哺乳動物體外成熟卵母細胞的線粒體調(diào)控機制研究進展

孫立晨，許曉玲，白佳樺，秦玉圣，劉彥，郭凱軍

(1. 北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206；2. 北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

卵母細胞體外成熟(invitromaturation，IVM)是指將生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)期卵母細胞從竇卵泡腔中取出并在適當?shù)呐囵B(yǎng)體系中培養(yǎng)，使其在體外發(fā)育成熟到第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)并獲得體外受精能力的技術(shù)。該技術(shù)作為人工輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)以及家畜胚胎工程的重要組成部分，在人類不孕不育和畜牧業(yè)領(lǐng)域，特別是家畜種質(zhì)資源保存、良種擴繁等方面具有較大的應用前景。然而，卵母細胞體外成熟過程是非生理性的，由于沒有經(jīng)歷體內(nèi)排卵前的生長發(fā)育過程，缺少胞質(zhì)成熟事件及物質(zhì)支持卵母細胞完全發(fā)育，此條件下產(chǎn)生的胚胎及胎兒發(fā)育潛力較低[1]。在卵母細胞成熟發(fā)育過程中，線粒體的數(shù)量、形態(tài)、分布發(fā)生顯著變化。因此，線粒體指標常常被認為是衡量卵母細胞胞質(zhì)成熟的標志之一。為此，本文介紹了卵母細胞成熟機制、體內(nèi)外成熟差異、線粒體在卵母細胞成熟過程中的調(diào)控作用，以及外源線粒體調(diào)節(jié)劑在卵母細胞體外成熟體系中的應用情況和效果，以期為進一步完善卵母細胞IVM技術(shù)體系，提高體外胚胎生產(chǎn)效率提供幫助。

1 卵母細胞減數(shù)分裂成熟機制

哺乳動物卵母細胞的成熟進程需經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂過程的精細調(diào)節(jié)[2]。胚胎期的卵原細胞經(jīng)歷增殖期、生長期、成熟期后停滯在第1次減數(shù)分裂前期的雙線期[3]。停滯主要是由于卵泡液內(nèi)存在減數(shù)分裂抑制物質(zhì)，目的是為了完成細胞質(zhì)成熟、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成及細胞質(zhì)微管重組等過程[4]。排卵前促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)高峰觸發(fā)減數(shù)分裂的恢復，進而引起生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)，卵母細胞紡錘體結(jié)構(gòu)變化，染色體聚集重排，排出第一極體，并停滯在第二次減數(shù)分裂中期，此時卵母細胞的核和質(zhì)均已成熟，卵母細胞做好受精準備[5]。

卵母細胞成熟進程主要是由卵內(nèi)環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平來有效調(diào)控的[6]。腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)通過催化卵丘顆粒細胞產(chǎn)生的ATP維持cAMP水平，并經(jīng)過縫隙連接通道(gap junction channel，GJC)傳遞到卵母細胞內(nèi)維持減數(shù)分裂靜止[7]。也有研究表明，G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)在卵母細胞內(nèi)激活AC，直接通過自身級聯(lián)反應催化ATP磷酸化產(chǎn)生cAMP[8]。此外，壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞產(chǎn)生的C型鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)特異性結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase，GC)偶聯(lián)受體-利鈉肽受體2(natriure-tic peptide receptor 2，NPR2)，激活GC促進高水平環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)合成，繼而抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的水解活性，維持胞內(nèi)cAMP水平[9-10]。高濃度cAMP激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)引起細胞周期蛋白依賴性激酶磷酸化，導致細胞周期蛋白B(cyclin B)無法合成，無法與游離的催化亞基P34cdc2結(jié)合后形成有活性的成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)，從而引起卵母細胞在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期阻滯。這種依賴于高濃度cAMP的PKA通路通過調(diào)控MPF活性，維持卵母細胞核處于靜止狀態(tài)，使得細胞核與細胞質(zhì)盡可能同步成熟，從而達到調(diào)控卵母細胞成熟進程的目的。

2 卵母細胞體內(nèi)外減數(shù)分裂成熟發(fā)育差異

細胞核和細胞質(zhì)的成熟過程是相輔相成的，胞質(zhì)的成熟發(fā)育程度決定后期胚胎的發(fā)育能力。體內(nèi)卵母細胞發(fā)育過程中，受到cAMP及一些蛋白質(zhì)合成、降解、磷酸化和去磷酸化等因素調(diào)節(jié)，核成熟被抑制，為核質(zhì)同步成熟提供平衡，從而促使核質(zhì)成熟同步化。但是在體外成熟過程中，未成熟的GV期卵母細胞一旦脫離體內(nèi)卵泡液的抑制環(huán)境后，就會迅速恢復減數(shù)分裂，發(fā)生GVBD，排出第一極體。同時，縫隙連接蛋白合成被抑制使GJC受阻，cAMP無法大量進入卵母細胞，導致核成熟過早發(fā)生[11-12]。此時細胞質(zhì)中并未完成細胞器的數(shù)量積累和重新分布，處于GV期的狀態(tài)。GJC阻礙也會使營養(yǎng)物質(zhì)無法及時供應到細胞質(zhì)內(nèi)，未充分準備好母源物質(zhì)的儲備利用等，即細胞質(zhì)不成熟[13]。通常體外成熟卵母細胞的發(fā)育能力低于體內(nèi)成熟的卵母細胞[14]，正是由于核質(zhì)成熟不同步造成的[15]。

細胞質(zhì)成熟涉及胞漿內(nèi)一系列細胞器及各種蛋白的變化。在誘導損傷的卵母細胞中，線粒體可以通過提供更多能量來恢復卵母細胞正常狀態(tài)[16]，其數(shù)量及動態(tài)分布變化與卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)[17]。隨著卵母細胞的成熟進程，線粒體由初始合成區(qū)域遷移至皮質(zhì)區(qū)，后期分布于胞質(zhì)中央?yún)^(qū)域，同時線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)也增多。在線粒體動態(tài)系統(tǒng)中，線粒體融合蛋白這種高度保守的跨膜GTP酶作為線粒體動力學(線粒體融合、分布，信號傳導等)的關(guān)鍵影響因素對能量的產(chǎn)生至關(guān)重要[18]。而體外成熟的卵母細胞和體內(nèi)成熟的卵母細胞之間的主要差異是線粒體功能和ATP產(chǎn)生的效率，導致卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complex，COCs)耗氧量和卵母細胞氧化代謝較低，體外受精后囊胚率低[19]。

3 卵母細胞減數(shù)分裂成熟中線粒體功能及調(diào)節(jié)機制

作為主要直接能量來源的線粒體在卵母細胞中數(shù)量豐富，其在卵母細胞成熟過程中呈動態(tài)分布。GV期線粒體主要分布于生發(fā)泡周圍，分裂前線粒體聚集在紡錘體周圍，分裂時幾乎都留在卵母細胞內(nèi)，極少隨極體排出[20]。而MⅡ期卵母細胞中的線粒體周圍有高電子密度的基質(zhì)[21]。兩次減數(shù)分裂后，線粒體又分散于細胞質(zhì)中為后續(xù)發(fā)育提供能量。同時，線粒體在卵母細胞成熟的每個階段都在進行復制，雙鏈環(huán)狀的mtDNA在絕大多數(shù)哺乳動物卵母細胞成熟時數(shù)量能達到105個拷貝數(shù)，且此過程選擇正確的mtDNA保持了遺傳的同質(zhì)性和線粒體的完整性[22]。有研究表明，mtDNA含量對受精結(jié)果至關(guān)重要，是評估卵母細胞質(zhì)量的重要標志[23]。

線粒體功能復雜，通過參與調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)、鈣信號傳遞、細胞周期、胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)等多種信號通路轉(zhuǎn)導的生物學過程，支持染色體分離、受精及胚胎發(fā)育[24]。在整個卵母細胞發(fā)育和成熟過程中，能量需求遞增，在排卵時達到峰值，線粒體發(fā)生活躍的氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP，為后續(xù)受精及胚胎發(fā)育做準備[25]。同時，也會產(chǎn)生一定量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，影響卵母細胞成熟。正常條件下，少量的ROS會被線粒體中的抗氧化酶清除，以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。但當線粒體數(shù)量減少機能下降時，氧化產(chǎn)生的ROS無法及時清除，積累過多會損傷卵母細胞的發(fā)育。線粒體作為雙膜細胞器，這種特殊結(jié)構(gòu)在發(fā)揮功能上起到重要作用[26]。外膜可選擇性滲透小分子，且存在與編碼線粒體蛋白有關(guān)的轉(zhuǎn)位酶位點。而具有嵴結(jié)構(gòu)的線粒體內(nèi)膜幾乎不滲透，目的為維持跨膜梯度，嵴外側(cè)有電子傳遞鏈的蛋白復合體定位點。線粒體膜內(nèi)質(zhì)子通過質(zhì)子泵泵出造成膜內(nèi)外電位差，即形成線粒體跨膜電位，線粒體跨膜電位作為產(chǎn)生ATP的基礎(chǔ)，可預測卵母細胞早期凋亡程度。線粒體功能、分布及結(jié)構(gòu)在卵母細胞發(fā)育過程中的顯著變化可以作為衡量卵母細胞胞質(zhì)成熟的指標，有利于在IVM中挑選出更優(yōu)質(zhì)的卵母細胞來激活后期受精及胚胎發(fā)育更大潛力。

4 外源線粒體調(diào)節(jié)劑在卵母細胞體外成熟體系中的應用

體外成熟的卵母細胞雖然發(fā)育潛力低于體內(nèi)來源，但是由于其可為胚胎體外生產(chǎn)以及人工輔助生殖提供更多的豐富卵源，因此需要不斷完善體外培養(yǎng)體系，從而提高該技術(shù)的有效性。線粒體結(jié)構(gòu)和功能與卵母細胞成熟質(zhì)量密切相關(guān)，是影響受精及胚胎發(fā)育的重要因素。所以，通過添加外源線粒體調(diào)節(jié)劑來優(yōu)化體外培養(yǎng)體系具有重要意義。

4.1 肉堿

肉堿，是一種類氨基酸，屬于季銨陽離子復合物，主要作為載體將脂肪酸轉(zhuǎn)運進入細胞線粒體，最終進行β-氧化過程釋放能量[27]。同時，作為一種線粒體調(diào)節(jié)劑，在卵母細胞體外培養(yǎng)中添加肉堿可以抵消能量和氧化還原失衡[28]。左旋肉堿(L-carnitine，LC)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝，提高呼吸鏈酶活性，防止氧化應激，抑制細胞凋亡[29]。在培養(yǎng)基中添加2.5 mmol/L的LC可以增加體外成熟水牛卵母細胞的直徑和線粒體活性，增強細胞骨架和細胞質(zhì)重組，增加卵母細胞來源的生長因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bonemorpho-geneticprotein 15，BMP15)的分泌，進而促進卵母細胞-顆粒細胞復合體(oocyte-granulosa cell complexes，OGCs)中竇樣結(jié)構(gòu)形成，抑制卵母細胞退化，支持水牛卵母細胞體外生長[30]。同樣在犬卵母細胞IVM期間補充0.6 mg/mL LC可以改善核成熟、受精率以及體外受精和著床前胚胎發(fā)育[31]。LC在輔助生殖技術(shù)中可以保護細胞免受氧化損傷引起的細胞凋亡，提高線粒體活性和減數(shù)分裂能力，具有改善卵母細胞質(zhì)量和卵巢功能障礙的潛力[32]。

4.2 輔酶Q10

輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是細胞線粒體電子傳遞鏈中的脂溶性電子載體，參與ATP的合成。研究表明CoQ10供應不足會使線粒體功能受損，導致卵母細胞質(zhì)量降低[33]。在牛卵母細胞體外培養(yǎng)時，添加40 μmol/L CoQ10能顯著提高線粒體質(zhì)量，維持高ATP水平，減少卵母細胞凋亡，使卵母細胞更接近體內(nèi)正常的發(fā)育軌跡[34]。在綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)時，添加30 μmol/L CoQ10可促進線粒體的正常分布，平衡能量代謝，降低ROS產(chǎn)生和卵母細胞染色體錯位，提高綿羊體外胚胎的產(chǎn)量[35]。CoQ10還可以抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類4(silent mating type information regulation 2 homolog-4，SIRT4)的過表達來減輕衰老引起的線粒體功能障礙，清除ROS積累[36]。在豬卵母細胞培養(yǎng)體系中，添加100 μmol/L CoQ10的還原形式泛醇-10，可以達到促進線粒體更新的效果，從而延緩卵母細胞的衰老[37]。

4.3 C型利尿鈉肽

C型利尿鈉肽(CNP)作為減數(shù)分裂抑制劑，不僅可以優(yōu)化卵母細胞核和質(zhì)成熟的同步化程度，也對線粒體分布及功能產(chǎn)生影響。在牛卵母細胞IVM中，添加100 nmol/L CNP可顯著優(yōu)化線粒體分布模式，提高線粒體含量、膜電位，降低ROS含量[38]。另外，在牛卵母細胞體外培養(yǎng)中，添加200 nmol/L CNP預處理6 h后再進行28 h IVM處理，卵母細胞ROS水平顯著降低，mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位顯著增加，從而促進牛卵母細胞胞質(zhì)成熟[39]。此外，添加濃度為200 nmol/L CNP處理體外成熟的綿羊COCs后，線粒體更多地聚集在核和胞漿周圍，形成明顯團塊，可以為卵母細胞成熟過程提供大量能量[40]。CNP可能通過誘導與線粒體發(fā)育和抗氧化相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄物和增加蛋白質(zhì)的相對豐度來提高卵母細胞質(zhì)量。

4.4 酚類化合物

酚類化合物在自然界中數(shù)量眾多，從植物提取出的天然酚類化合物具有顯著的抗氧化作用，結(jié)構(gòu)內(nèi)的羥基能夠直接清除ROS，或者通過抑制促氧化基因表達，改善細胞氧化應激損傷[41-43]。白藜蘆醇是從葡萄、花生、虎杖、桑椹等植物中提取的一種天然抗氧化劑，通過增加線粒體數(shù)量及增強線粒體功能，促進顆粒細胞與卵母細胞之間的能量代謝改善卵母細胞發(fā)育環(huán)境[44]。在IVM培養(yǎng)基中添加0.5 μmol/L的白藜蘆醇能夠提高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平，促進綿羊卵母細胞的胞質(zhì)成熟，從而支持后期胚胎高質(zhì)量發(fā)育[45]。川陳皮素是一種具有廣泛生物學活性的多甲氧基黃酮類物質(zhì)，在牛卵母細胞培養(yǎng)中添加25 μmol/L和50 μmol/L可以使線粒體表現(xiàn)出更高的活性，抵消IVM期間ROS過量產(chǎn)生的影響，改善卵母細胞核和質(zhì)的成熟，以及隨后的牛胚胎發(fā)育質(zhì)量[46]。原花青素存在于許多植物的果實、葉子和種子中，研究表明添加100 μmol/L的原花青素B1(procyanidin B1，PB1)處理豬卵母細胞，能夠降低活性氧生成以及細胞凋亡水平，增加線粒體膜電位水平和谷胱甘肽(glutataione，GSH)水平[47]。

4.5 褪黑素

褪黑素(melatonin，MT)屬于吲哚雜環(huán)類化合物，是由哺乳動物腦松果體分泌的胺類激素之一，是一種抗氧化劑。10-9mol/L MT處理的豬COCs中脂肪酸β-氧化和線粒體生物發(fā)生相關(guān)的基因表達顯著上調(diào)，脂肪酸、線粒體和ATP含量增加，為卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育提供能量來源[48]。另有研究表明，高濃度MT(高于500 nmol/L)通過促進線粒體生物發(fā)生，消除毒素誘導的線粒體功能障礙，優(yōu)化豬早期胚胎發(fā)育過程[49]。還有研究表明，添加MT后顯示卵母細胞線粒體膜電位顯著升高，細胞內(nèi)ROS和Ca2+水平顯著降低，這也顯示了MT通過保護線粒體功能，促進未成熟卵母細胞健康發(fā)育[50]。

5 小結(jié)

綜上所述，常規(guī)獲得的未成熟卵母細胞經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育成熟，具備受精和后期胚胎發(fā)育能力，但是易造成胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛能降低。通過外源添加線粒體調(diào)節(jié)劑，優(yōu)化卵母細胞IVM培養(yǎng)體系，能夠促進未成熟卵母細胞的核質(zhì)同步化成熟，從而建立高效的胚胎體外生產(chǎn)體系，為人工輔助生殖以及良種快速快繁奠定技術(shù)支持。