不同質(zhì)地植煙土壤細(xì)菌多樣性對生物有機肥的響應(yīng)

張 倩, 赫英宇, 王 波, 郭 慧, 孫軍偉, 楊惠娟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,河南鄭州 450002; 2.黑龍江省煙草公司牡丹江煙葉公司,黑龍江牡丹江 157011;3.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,湖北武漢 430077; 4.云南省煙草公司大理州公司,云南大理 671000)

土壤中存在著許多微生物,這些微生物在土壤中的適應(yīng)性是有差別的[1],土壤 pH值、質(zhì)地、養(yǎng)分、水分和溫度都會對土壤中的微生物進行調(diào)控[2]。微生物多樣性、土壤呼吸和微生物生物量等生物因子對土壤健康起著重要作用,微生物肥料的作用是通過微生物的生命活動,可以使多種營養(yǎng)物質(zhì)之間相互補充,并在一定程度上改善了土壤的結(jié)構(gòu)。微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性與土壤類型密切相關(guān),土壤微粒的細(xì)致程度與有機質(zhì)含量和微生物變化的緩沖能力成正比關(guān)系,而與微生物群落結(jié)構(gòu)的變化成反比關(guān)系[3]。壤土、黏壤土、黏土在門層次上微生物群落構(gòu)成相似,但豐度有一定差異;3種質(zhì)地土壤的菌類成分及相對富集程度均無顯著差異[4]。

煙草作為我國最重要的經(jīng)濟作物之一,合理種植可以提高產(chǎn)量,增加農(nóng)民收入[5],肥料的合理施用在一定程度上決定著作物的成長[6]。在煙葉種植中,為了提高產(chǎn)量,大量施用化肥、農(nóng)藥,引起土壤退化,從而導(dǎo)致作物產(chǎn)量的降低[7-9]。因此,如何選擇適宜的有機肥改善土壤問題,提高作物產(chǎn)量,是目前的研究熱點[10]。據(jù)報道,土壤微生物的多樣性和活力對肥料的反應(yīng)機理是比較復(fù)雜的,土壤微生物的多樣性活力受多種因素影響,不同的肥料也會對土壤產(chǎn)生不同的影響[11]。土壤微生物種類、數(shù)量及其變化是土壤有機質(zhì)礦化速率和多種營養(yǎng)物質(zhì)分布狀況的一個重要指標(biāo),能夠直接影響土壤的供肥狀況[12]。而土壤深度、土壤質(zhì)地對培肥效果的影響更為明顯[13]。

不同的施肥處理對土壤的影響是顯著不同的,目前已有的一些研究表明,肥料的作用是通過提高土壤中的糖類和苯酚類物質(zhì)含量作為碳源,從而達(dá)到調(diào)控或緩解連作對煙草生長的作用[14];研究貴州植煙土壤得出,長期施用有機肥能提高該區(qū)土壤有機質(zhì)含量和改良土壤微生物群落[15];研究表明,在施肥前期,土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化顯著,而在后期則無顯著變化[16-20]。施肥促進土壤中微生物群落的活性和多樣性[21]。因此,通過分析不同質(zhì)地土壤秸稈還田配施腐熟劑的土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群,可為在不同質(zhì)地的土壤中選擇腐熟劑提供一定有價值的參考。

宏基因組是指利用特定環(huán)境中所有微生物的基因組進行基因序列分析,從而解決了常規(guī)方法無法獲得完整的土壤微生物信息的不足[22]。通量大、可擴展性好、費用低、技術(shù)快速、準(zhǔn)確率高等是第二代高通量測序技術(shù)的特點,能為土壤微生物群落提供良好的信息[23]。利用高通量 Illumina Miseq技術(shù)可對煙葉根際土壤中的微生物多樣性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行較為全面的分析[24]。據(jù)了解,不同質(zhì)地土壤細(xì)菌多樣性差異研究較多,而細(xì)菌多樣性對有機肥的響應(yīng)研究較薄弱[25]。本研究通過運用高通量測序技術(shù)研究了連作條件下不同施肥處理對云南大理植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及改良土壤環(huán)境的影響,旨在為生物有機肥的合理配施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在云南省大理州彌渡縣紅巖鎮(zhèn)西雙村進行(25°23′8″N,100°24′23″E,海拔1 729.5 m,中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)),年均氣溫17.3 ℃,年均降水量824.4 mm。土壤類型為2種,分別是中壤土、輕壤土,試驗煙田為多年連作。本試驗所用的2種質(zhì)地(輕壤土D1、中壤土D2)的土壤理化性狀見表1。

表1 不同質(zhì)地土壤理化性狀

1.2 試驗設(shè)計

大田試驗采用田間小區(qū)試驗,在選定的輕壤土(D1)、中壤土(D2)試驗地實施化肥與不同種類有機肥配施試驗,本試驗設(shè)置了6個不同的處理,并且采用隨機區(qū)組設(shè)計。D1設(shè)置3個處理,分別為T1:在輕壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常規(guī)施肥;T2:在輕壤土中,起壟前條施國發(fā)商品有機肥100 kg/667 m2,其他按照常規(guī)施肥(有機肥對照);T3:常規(guī)施肥(常規(guī)對照)。D2設(shè)置3個處理,分別為T1:在中壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常規(guī)施肥;T2:在中壤土中,起壟前條施國發(fā)商品有機肥 100 kg/667 m2,其他按照常規(guī)施肥(有機肥對照);T3:常規(guī)施肥(常規(guī)對照)。試驗處理見表2。使用大理煙草公司提供的煙草專用復(fù)合肥為對照,總養(yǎng)分≥44%,N、P2O5、K2O含量分別為10%、10%、24%。每個試驗設(shè)置3次重復(fù),行距和株距分別為120 cm和60 cm,四周設(shè)保護行。試驗處理均施用煙草專用肥40 kg/667 m2。烤煙品種為紅花大金元,各處理間的田間管理措施都按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進行。

表2 大田試驗處理

大田試驗于2019年4月22日開始,2019年10月結(jié)束。還苗期是4月26日至6月2日,團棵期是6月3—13日,旺長期是6月27日,現(xiàn)蕾期是6月28日至7月5日,成熟期是7月6日至8月31日并且收獲完畢。

福建三炬固體微生物菌肥處理T1施肥方式為窩施;彌渡國發(fā)有機肥處理T2施肥方式為條施;肥料:彌渡國發(fā)有機肥、福建三炬固體菌肥的技術(shù)指標(biāo)等見表3。

表3 2個肥料的技術(shù)指標(biāo)及生產(chǎn)廠家

1.3 測定項目與方法

在煙株處于團棵期(T)、旺長期(W)、第1次采收前(C1)、第2次采收前(C2),采集煙株根部 10 cm 處的根際土壤,取樣方法為五點取樣法,分別對相同處理后的土樣進行混合均勻,再按照四分法對所取樣品進行取樣,稱取100 g土樣,并用滅菌過的自封袋裝好,然后進行土壤總 DNA提取、庫構(gòu)建、測序等工作。

1.4 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 將 DNA上樣于1%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi),用120 V恒壓電泳法進行15 min的檢測,并在紫外線和透射光下進行觀察,用于查看DNA的完整度和濃度。PCR引物如下:前端引物343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′;后端引物:798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′[26]。對原始數(shù)據(jù)進行拼接 (FLASH,version 1.2.11),然后對拼接后的序列進行質(zhì)量過濾,消除嵌合體(UCHIME,version 2.4.2),從而獲得高品質(zhì)的 Tags序列。用TruSeqTMDNA Sample PrepKit構(gòu)建PE文庫,在Illumina Miseq平臺上進行序列分析。

1.4.2 生物信息學(xué)分析 高通量的排序結(jié)果是最初的雙端序列,也就是所謂的數(shù)據(jù);接著,采用 Trimmomatic (版本0.35)軟件[27],首先用滑動窗口法掃描 raw數(shù)據(jù),當(dāng)質(zhì)量小于20時,刪除具有低于閾值的堿基質(zhì)量平均值的滑窗,而長度小于50 bp的序列被淘汰[28];然后,利用 Flash[29]軟件(版本1.2.11),將上一步的標(biāo)準(zhǔn)雙端數(shù)據(jù)進行拼接,得到了最大長度200 bp的序列,從而得到完整paired序列;在 QIIME中將包含N個堿基的序列用split_libraries (version1.8.0)刪除,將單個堿基重復(fù)數(shù)大于8的序列剔除,再剔除長度小于200 bp的序列,得到一個 clean tags序列;然后,利用 UCHIME (version 2.4.2)來移除 clean tags中的嵌合體,最后獲得 OTU分區(qū)的valid tags;并利用歐易自己編寫的程序?qū)|(zhì)量控制進行了統(tǒng)計,得出了相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析采用微軟 Excel 2016進行,方差分析采用 SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行分析,采用Duncan’s多重檢驗方法對各處理在0.05水平進行了差異顯著性檢驗。使用Canoco 5.0軟件對土壤中的細(xì)菌屬和養(yǎng)分進行 DNA分析,通過熱圖對各菌種或樣本量的豐度相似程度進行聚類,將20個主要菌群按門類劃分,并采用不同的顏色和長度來表示細(xì)菌群落成分的差異和比例,利用 UPGMA技術(shù)對樣本進行了豐度相似度的聚類分析。應(yīng)用 SPSS 19.0對各處理間各因子進行了方差分析,并進行了統(tǒng)計學(xué)上的顯著性分析。其中,功能多樣性指數(shù)為Simpson指數(shù)、Goods Coverage指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)。

Chao指數(shù)估算了該群落中的種群數(shù)量[30]:

式中:Sobs表示實際測量出的OTU數(shù)目;n1表示僅包含1條序列的OTU數(shù)量;n2表示僅包含2條序列的OTU數(shù)量。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù))包括了2個部分,一是物種數(shù)量,二是不同個體之間分布的均勻性。Shannon 指數(shù)計算公式:

式中:Ni表示含有i條序列的OTU數(shù)目;N表示所有的序列數(shù)。

辛普森指數(shù)(Simpson指數(shù))是一種常見的群落多樣性指標(biāo),由Simpson提出[31],是指2個被隨機選擇的個體,屬于不同種類的可能性。辛普森指數(shù)愈高,說明群落的多樣性愈高。

Goods Coverage指數(shù)也是一種多樣性指數(shù),由Esty最先提出[32]。指數(shù)越接近1,表明序列的深度基本覆蓋了樣品的全部類型。

式中:Cdepth表示測序的深度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

項目共72個樣本,每個樣本重復(fù)3次,經(jīng)分析,所有處理的測序結(jié)果均已達(dá)標(biāo),可以用于后續(xù)分析。用97%的相似度來進行聚類,獲得了 8 781 個 OTU,在質(zhì)控后,Clean Tags的分布范圍為22 443.00～50 078.33,除掉嵌合體之后獲得valid tags(也就是最終要分析的數(shù)據(jù)),在 19 510.33～45 413.67 bp之間,valid tags的平均長度為427.97～431.40 bp,而各個樣品的 OTU數(shù)量在 1 277.33～1 951.33之間(表4)。

表4 植煙根際土壤微生物OTC數(shù)量

總體上,測序包含了煙葉的整個生命周期,因此土樣測序的整體趨勢為煙葉第1次采收(C1)>煙葉第2次采收(C2)>旺長期(W)>團棵期(T);并且在各個時期地塊D1整體序列高于地塊D2。其中在團棵期間,施用微生物菌肥的處理T1高于其他處理,施用國發(fā)有機肥的處理T2次之,常規(guī)施肥T3最少,但是T3的有效序列所占百分比最高;在旺長期間,施用T2處理最好,T1處理次之,T3最弱;在采收期間,常規(guī)施肥T3處理最好,但差距不大;可知在常規(guī)施肥的條件下加施肥料,可以增強煙葉前期土壤微生物的活躍。

2.2 植煙土壤的稀釋曲線

稀釋曲線中曲線能否達(dá)到平臺期可以說明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋微生物群落的多樣性。圖1中對72個植煙土壤進行測序,其中1條曲線表示1個樣品,橫坐標(biāo)是隨機取樣的深度(也就是取樣的序列數(shù)),而縱坐標(biāo)是指數(shù)值。當(dāng)測序數(shù)目達(dá)到1 700以后,細(xì)菌稀釋曲線趨于平緩,這就說明此樣本的測序結(jié)果是正確的,而更多的樣本中可能會有少量的新的OTU,反之,若繼續(xù)進行測序,將會產(chǎn)生更多的新的 OTU。

2.3 植煙土壤的Alpha 多樣性分析

Alpha多樣性分析又稱為生物境內(nèi)的多樣性,它是用不同的 alpha多樣性指數(shù)來評估樣本中的物種豐富程度和分布均勻程度。由表5可知煙草根際土壤樣本Alpha多樣性統(tǒng)計結(jié)果。試驗結(jié)果顯示,該試驗所建的土壤微生物庫覆蓋范圍均在80%以上,反映了該地區(qū)土壤微生物多樣性的真實、有效性,有一定的應(yīng)用價值;總體香濃指數(shù)高于8,表明煙草根際土壤樣品的細(xì)菌群落多樣性較高,土壤中的細(xì)菌種類較多,并且在采收期間細(xì)菌多樣性更為豐富。在各個時期中可以看出地塊D1與地塊D2差異不明顯,其中施用微生物菌肥的土壤中細(xì)菌含量最大,施用國發(fā)有機肥的土壤中細(xì)菌含量次之,常規(guī)施肥含量最小;而Simpson指數(shù)值越大,生物多樣性越低,圖中可知施用微生物菌肥的處理Simpson指數(shù)最小,因此其生物多樣性越多;群落豐富度的增高隨著Chao指數(shù)增加而增加,呈正相關(guān);不同土壤樣本之間生物多樣性指數(shù)存在差異,施用微生物菌肥的土壤的香濃指數(shù)、Chao1 指數(shù)均高于其他處理,Simpson指數(shù)低于其他處理,結(jié)果表明,施用微生物菌肥的土壤生物多樣性相比更為豐富,其原因可能在于微生物菌肥的應(yīng)用有利于微生物的生長。

表5 不同施肥處理下植煙土壤的Alpha 多樣性分析

2.4 煙草根際土壤細(xì)菌在門水平上的分布

土壤中的微生物群落分布較為穩(wěn)定,各菌種間的穩(wěn)態(tài)分布特征相互影響,從而為土壤提供了有利的生態(tài)條件。在 OTU物種注釋結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇了10個各樣本豐度最好的物種,并且根據(jù)這10個物種完成了相對豐度柱狀累積圖的繪制。根據(jù)圖2可以得到,OTU注釋統(tǒng)計聚類到16個門,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)在各組樣品中是優(yōu)勢菌門。

其中變形菌門的豐度含量最高(39%～63%),其次是放線菌門(15%～23%)和芽單胞菌門(4%～13%),相對百分比之和為97.56%。從整體看,煙株整個生長期間,豐度最活躍的變形菌門趨勢為團顆期(T)>旺長期(W)>采收期(C),放線菌門以旺長期最為活躍,芽單胞菌門在采收期相對活躍,并且在團顆期施加微生物菌肥的處理T1的變形菌門相對豐度>對照,這就說明施加微生物菌肥在煙葉生長團顆期間發(fā)揮效用最強;從地塊來看,各組樣品優(yōu)勢菌門豐度趨勢為地塊D1>地塊D2,在團顆期最為顯著;在中壤土中施用微生物菌肥的處理在采烤第1次前(即D2-T1-C1)擬桿菌門、厚壁菌門豐度比例明顯高于其他樣品;而酸桿菌門、芽單胞菌門豐度比例低于其他處理。值得關(guān)注的是,綠彎菌門在輕壤土中采收期間施加微生物菌肥的處理中顯著增加。

2.5 煙草根際土壤細(xì)菌在屬水平上的分布

在OTU物種注釋結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇了10個各樣本屬水平上豐度最好的物種,并且根據(jù)這10個物種完成了相對豐度柱狀累積圖的繪制。根據(jù)圖3可以得到,OTU注釋統(tǒng)計聚類到31個屬,其中羅丹桿菌屬(Rhodanobacter)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、雙子星菌屬(Gemmatimonas)、丘氏桿菌屬(Chujaibacter)、諾卡德菌屬(Nocardioides)、假桿菌屬(Pseudarthrobacter)、馬爾莫里科拉菌屬(Marmoricola)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)是各組樣品中的優(yōu)勢菌屬。其中豐度含量相對最高的是落單桿菌屬(1%～30%),其次是鞘脂單胞菌屬(0.7%～9%)和雙子星菌屬(0.3%～5%),從整體看,在煙株整個生長期間,豐度最活躍的落單桿菌屬趨勢為團顆期(T)>旺長期(W)>采收期(C),羅丹桿菌屬以團顆期最為活躍,鞘脂單胞菌屬在各個時期穩(wěn)步增長,雙子星菌屬在采收期相對活躍,并且在團顆期施加國發(fā)商品有機肥的處理T2的落單桿菌屬相對豐度>施加微生物菌肥的處理T1>對照,這就說明施加菌肥在煙葉生長團顆期間可以發(fā)揮效果;從地塊來看,各組樣品優(yōu)勢菌屬豐度趨勢為地塊 D1>地塊D2,在團顆期最為顯著,說明中壤土配施中菌肥使土層細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

2.6 熱圖

在對 OTU序列進行注釋后,用 Hatmap表示,并利用熱圖的色彩梯度和相似性差異,可以清楚地觀察到不同的樣品之間的差異,進而進行分析。

從顏色方面的reads數(shù)目看,植煙土壤微生物菌類隨著時間的延長而增多,且豐度比較強。煙株生長期間,植煙土壤微生物菌類在各個時期豐度不同,在團顆期、旺長期間羅丹桿菌屬、丘氏桿菌屬、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)豐度顯著,而在采收期雙子星菌屬、東加菌屬、Ellin6067、Pseudolabrys、Bradyrhizobium豐度顯著;整體上施用微生物菌肥的處理T1相對于對照組CK增加了豐度。施用國發(fā)有機肥的處理T2的微生物菌類豐度較弱(圖4)。

3 討論

施用微生物菌肥能顯著增加土壤中的細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),與楊昊等的結(jié)果[33]相吻合。本研究通過施用微生物菌肥,對種植煙株不同時期土壤中的細(xì)菌多樣性進行了研究。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)地的土壤細(xì)菌群落中Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)有明顯的差異,說明施用微生物菌肥后的土壤相比對照土壤中的細(xì)菌群落多樣性增高,且差異顯著。

不同質(zhì)地的土壤中,細(xì)菌的物種分布和多樣性豐富程度存在差異;不同土壤類型、不同深度對微生物群落的結(jié)構(gòu)和成分有顯著的影響。土壤的各種特性決定了土壤微生物群落的多樣性[34-38],不同的施肥處理對土壤微生物有不同的影響,施用微生物菌肥的煙葉通過根際分泌物對根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和成分構(gòu)成有一定的影響。本研究對10種主要菌門進行了分析,結(jié)果表明:變形菌門、放線菌門、芽單胞門、擬桿菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢菌門,這一結(jié)果與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相一致。變形菌門是土壤微生物中最重要的一類,其代謝活動是微生物活動的主體,是構(gòu)成土壤微生物的重要組成部分,而且在土壤中比較穩(wěn)定。云南大理煙草連作中壤土和輕壤土中,相對豐度最高的土壤細(xì)菌是變形菌門,第二和第三分別是放線菌門和芽單胞菌門;中壤土、輕壤土配施三炬微生物菌肥以及國發(fā)有機肥改變土壤優(yōu)勢菌種;中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏桿菌屬豐度,丘氏桿菌屬在各個時期均是土壤中主要細(xì)菌類群,說明其在煙葉的生長中起著重要作用。丘氏桿菌屬具有較高的代謝能力,并且生理特性多功能,在環(huán)境保護方面具有一定的發(fā)展前景。中壤土配施國發(fā)有機肥后增加了羅丹桿菌屬相對豐度;試驗土壤樣品中的主要細(xì)菌群落動態(tài)變化表現(xiàn)為:羅丹桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、雙子星菌屬和丘氏桿菌屬等,數(shù)量最多的是羅丹桿菌屬,并且種類豐富,為優(yōu)勢菌株;本研究中中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏桿菌屬豐度,丘氏桿菌屬在各個時期均是土壤中主要細(xì)菌類群,說明其在煙葉的生長中起著重要作用。中壤土配施國發(fā)有機肥后增加了羅丹桿菌屬相對豐度,微生物菌肥和國發(fā)有機肥含有綠色木霉和絲狀菌,對纖維素的分解能力較強,土壤施入微生物菌肥后,土壤中的細(xì)菌、真菌各菌種間的良性效應(yīng)得到了明顯的改善,同時還表現(xiàn)出了一種與土著菌的競爭和協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究中,不同質(zhì)地下活躍的微生物菌門都為變形菌門;中壤土微生物菌肥中重要作用的微生物類群為鞘脂單胞菌屬;而輕壤土重要作用的微生物類群為羅丹桿胞菌。中壤土施用國發(fā)有機肥、微生物菌肥土壤細(xì)菌多樣性差異不明顯,但較常規(guī)施肥土壤細(xì)菌多樣性差異明顯;輕壤土配施中微生物菌肥細(xì)菌多樣性差異明顯。因此,綜合試驗來看,不同質(zhì)地施用肥料對土壤細(xì)菌多樣性差異明顯,施用肥料可在不同程度上改善植煙土壤,但應(yīng)因地制宜施用微生物菌肥。