2014—2022年寧夏不同地區(qū)奶牛艾美耳球蟲病流行病學(xué)調(diào)查

黎玉瓊，于有利*，從志鵬，郭亞男，薛峰

(1. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

牛球蟲病是一種由艾美耳屬原蟲引起的全球性疾病，給全球諸多國家的農(nóng)場社區(qū)和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛球蟲病在許多國家被認(rèn)為是一種常見病，可流行于不同階段的牛群中，但在臨床上主要影響1歲以內(nèi)的小牛。該病主要是由于在短時(shí)間內(nèi)攝入大量卵囊引起的，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下時(shí)更容易發(fā)生。初乳缺乏、放養(yǎng)密度高、營養(yǎng)不良等原因被認(rèn)為是牛球蟲病重要的誘發(fā)因素[1-4]。

艾美耳球蟲是頂復(fù)動(dòng)物亞門的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，主要侵襲腸上皮細(xì)胞并在其中繁殖。艾美耳球蟲生命周期由內(nèi)生的無性繁殖和有性發(fā)育組成[5]。無性繁殖是通過裂殖體產(chǎn)生裂殖子進(jìn)行傳代，寄生的細(xì)胞最后破裂并釋放出細(xì)長的裂殖體，入侵周圍的大腸黏膜細(xì)胞，在黏膜細(xì)胞中又分裂為更小的第二代裂殖體，隨后是有性繁殖，第二代裂殖體又分裂為成熟雄配子母細(xì)胞和成熟雌配子母細(xì)胞。每個(gè)母細(xì)胞產(chǎn)生大約100個(gè)有活力的配子，從而形成合子。合子被包裹在保護(hù)壁中，形成了從宿主釋放到外部環(huán)境中的卵囊[5]。寄生于牛體的各種球蟲種屬中，以牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲2種球蟲致病力最強(qiáng)，且是最常見的，其他的艾美耳球蟲也可引起較小程度的感染[6]。在臨床上，對于球蟲病的診斷主要根據(jù)牛艾美耳球蟲形態(tài)學(xué)來鑒定種類，通過臨床癥狀、腸道病變及球蟲卵囊數(shù)(OPG)來鑒定球蟲病[7-8]。本研究通過調(diào)查寧夏不同地區(qū)奶牛球蟲病的流行狀況并分析其潛在的相關(guān)危險(xiǎn)因素，從而為奶牛球蟲病的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小型臺(tái)式離心機(jī)購自Eppendorf公司，飽和食鹽水和離心管購自上海碧云天有限公司，40目銅絲網(wǎng)、60目銅絲網(wǎng)和麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)板購自上海富雪生物有限公司，多功能電子天平等購自中國沈陽龍騰電子有限公司，奧林巴斯生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

8 374份奶牛新鮮糞樣，于2014—2022年按照不同月齡采集寧夏不同地區(qū)未進(jìn)行驅(qū)蟲的集約化奶牛場。采樣方法為直腸采樣或收集地面上剛排泄的新鮮糞便，采集的糞便保存于2.5%重鉻酸鉀溶液的離心管內(nèi)，置于4 ℃保存，待檢。

1.2.2 球蟲卵囊計(jì)數(shù)

通過麥克馬斯特法對球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)。取2 g糞樣置于干凈的100 mL燒杯內(nèi)，加入8 mL飽和食鹽水溶液，用玻璃棒搗碎混勻糞樣，再加入50 mL飽和食鹽溶液，混勻后立即用60目篩網(wǎng)過濾，吸取濾液充滿2個(gè)計(jì)數(shù)室，在顯微鏡載物臺(tái)上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。每個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)有100個(gè)方格(1 cm×1 cm×0.15 cm)。待分別查完2個(gè)計(jì)數(shù)室100個(gè)方格內(nèi)的卵囊數(shù)量n1和n2，按照如下公式計(jì)算OPG[9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60/2。

1.2.3 球蟲卵囊形態(tài)觀察

按照之前文獻(xiàn)描述方法[10-11]，收集保存鏡檢球蟲卵囊陽性的糞樣每份20 g，將糞樣加入50 mL離心管中，加入適量水?dāng)嚢杈鶆?。然后?0目和60目銅篩分別過濾，向過濾后的液體中加適量PBS緩沖液，于3 500 r/min離心15 min，棄去上清液。加入適量飽和食鹽水，于2 000 r/min離心10 min，糞渣沉于管底，卵囊漂浮于飽和食鹽水表面，用移液槍吸取10 μL上清液于載玻片上，加蓋玻片后于40倍顯微鏡下觀察卵囊形態(tài)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用皮爾遜相關(guān)系數(shù)，確定氣候參數(shù)(平均相對濕度、降水量、平均氣溫和平均地表溫度)與感染率和均值的相關(guān)性。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份奶牛球蟲陽性率和感染蟲種

對比不同年份奶牛球蟲感染率，結(jié)果如圖1所示，2014—2022年奶牛球蟲平均感染率為35.90%。2014—2017年期間奶牛球蟲病的發(fā)病率呈逐年增長趨勢，2018—2019年呈下降趨勢，2019—2020年呈上升趨勢，2020—2022年呈下降趨勢。共檢出的12種艾美耳球蟲，分別是亞球形艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、皮利他艾美耳球蟲、柱狀艾美耳球蟲、阿拉巴艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲、巴西艾美耳球蟲、拔克朗艾美耳球蟲、加拿大艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲和懷俄明艾美耳球蟲(圖2)。

括號中數(shù)值表示不同年份球蟲陽性樣品數(shù)/不同年份采集的樣品總數(shù)。圖1 2014—2022年奶牛球蟲感染情況

A.亞球形艾美耳球蟲；B.柱狀艾美耳球蟲；C.橢圓艾美耳球蟲；D阿拉巴艾美耳球蟲；E.邱氏艾美耳球蟲；F.牛艾美耳球蟲；G.加拿大艾美耳球蟲；H.懷俄明艾美耳球蟲；I.奧博艾美耳球蟲；J.巴西艾美耳球蟲；K.皮利他艾美耳球蟲；L.拔克朗艾美耳球蟲。圖2 12種艾美耳球蟲形態(tài)

2.2 不同月齡奶牛球蟲病發(fā)病率、優(yōu)勢蟲種及感染強(qiáng)度

如圖3所示，0～6月齡犢牛球蟲感染率呈明顯增長趨勢，7月齡育成牛較6月齡犢牛有所降低，8月齡育成牛較7月齡育成牛感染率再次上升，9～12月齡育成牛較8月齡育成牛感染率下降。另外，不同月齡牛的主要優(yōu)勢蟲種不同，如圖4所示，1、2、4、6、9和12月齡牛的優(yōu)勢蟲種為牛艾美耳球蟲，3月齡優(yōu)勢蟲種為柱狀艾美耳球蟲，5月齡優(yōu)勢蟲種為皮利他艾美耳球蟲，7月齡牛優(yōu)勢蟲種為亞球形艾美耳球蟲，8月齡牛優(yōu)勢蟲種為懷俄明艾美耳球蟲，10月齡和11月齡牛優(yōu)勢蟲種為巴西艾美耳球蟲，總體分析牛艾美耳球蟲為1歲以內(nèi)牛的主要優(yōu)勢蟲種。不同月齡牛感染的OPG也不同，其中7月份OPG最高為2 432，12月OPG最低為387(圖5)。

括號中數(shù)值表示不同月齡球蟲陽性樣品數(shù)/不同月齡采集的樣品總數(shù)。圖3 不同月齡奶牛球蟲病檢測結(jié)果

圖4 不同月齡牛的蟲種變化

圖5 不同月齡感染牛平均OPG

2.3 不同月份球蟲病的發(fā)病率

如圖6所示，不同月份艾美耳球蟲感染率不同，其中球蟲病高發(fā)月份主要基中在4—11月份，1—6月份呈上升趨勢，7—12月份呈下降趨勢。

括號中數(shù)值表示不同月份球蟲陽性樣品數(shù)/不同月份采集的樣品總數(shù)。圖6 不同月份球蟲病感染率統(tǒng)計(jì)

2.4 球蟲病的風(fēng)險(xiǎn)因素分析

如表1和表2所示，艾美耳球蟲病感染率與平均相對濕度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與降水量、平均氣溫、平均地表溫度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表1 不同月份氣象數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表2 不同因素與感染率相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

牛球蟲病是奶牛養(yǎng)殖過程中常見的一類腸道疾病，以出血性腸炎為主要臨床癥狀，可導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉、生長發(fā)育緩慢、生產(chǎn)性能下降，甚至死亡[12-13]。藥物是控制球蟲病的主要方式，但其使用存在著諸多問題[14]。近年來，在綠色養(yǎng)殖理念的指導(dǎo)下，減抗在養(yǎng)殖中得到深入的開展，但是由于尚未出現(xiàn)有效的替抗產(chǎn)品，集約化養(yǎng)殖中牛艾美耳球蟲的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢[15-16]。

本研究于2014—2022年采集寧夏不同地區(qū)8 374份樣本，發(fā)現(xiàn)2014—2017年球蟲感染率呈上升趨勢，主要是因?yàn)?014—2017年寧夏地區(qū)養(yǎng)殖戶及科研人員對球蟲病的認(rèn)識(shí)不足，沒有有效的診斷方法和及時(shí)的治療。2018—2019年球蟲感染率呈下降趨勢，是因?yàn)殡S著大部分養(yǎng)殖企業(yè)和飼料公司對腸道寄生蟲病認(rèn)識(shí)的提高，莫能菌素等藥物作為飼料添加劑進(jìn)行飼喂。2019—2020年感染率再次升高，是因?yàn)?020年以來我國為了加強(qiáng)動(dòng)物肉食品安全而推動(dòng)的限抗、禁抗等工作，獸藥端限抗，飼料中則完全禁止添加抗生素，因此造成了許多地區(qū)出現(xiàn)了球蟲病暴發(fā)的情況，球蟲感染率也明顯提高。2020—2022年趨勢有所下降，2020年以來，隨著寄生蟲相關(guān)知識(shí)進(jìn)一步的普及和培訓(xùn)，養(yǎng)殖戶對寄生蟲感染的認(rèn)識(shí)不斷提高，通過提高圈舍衛(wèi)生和增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力而降低感染率。

本研究通過對不同月齡的糞樣進(jìn)行檢查和分析，發(fā)現(xiàn)0～6月齡球蟲感染率呈明顯增長趨勢，其中3～6月齡犢牛尤其易感。據(jù)走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)合理的分群和飼養(yǎng)密度的意識(shí)，一般會(huì)根據(jù)犢牛個(gè)體大小的方法分群，斷奶、混群應(yīng)激、密度和分群跨度是球蟲病感染的重要因素。正確的分群方法應(yīng)是同一圈舍年齡跨度控制在1月齡以內(nèi)。6～8月齡感染率雖是最高，但感染強(qiáng)度不大，因?yàn)榇藭r(shí)牛體瘤胃菌群已建立，機(jī)體整體免疫力和抵抗力增強(qiáng)。9～12月齡的感染率雖呈現(xiàn)下降趨勢，但是牛體長期帶蟲，持續(xù)向外界排泄卵囊，污染環(huán)境，不斷增加牧場球蟲感染壓力。另外，不同月份感染率也不同，其中球蟲病高發(fā)月份主要集中在4—11月份。為了探究其原因，本研究通過對寧夏地區(qū)不同月份平均氣溫、降水量、平均相對濕度、平均地表溫度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)了球蟲感染率與平均相對濕度、降水量、平均氣溫和平均地表溫度均呈顯著正相關(guān)。因此，不同月份球蟲病的發(fā)生主要與當(dāng)年此月份的環(huán)境因素有關(guān)，尤其是降雨量、地表溫度和平均氣溫。

綜上所述，通過系統(tǒng)研究寧夏部分地區(qū)集約化奶牛場球蟲病的流行病學(xué)特征以及影響球蟲病發(fā)生的相關(guān)因素，初步揭示了寧夏地區(qū)奶牛中球蟲潛在的公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)，為進(jìn)一步制定針對球蟲感染的高效防控方案提供依據(jù)。