弧菌數(shù)量始終在5.6×103CFU/mL上下浮動，試驗組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖4 復合微生態(tài)制劑對生物濾池水體中弧菌數(shù)量的影響Fig.4 Effects of compound probiotics on the number of Vibrios in biofilter water

從圖5可見，試驗開始時，添加微生態(tài)制劑后，生物濾池中的異養(yǎng)菌含量增加，3 d時異養(yǎng)菌數(shù)量急增至6.4×105CFU/mL左右，6 d后異養(yǎng)菌含量緩慢下降，但也能維持在1.7×105CFU/mL左右，且始終顯著高于同時期對照組異養(yǎng)菌數(shù)量(1.1×105CFU/mL)(P<0.05)。

圖5 復合微生態(tài)制劑對生物濾池水體中異養(yǎng)菌數(shù)量的影響Fig.5 Effects of compound probiotics on the number of heterotrophic bacteria in biofilter water

從圖6可見，試驗組弧菌占比在試驗開始時為4%左右，隨著修復試驗的進行，在試驗的第42天時下降至2%以下，而對照組在第42天時弧菌占比增長至5%左右且顯著高于試驗初期(P<0.05)。說明有益菌在養(yǎng)殖系統(tǒng)中占有絕對優(yōu)勢地位，弧菌在總菌中的占比越低，疾病發(fā)生的風險就越低。

圖6 復合微生態(tài)制劑對生物濾池水體中弧菌占比的影響Fig.6 Effects of compound probiotics on Vibrio proportion in biofilter water

3 討論

3.1 復合微生態(tài)制劑對老化生物濾池水質(zhì)的影響

利用循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖海水魚類，需要滿足較高的環(huán)境指標要求，如溫度、鹽度、pH和DO水平等。這些指標過高或過低都會影響?zhàn)B殖水體中微生物的新陳代謝，降低相關酶活性[16]，進而影響魚類生長。隗陳征等[17]通過聚碳酸亞丙脂(PPC)凝膠親水填料和海綿鐵以3∶1(質(zhì)量比)混合形成復合固定化生物填料引入BAF系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)，0 h 曝氣處理由于缺少氧氣供應，無法強化硝化反應，導致系統(tǒng)整體脫氮能力低于12 h和24 h組。本研究中，生物濾池中采用塑料纖維絲作為介質(zhì)，試驗組和對照組循環(huán)水系統(tǒng)中曝氣生物濾池及養(yǎng)殖池水溫均高于22.4 ℃，pH為7～8，鹽度約為31.50，DO為6 mg/L左右，能夠保證微生物正常生命活動，硝化反應等能夠正常進行，均滿足云龍石斑魚的正常生長。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的常規(guī)水處理是應對可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖挑戰(zhàn)的一項關鍵技術，需要常常在循環(huán)水養(yǎng)殖中發(fā)明和引進新的技術，以推動水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展[18]。生物濾池處于循環(huán)水處理核心環(huán)節(jié)，其凈化水體的能力對養(yǎng)殖系統(tǒng)影響極大，通過添加不同的生物濾料或者其他介質(zhì)來提高生物濾池凈化水體能力的研究較多，如以水生浮游植物、海藻石莼[19]作為生物過濾器，可提高養(yǎng)殖尾水中氨氮和亞硝酸鹽的去除效果。目前，也有直接在生物濾池中添加微生態(tài)制劑去除危害因子的研究，如Gross等[20]將通過土壤富集的硝化菌應用于實驗室的南美白對蝦水族箱養(yǎng)殖，其處理氨氮的效率大大提高，可用于開發(fā)細菌改良劑(益生菌產(chǎn)品)，用作系統(tǒng)的啟動劑以恢復受損的生物過濾器。本試驗結果與之相似，微生態(tài)制劑不但能夠提高系統(tǒng)的凈化效率，且生物濾池凈化功能也迅速恢復了正常。通過添加復合微生態(tài)制劑，CODMn質(zhì)量濃度呈先上升后下降的趨勢，可能是由于加大曝氣量后，老化生物膜脫落，被微生態(tài)制劑中的有機物降解菌分解，引起有機物含量短暫升高；而后微生態(tài)制劑中有益菌對一些大分子物質(zhì)進一步分解[21]，使CODMn質(zhì)量濃度隨之下降，且復合微生態(tài)制劑中的大量有益菌在載體上附著，形成新的生物膜，故在停止加菌后，養(yǎng)殖系統(tǒng)仍能維持較好的水質(zhì)凈化能力。

本試驗中，通過在養(yǎng)殖池和老化生物濾池內(nèi)添加復合微生態(tài)制劑，一方面維持了養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)凈化能力，另一方面完成了生物膜的更替，其去除氨氮、亞硝酸鹽及CODMn的能力得以恢復，老化生物濾池凈化水體的效率提高了20%以上。生物濾池凈化水體的能力恢復，水交換率、水產(chǎn)養(yǎng)殖成本和潛在的環(huán)境污染就會降低。生物濾池凈化水體的效率還與水力停留時間、沖洗周期等相關[22]，后期需要找到合適的點來配合微生態(tài)制劑的使用，以得到更好的凈化效果。

3.2 復合微生態(tài)制劑對老化生物濾池內(nèi)微生物數(shù)量的影響

副溶血性弧菌等弧菌類細菌是海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中一類常見的細菌病原體，是世界范圍內(nèi)食源性疾病的主要病原[23]，嚴重威脅人類的健康，因此，迫切需要尋找相關措施預防并治療副溶血弧菌等引起的疾病，在此方面微生態(tài)制劑成為首選。Shareer等[24]研究表明，枯草芽孢桿菌MFB10、無芽孢桿菌MFB2和堅定芽孢桿菌MFB7這3種分離菌株具有抑制毒力基因表達的作用，在體內(nèi)攻毒試驗中，這些芽孢桿菌可保護斑節(jié)對蝦幼蟲抵抗哈維氏弧菌MFB3感染。Wang等[25]從健康的南美白對蝦后腸中分離出的菌株CDM8和CDA22，通過紙片法研究發(fā)現(xiàn)，其對副溶血弧菌均有拮抗作用，且混合餌料培養(yǎng)，可顯著降低凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)的死亡率。本研究中，復合微生態(tài)制劑中含有芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌等，水體中添加復合微生態(tài)制劑后發(fā)現(xiàn)，試驗組水體中弧菌數(shù)量一直下降，與上述研究結果相似，另外，弧菌與總菌的比值也一直在下降，而且顯著低于對照組，說明該復合微生態(tài)制劑也具有抑制弧菌生長的能力，與葉海斌等[26]在循環(huán)水系統(tǒng)中添加不同復合微生態(tài)制劑可降低弧菌數(shù)量的結果相同。推測原因，可能是復合微生態(tài)制劑具有增強魚類抗氧化防御機制[27]，與有害菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，占據(jù)生存繁殖空間，從而抑制或者滅除了病原菌，具體機制還要進一步試驗證明。

3.3 復合微生態(tài)制劑對老化生物濾池內(nèi)微生態(tài)平衡的影響

本試驗開始前，生物濾池水體中弧菌數(shù)量較多，其原因可能是由于生物濾池老化，生物膜脫落較嚴重，難以發(fā)揮有益菌對于弧菌的拮抗作用所致；添加復合微生態(tài)制劑后，有益菌數(shù)量慢慢增加，并形成優(yōu)勢菌群，生物膜的生物凈化作用恢復，同時弧菌數(shù)量顯著下降。本研究說明，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，利用微生物固定化技術進行生物強化掛膜是一個簡單高效的方法。通過添加復合微生態(tài)制劑，將有益微生物固定在介質(zhì)表面，正常生長繁殖代謝，可豐富水體中的微生物組成，使水體中微生物結構發(fā)生變化，從而優(yōu)化了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)環(huán)境[28]。因此，對養(yǎng)殖環(huán)境的適當改變可以提高養(yǎng)殖效益，本研究中這一優(yōu)勢尤其顯著，控制養(yǎng)殖環(huán)境的同時，加入的復合微生態(tài)制劑，不但增加了異養(yǎng)菌數(shù)量，而且有效降低了弧菌等有害菌的數(shù)量，微生物的豐度水平隨之提高，生態(tài)環(huán)境也得以改善。另外，直接潑灑微生態(tài)制劑可能會造成流失，若利用微生態(tài)制劑重新掛膜，制成固定化生物膜，可能會有更好的效果，且微生態(tài)制劑的使用要根據(jù)動物生長周期及養(yǎng)殖條件合理配合使用，以期能最大程度地發(fā)揮微生態(tài)制劑的作用。

4 結論

1)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)老化生物濾池中添加復合微生態(tài)制劑，通過微生物固定在生物濾池介質(zhì)表面，可快速在線恢復生物濾池凈化水體的能力，有效提高亞硝酸鹽及氨氮等危害因子的去除率，微生態(tài)制劑對生物濾池的修復作用效果明顯。

2)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)老化生物濾池中添加復合微生態(tài)制劑，提高了水體中微生物的豐度，水體中異養(yǎng)菌的數(shù)量維持在1.7×105CFU/mL，提高了生物膜的完整性；水體中弧菌數(shù)量減少了43.04%，可以有效地防治細菌性病害，減少致病性細菌對水產(chǎn)動物的危害，促進了石斑魚的生長。