血液和尿液中7種新型苯二氮卓類藥物UPLC-MS/MS檢驗(yàn)

宋 昕,王 龍,王辰雪,劉 宸,曹廣生,徐 巧

( 1.合肥市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所,合肥 230001;2.杭州譜育科技發(fā)展有限公司,杭州 311300 )

新型苯二氮卓類藥物(novel benzodiazepines)是不法分子為了逃避監(jiān)管通過對(duì)苯二氮卓類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾而得到的具有類似苯二氮卓藥物作用的策劃藥[1]。與苯二氮卓類藥物相比，此類藥物沒有明確的安全性數(shù)據(jù)，能夠產(chǎn)生催眠、鎮(zhèn)靜等作用，高劑量會(huì)導(dǎo)致記憶喪失甚至死亡，因此被犯罪分子作為管制藥物的替代品、毒品添加劑，用于“麻醉強(qiáng)奸”“麻醉搶劫”等案件，嚴(yán)重威脅到社會(huì)公共安全[2]。聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室(UNODC)發(fā)布的《2021 年度世界毒品報(bào)告》指出每年新精神活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的品種數(shù)量基本保持穩(wěn)定，但新型苯二氮卓類藥物卻呈現(xiàn)了增長的趨勢，并且在成員國所上報(bào)涉及新型物質(zhì)的案件中超過三分之二的案件與新型苯二氮卓類藥物有關(guān)[3]。目前我國已將氟阿普唑侖、瑞馬唑侖、科納唑侖、氟溴唑侖、依替唑侖5 種新型苯二氮卓類藥物列入非藥用類麻醉藥品和精神藥品列管清單[4]。上述藥物在國內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)濫用情況，對(duì)公安機(jī)關(guān)的檢驗(yàn)鑒定提出新的挑戰(zhàn)。

國內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)苯二氮卓類藥物的檢驗(yàn)研究已經(jīng)相對(duì)較為成熟，可以通過免疫法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-10]、拉曼光譜法[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]等進(jìn)行檢驗(yàn)，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)常被用于生物檢材中藥物的檢驗(yàn)。目前國內(nèi)外針對(duì)生物檢材中新型苯二氮卓類藥物檢驗(yàn)雖有報(bào)道，但檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)藥物較少。如Wache?ko 等[15]對(duì)真實(shí)案例中血液、尿液和玻璃體中 科納唑侖、溴替唑侖和依替唑侖進(jìn)行方法學(xué)研究；Heide 等[18]對(duì)刑事案件血液中科納唑侖、氟阿普唑侖、溴替唑侖和依替唑進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定。本文采用乙腈沉淀蛋白法結(jié)合UPLC-MS/MS 的檢驗(yàn)方法對(duì)血液和尿液中科納唑侖、瑞馬唑侖、氟阿普唑侖、氟溴唑侖、?，斶騺?、溴替唑侖、依替唑侖共7 種新型苯二氮卓類藥物(其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示)的定性定量進(jìn)行了研究，為公安機(jī)關(guān)鑒定和研究新型苯二氮卓類藥物提供相應(yīng)的借鑒和參考。

圖1 7種新型苯二氮卓類藥物結(jié)構(gòu)式(a:科納唑侖;b:瑞馬唑侖;c:氟阿普唑侖;d:氟溴唑侖;e:?，斶騺?f:溴替唑侖;g:依替唑侖)Fig.1 Structural formulas of 7 novel benzodiazepines ( a: clonazolam; b: remimazolam; c: f lualprazolam; d: f lubromazolam;e: bromazolam;f: brotizolam; g: etizolam)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ULC 510 超高效液相色譜儀、EXPEC 5210 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(杭州譜育科技發(fā)展有限公司)。

甲醇、乙腈和甲酸(色譜純，美國默克公司)；科納唑侖，瑞馬唑侖，氟阿普唑侖，氟溴唑侖，?，斶騺?，溴替唑侖，依替唑侖，阿普唑侖-D5(濃度均為0.1 mg/mL，純度≥99%；天津阿爾塔科技有限公司)；超純水(Milli-Q Direct 純水/超純水一體化系統(tǒng)，美國密理博公司)；實(shí)驗(yàn)用血均來自中心血站，實(shí)驗(yàn)用尿均來自健康志愿者。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將濃度為0.1 mg/mL 的科納唑侖，瑞馬唑侖，氟阿普唑侖，氟溴唑侖，?，斶騺觯逄孢騺?，依替唑侖用甲醇分別配制成1 μg/mL、0.1 μg/mL 兩種濃度的單標(biāo)和混標(biāo)；0.1 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-D5 用甲醇配制為1 μg/mL 和0.1 μg/mL 的單標(biāo)。

1.3 樣品前處理

在10 mL具蓋離心管中加入血液或尿液樣品1 mL，加入10 μL 濃度為1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-D5，乙腈3 mL，充分振蕩提取，高速離心后，上清液過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜后，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；柱溫：40℃；流動(dòng)相 A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相 B：乙腈；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；洗脫方式：梯度洗脫條件見表1。

表1 超高效液相色譜分離條件Table 1 Separation conditions for UPLC

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式(ESI+)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢驗(yàn)；毛細(xì)管高壓為4.5 kV，去溶劑氣溫度為500 ℃，霧化氣流量為1 L/min，去溶劑氣流量為5 L/min，反吹氣流量為1 L/min，碰撞氣為高純氮?dú)?，流量?.45 mL/min。定性及定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能見表2。

表2 7種 新型苯二氮卓類藥物及其內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和檢驗(yàn)參數(shù)Table 2 Retention time and mass spectral parameters of 7 novel benzodiazepines and internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本文利用7 種新型苯二氮卓類藥物及內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-D5 的空白添加樣品對(duì)有機(jī)流動(dòng)相甲醇和乙腈，水流動(dòng)相純水和0.1%甲酸水進(jìn)行考察，結(jié)果表明7種化合物及內(nèi)標(biāo)在0.1%甲酸水-乙腈體系中離子化效率更高，峰形更好。最終確定0.1%甲酸水-乙腈體系作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別使用濃度為0.1 μg/mL 的科納唑侖等7 種新型苯二氮卓類藥物及內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-D5 單標(biāo)溶液，采用電噴霧離子源正離子模式對(duì)每一種化合物錐孔電壓和碰撞能進(jìn)行優(yōu)化。首先將化合物在MS1 Scan模式下采集，獲得[M+H]+分子離子峰，并優(yōu)化出最優(yōu)的錐孔電壓；其次將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在product ion 模式下采集，選取干擾小且響應(yīng)較高的兩個(gè)子離子，其中響應(yīng)高的作為定量離子，響應(yīng)低的作為定性離子；最后將化合物在MRM 模式下采集，優(yōu)化化合物的碰撞電壓；并將響應(yīng)最弱的化合物在MRM 模式下進(jìn)行采集，對(duì)離子源的毛細(xì)管高壓和去溶劑氣溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終獲得最優(yōu)的質(zhì)譜條件。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 方法專屬性考察

本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備10 份不同人的空白血液和尿液，將其中1 份空白血液和尿液分別添加10 μL 的濃度為1 μg/mL 的7 種新型苯二氮卓類藥物混標(biāo)和內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-D5 后，與其余9 份空白血液和尿液全部按1.3 處理，在1.4 的條件下進(jìn)行分析，考察空白血液和尿液對(duì)目標(biāo)物的干擾。在空白血液或尿液基質(zhì)中，7 種化合物及內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間附近均未出現(xiàn)明顯色譜峰，血液或尿液基質(zhì)中的內(nèi)源性雜質(zhì)不會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)形成干擾，本文方法具有較高的專屬性。

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限

以空白血液和尿液為基質(zhì)，分別制備1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 系列濃度基質(zhì)添加樣品，其中內(nèi)標(biāo)添加量為10 ng/mL。按1.3 處理，1.4 條件下進(jìn)行檢驗(yàn)分析，每個(gè)添加濃度平行3 份。以各目標(biāo)物基質(zhì)加標(biāo)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)，定量離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)(y)，擬合得到的線性回歸方程見表3。結(jié)果表明血液或尿液中7 種新型苯二氮卓類藥 物在1 ～100 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.998。以信噪比S/N ＞3 1 作為檢出限，本方法中7 種目標(biāo)物最低檢出限(LOD)均不高于0.32 ng/mL。

表3 7種新型苯二氮卓類藥物的線性方程、R2和檢出限Table 3 Linear equations, correlation coeff icients and detection limits of the 7 novel benzodiazepines

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

本文采用后加入法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)影響的考察。分別取空白血液和尿液，按照1.3 處理，獲得空白基質(zhì)提取液，用于配制濃度為5、50、100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定相對(duì)峰面積為Sa，用甲醇配制5、50、100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定相對(duì)峰面積為Sb。通過相對(duì)峰面積比值Sa/Sb (%)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在低、中、高三種濃度時(shí)，7 種新型苯二氮卓類藥物在血液或尿液中基質(zhì)效應(yīng)在90.49%～109.81%之間，本方法基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

表4 7種新型苯二氮卓類藥物在血液或尿液中的提取回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of the 7 novel benzodiazepines in blood and urine

2.3.4 回收率和精密度

分別對(duì)空白血液和尿液在5、50、100 ng/mL 三種濃度水平上進(jìn)行添加。每個(gè)添加濃度制備6 份樣品，按1.3 處理，1.4 條件下進(jìn)行檢驗(yàn)分析，回收率結(jié)果見表4。在一天的早、中、晚三個(gè)時(shí)間段按回收率考察相同操作后檢驗(yàn)分析，計(jì)算相對(duì)峰面積的相對(duì)偏差，獲得日內(nèi)精密度。連續(xù)檢驗(yàn)3 d，計(jì)算相對(duì)峰面積的相對(duì)偏差，獲得日間精密度，結(jié)果見表4。結(jié)果表明7 種新型苯二氮卓類藥物在血液或尿液中采用沉淀蛋白法的提取回收率在82.96%～106.13%之間，相對(duì)峰面積日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)均不高于5.36%，表明本方法具有較好的提取回收率和精密度。

3 應(yīng)用案例

2022 年5 月29 日，某市劉某(女)被犯罪嫌疑人麻醉強(qiáng)奸，案發(fā)15 h 后，采集受害人血液和尿液，通過本方法檢驗(yàn)后血液和尿液中均檢出氟阿普唑侖。

2022 年8 月14 日，某市李某某(女)被犯罪嫌疑人麻醉強(qiáng)奸，案發(fā)31 h 后，采集受害人血液和尿液，通過本方法檢驗(yàn)后血液和尿液中均檢出溴替唑侖。

4 結(jié)論

本研究以目前國內(nèi)外增長較為迅速且對(duì)社會(huì)公共安全威脅較大的的新型苯二氮卓類藥物為對(duì)象，針對(duì)案件中常用的血液或尿液兩種生物檢材，建立了UPLC-MS/MS 法同時(shí)檢驗(yàn)血液或尿液中7 種新型苯二氮卓類藥物的分析方法。本方法專屬性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高，為公安機(jī)關(guān)打擊新型苯二氮卓類藥物濫用、“麻醉搶劫”和“麻醉強(qiáng)奸”等案件提供重要參考方法與技術(shù)支持。