西瓜幼苗葉片對小西葫蘆黃花葉病毒侵染的生理響應(yīng)

高玉紅, 鄧?yán)枥? 閆生輝, 張艷麗, 趙衛(wèi)星

(1.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450121; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,河南鄭州 450002)

我國是世界上西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國,據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì),2020全國種植面積為140.59萬hm2,總產(chǎn)量為6 234.4萬t[1]。近年來,隨農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,西瓜種植面積逐漸擴(kuò)大,已成為國內(nèi)部分地區(qū)助推鄉(xiāng)村振興的高效園藝作物。小西葫蘆黃花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus,簡稱ZYMV)病是在我國西瓜產(chǎn)區(qū)發(fā)生日益嚴(yán)重,已上升為西瓜產(chǎn)業(yè)的主要病害。近年來,國內(nèi)有關(guān)學(xué)者相繼開展了植物受病毒侵染后生理生化變化的研究。張萍等的研究表明,辣椒脈斑駁病毒侵染煙草使相關(guān)抗氧化物酶(超氧化物岐化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶)的活性升高,葉綠素合成受阻,光合效率降低[2];張武等研究認(rèn)為,馬鈴薯Y病毒和卷葉病毒侵染馬鈴薯植株后,有關(guān)保護(hù)酶活性增強(qiáng)、丙二醛含量升高、總?cè)~綠素含量減少[3];王瑞龍等的研究表明,萎蔫病毒感染會(huì)引起薇甘菊葉片中葉綠素含量減少,超氧化物岐化酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性提高,后期下降[4];趙富明研究認(rèn)為,抗病與感病小麥品種(系)體內(nèi)相關(guān)生理生化指標(biāo)變化存在顯著相關(guān)性[5]。目前,有關(guān)西瓜小西葫蘆花葉病毒的研究多集中在病原生物學(xué)特性和抗性種質(zhì)資源鑒定以及抗性基因的分子標(biāo)記等方面[6-8],而針對感染該病毒后葉片生理代謝的報(bào)道較少。為此,本研究通過對比分析人工接種侵染后發(fā)病葉與健康葉的相關(guān)生理指標(biāo)差異,探討西瓜幼苗葉片對小西葫蘆黃花葉病毒侵染的生理響應(yīng)機(jī)制,以期為西瓜抗病品種選育和黃花葉病毒病的有效預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試西瓜品種為對小西葫蘆花葉病毒較為敏感的18-025,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。

供試小西葫蘆花葉病毒(ZYMV),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州研究所果樹瓜類植保中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行。將經(jīng)55 ℃ 溫水浸種的西瓜種子放在(28±1) ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽,待種子露白后播種于32 孔穴盤中,培養(yǎng)基質(zhì)為經(jīng)過滅菌的等體積蛭石和珍珠巖,然后放于25～28 ℃ 溫室內(nèi)育苗。出苗后及真葉展出后分別每隔7、5 d澆灌1次1/2 Hoagland營養(yǎng)液和完全營養(yǎng)液,3葉1心時(shí)采用常規(guī)汁液摩擦法[9]接種ZYMV,以不接種為對照。育苗期間用防蟲網(wǎng)和小拱棚進(jìn)行隔離,以防蚜蟲等傳毒媒介傳染其他病毒,且不噴施任何預(yù)防病毒的藥劑。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

分別于接種后2、4、6、8、10 d 隨機(jī)取5株測定接種部位葉片的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、游離脯氨酸、丙二醛含量以及超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性。測定方法參照李合生的方法[10]略有改動(dòng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel 2019和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與制圖,多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZYMV侵染對葉片葉綠素含量的影響

ZYMV侵染葉片葉綠素含量均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(圖1)。其中,葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量在接種后2、4 d與對照差異不顯著,在接種后6、8、10 d與對照差異達(dá)顯著水平,且均在接種后8 d時(shí)下降較為明顯,分別較對照下降了46.52%、38.38%、43.78%。葉綠素a含量/葉綠素b含量在接種后2～10 d均與對照差異不顯著。表明,ZYMV侵染西瓜葉片過程中導(dǎo)致葉綠體破壞,且侵染后2、4d葉綠體損傷程度較小,侵染后6、8、10 d 損傷程度增大。

2.2 ZYMV侵染對葉片可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的影響

ZYMV侵染可降低葉片可溶性蛋白質(zhì)含量,提高可溶性糖含量(圖2)。其中,葉片可溶性蛋白質(zhì)含量在接種后2～10 d時(shí)與對照差異未達(dá)顯著水平;葉片可溶性糖含量在接種后2、6、8、10 d時(shí)與對照差異不顯著,在4 d時(shí)比對照提高25.02%,且差異達(dá)顯著水平。說明ZYMV侵染對西瓜葉片可溶性蛋白質(zhì)合成有抑制作用,但抑制效果不顯著;對可溶性糖的合成有刺激作用,接種后4 d時(shí)刺激效果最明顯。

2.3 ZYMV侵染對葉片丙二醛和游離脯氨酸含量的影響

ZYMV侵染過程中葉片丙二醛和脯氨酸含量均會(huì)發(fā)生明顯變化(圖3)。由圖3可知,丙二醛含量在苗期接種后2、4、6 d時(shí)分別較對照提高3. 25%、11.74%、12.38%,其中2、4 d時(shí)與對照差異不顯著,6 d時(shí)與對照差異達(dá)顯著水平;在苗期接種后8、10 d時(shí)分別比對照下降0.83%、7.53%,且差異未達(dá)顯著水平。葉片脯氨酸含量接種后2、4 d時(shí)與對照差異不顯著,6、8、10 d時(shí)分別比對照提高21.92%、36.69%、58.01%,且差異達(dá)顯著水平。表明,接種ZYMV后,前期(2～6 d)加劇了西瓜葉片細(xì)胞膜損壞程度,提高了丙二醛含量,隨著侵染時(shí)間的延長,后期(8～10 d)減弱了細(xì)胞膜損壞程度;同時(shí)還會(huì)刺激脯氨酸的合成,使其在葉片中的含量增加以抵抗病毒的侵染,且接種后6～10 d刺激作用明顯增強(qiáng)。

2.4 ZYMV侵染對葉片相關(guān)保護(hù)酶活性的影響

ZYMV侵染過程中葉片超氧化物岐化酶,過氧化物酶和過氧化氫酶活性均有明顯上升(圖4)。其中,葉片超氧化物岐化酶活性在接種后2～10 d時(shí)均與對照差異未達(dá)顯著水平;葉片過氧化物酶活性在接種后2、4、6、8 d時(shí)分別比對照提高46.76%、81.59%、48.74%、31.55%,且差異均達(dá)顯著水平,在接種后10 d時(shí)與對照差異不顯著;過氧化氫酶活性在接種后2、10 d時(shí)與對照差異不顯著,在接種后4、6、8 d時(shí)分別比對照提高23.93%、48.91%、46.15%,且差異均達(dá)顯著水平。表明,接種ZYMV后會(huì)提高西瓜葉片相關(guān)保護(hù)酶的活性。其中,超氧化物岐化酶對ZYMV的侵染反應(yīng)較遲鈍;過氧化物酶受侵染后會(huì)刺激其活性提高,但后期(10 d)刺激作用減弱;過氧化氫酶在侵染后2、10 d時(shí)反應(yīng)不強(qiáng)烈,在侵染后4、6、8 d時(shí)反應(yīng)較為強(qiáng)烈。

3 討論與結(jié)論

病毒侵染寄主植物過程中,在細(xì)胞內(nèi)大量地復(fù)制、增殖可破壞寄主細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能使葉綠素含量下降,影響植物的光合效率[11-12]。本研究結(jié)果表明,接種ZYMV后葉片中葉綠素含量明顯減低,這與陶月良等對蕪菁花葉病毒侵染溫州盤菜[13]和李燕宏等對萎蔫病毒分離物侵染蠶豆的研究結(jié)果[14]一致,可能與病毒侵染導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn),ZYMV侵染前期葉綠體損傷程度較小,后期損傷程度增大。這與王瑞龍等對萎蔫病毒感染薇甘菊的研究結(jié)果[4]一致,可能是ZYMV侵染需要一個(gè)過程,后期(6～10 d)才在細(xì)胞體內(nèi)復(fù)制、繁殖加重了葉綠體的破壞。但病毒侵染宿主細(xì)胞的過程涉及病毒與細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間復(fù)雜的相互作用,其具體原因還有待進(jìn)一步研究。

植物組織受病害侵染時(shí),其可溶性蛋白質(zhì)含量會(huì)發(fā)生變化[15]。本研究結(jié)果表明,ZYMV侵染導(dǎo)致西瓜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量下降,但影響作用不明顯,這與毛健民等對花葉病毒侵染煙草的結(jié)果[16]一致,可能是花葉病毒侵染僅在一定程度上對氮素的利用造成了影響。而吳美艷等研究則認(rèn)為,細(xì)菌性枯萎病侵染木薯會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量明顯下降[17],造成與本研究結(jié)果差異的原因可能與病害侵染能力和寄宿作物抗性有很關(guān),但具體原因還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

可溶性糖含量的增加有助于提高植物的抗病性[18]。本研究結(jié)果表明,ZYMV侵染會(huì)增加西瓜葉片可溶性糖含量,這與朱麗梅對灰霉病侵染百合[19]和吳美艷等對細(xì)菌性枯萎病侵染木薯的研究結(jié)果[17]一致,其原因可能是病原菌侵入植物加速了其體內(nèi)小分子多糖的水解,引起可溶性糖在侵染部位積累,為自身防御反應(yīng)供應(yīng)能量。本研究還發(fā)現(xiàn),在ZYMV侵染4 d 葉片可溶性糖含量會(huì)顯著增,而Yamada等研究則認(rèn)為,細(xì)菌丁香假單胞菌侵染擬南芥后葉片中的可溶性糖含量都未發(fā)生顯著變化[20],造成這種差異的原因可能與不同病原菌侵染過程中對糖分的消耗和積累速率有關(guān),在ZYMV侵染 4 d 時(shí)葉片糖分積累速率顯著高于消耗速率。植物在逆境下的糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)受多種因素的影響和制約,其具體原因還有待進(jìn)一步證實(shí)。

丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物之一,其含量可在一定程度上反映細(xì)胞膜的損壞程度[17,21]。本研究結(jié)果表明,接種ZYMV后2～6 d加劇了西瓜葉片細(xì)胞膜的損壞程度,提高了丙二醛含量,隨著侵染時(shí)間的延長,8、10 d時(shí)減輕了細(xì)胞膜損壞程度,這與吳美艷等對細(xì)菌性枯萎病侵染木薯[17]和張武等對馬鈴薯Y病毒和卷葉病毒侵染馬鈴薯的研究結(jié)果[3]相似。病原菌侵染過程中,植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化對其產(chǎn)生抵抗作用[22]。造成本研究結(jié)果的原因可能是ZYMV侵染前期西瓜的抵抗能力較弱,導(dǎo)致細(xì)胞膜損害程度加重,隨著植株的生長發(fā)育,對病毒侵染的逐漸抵抗能力增強(qiáng),使細(xì)胞膜脂過氧化作用減緩,減輕了細(xì)胞膜損害程度,但其具體原因還需從分子水平上進(jìn)一步探討。

相關(guān)研究表明,植株體內(nèi)脯氨酸含量與品種的抗病性呈顯著正相關(guān)性[23]。本研究結(jié)果表明,ZYMV侵染會(huì)刺激脯氨酸合成,使葉片中脯氨酸含量增加以抵抗病毒的侵染,接種后6～10 d刺激作用明顯增強(qiáng),這與李伯凌對細(xì)菌性枯萎病木薯的研究結(jié)果[24]一致。吡咯啉-5-羧酸還原酶是脯氨酸合成過程中的關(guān)鍵酶,與植物體脯氨酸含量關(guān)系密切[25-26]。本研究中ZYMV侵染可能誘導(dǎo)了該酶基因的表達(dá),從而增加了葉片中脯氨酸的含量。因此,可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控脯氨酸合成酶基因在西瓜中過量表達(dá),促進(jìn)植株體內(nèi)脯氨酸的合成,提高對ZYMV的抗性。

植株受到病原物侵染后會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)生一系列不同程度的生化反應(yīng),以加速清除體內(nèi)活性氧自由基,減輕病害對自身的傷害[27]。本研究結(jié)果顯示,接種ZYMV后均可不同程度提高西瓜葉片超氧化物岐化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性。這也在趙衛(wèi)星等對ZYMV侵染不同抗性西瓜品種[28]和Sgherri等對扇葉病毒感染葡萄的研究中得到了證實(shí)[29]。本研究還發(fā)現(xiàn),超氧化物岐化酶對ZYMV的侵染反應(yīng)較遲鈍;受侵染后會(huì)刺激過氧化物酶活性提高,但后期(10 d)刺激作用減弱;過氧化氫酶在侵染后2、10 d反應(yīng)不強(qiáng)烈,在4、6、8 d時(shí)反應(yīng)較為強(qiáng)烈,這與張武等對馬鈴薯Y病毒和卷葉病毒侵染馬鈴薯的研究結(jié)果[3]相似,可能與不同酶類對病毒病侵染響應(yīng)的差異有關(guān)。植物體內(nèi)酶促反應(yīng)受輔助因子、激活劑、抑制劑等多種因素影響和制約,具體原因還需進(jìn)一步探究。