沙棘果中維生素C含量的測定與探究

＊王晶 劉桂艷 楊玉延 蔡曉月 楊若熙 王貝

（武漢華夏理工學(xué)院 湖北 430200）

沙棘富含維生素C，被稱“天然維生素的寶庫”，是一種典型的藥食同源植物。維生素C又名抗壞血酸，抗氧化功能較強(qiáng)[1]，可提高人體免疫力和抵抗力等。沙棘蘊(yùn)藏的開發(fā)價值高達(dá)數(shù)百億，但相關(guān)定性和定量研究較少，導(dǎo)致其相關(guān)深產(chǎn)品研發(fā)滯后。

測定果蔬中抗壞血酸含量的方法多樣，如滴定分析法、分光光度法、電化學(xué)方法、色譜分析法等，各種方法的適用性不同[2]?？偪箟难岚摎湫涂箟难?、還原型抗壞血酸及二酮古龍?zhí)撬帷＝?jīng)活性炭氧化，樣品中還原型抗壞血酸轉(zhuǎn)為脫氫抗壞血酸，與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，且脎在溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比。沙棘果肉顏色隨VC含量變高而加深，要測量其VC含量需掌握高精密度及高準(zhǔn)確度的測定方法。本試驗(yàn)利用2,4-二硝基苯肼作為顯色劑，分光光度法測定其最大吸收波長下的吸光度，將各種測定方法進(jìn)行對比，并通過改進(jìn)活性炭含量吸附沙棘果漿中的橘黃色，可定量探索樣品中VC含量[3]，進(jìn)而提升沙棘利用率、轉(zhuǎn)化率和商品率，為后續(xù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1.材料與方法

(1)儀器與試劑

沙棘果，某鮮品專營店；抗壞血酸，2,4-二硝基苯肼、硫脲、硫酸，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；草酸，天津市化工三廠有限公司。FA214型電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；TU-1900紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

(2)試劑配制

稱取2g 2,4-二硝基苯肼，溶于100mL 4.5mol/L H2SO4，過濾得2% 2,4-二硝基苯肼溶液。存放于冰箱，用前過濾；在1000mL 1mol/L鹽酸中加入100g活性炭，回流3h后過濾，除去濾液中的無鐵離子（Fe3+）（亞鐵氰化鉀試劑檢驗(yàn)）。烘箱（110℃）烘干，得無鐵離子活性炭；稱取0.1g抗壞血酸，溶于100mL蒸餾水得1mg/mL VC水溶液；稱取10g硫脲，溶于1000mL蒸餾水得1%硫脲溶液；稱取20g草酸，溶于700mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1000mL，得2%草酸溶液；量取500mL 2%草酸溶液，加蒸餾水定容至1000mL，得1%草酸溶液；量取70mL硫酸，緩緩注入20mL水中，不斷攪拌，冷卻后稀釋至100mL，得85%硫酸溶液。

(3)樣品制備

將新鮮沙棘果洗凈擦干，稱取5g放入研缽中，加等體積2%草酸，研成勻漿狀。將勻漿轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用1%草酸稀釋至刻度，充分搖勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

(4)氧化液制備

在50mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入1.2g活性炭，搖動1min后過濾。再將50mL濾液、5.0g硫脲加入500mL容量瓶，用1%草酸溶液稀釋至刻度。

(5)標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液制備

取10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL稀釋液，分別放入7個100mL容量瓶，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使稀釋液中VC濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL[4]。

2.試驗(yàn)方法

(1)最大吸收波長的測定

按照正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)反應(yīng)條件制備抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以未添加抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液組為對照組，在紫外分光光度計設(shè)定400～800nm處檢測，確定待檢測溶液的最大吸收波長。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

制備標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，在最大吸收波長、最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下分別測定標(biāo)準(zhǔn)濃度的最大吸光度值。以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，根據(jù)測得吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)四項(xiàng)單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取4個主要干擾因素分別開展單因素實(shí)驗(yàn)。在其他主要干擾因素值固定不變條件下，分別探究活性炭用量（1g、1.2g、1.5g），溫度（37℃、38℃、39℃），水浴時間（3h、3.5h、4h），氧化液用量（4mL、5mL、6mL）對抗壞血酸含量測定值的影響，以測量所得吸光度為主要評價指標(biāo)來篩選各主要干擾反應(yīng)因素的最優(yōu)反應(yīng)條件。

(4)正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論，以獲取抗壞血酸含量測定的最優(yōu)反應(yīng)條件組合為正交實(shí)驗(yàn)的重要考察指標(biāo)，選擇活性炭用量（A），溫度（B），水浴時間（C），氧化液用量（D）四個因素作為考察因素，采用四因素正交實(shí)驗(yàn)表的正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品正交實(shí)驗(yàn)。

(5)2,4-二硝基苯肼法

制備樣品溶液，按最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)，以不添加抗壞血酸溶液為對照組，在396nm處測定其吸光度，將結(jié)果帶入繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算VC含量。

精密性實(shí)驗(yàn)：用2,4-二硝基苯肼法對溶液進(jìn)行VC含量測定，連續(xù)多次測定吸光度值，計算沙棘果中VC含量，計算測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：用2,4-二硝基苯肼法對溶液進(jìn)行VC含量測定，每隔20min檢測其吸光度，檢測時間（min）對于吸光度的影響。

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：量取相同體積樣品溶液，分別加入80%、100%、120%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗壞血酸，用2,4-二硝基苯肼法測定吸光度，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)操作，計算求得其加標(biāo)回收率。

3.試驗(yàn)結(jié)果與討論

(1)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

①活性炭用量的影響

活性炭作為實(shí)驗(yàn)中的氧化劑，將還原性抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸?；钚蕴坑昧浚╣）對吸光度（A）的影響，見圖1?？芍诤愣囟?、水浴時間和氧化液用量條件下，活性炭用量不足時，無法完全氧化抗壞血酸，吸光度較不明顯；當(dāng)活性炭含量達(dá)1.2g，對抗壞血酸的氧化達(dá)到完全，吸光度顯著且趨于穩(wěn)定。故選1.2g活性炭為實(shí)驗(yàn)測定條件。

圖1 活性炭用量的影響

②溫度的影響

作為影響脫氫抗壞血酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)速度的重要因素，溫度（℃）對吸光度（A）具有顯著影響，見圖2。溫度較低時，反應(yīng)速度慢，吸光度測定值較低；溫度上升，吸光度隨之顯著上升，在38℃以上趨于平穩(wěn)。故選38℃為實(shí)驗(yàn)測定條件。

圖2 溫度的影響

③水浴時間的影響

水浴時間直接影響脫氫抗壞血酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)程度。本實(shí)驗(yàn)中水浴時間（h）對吸光度（A）影響見圖3。水浴時間不足，脫氫抗壞血酸不能與2,4-二硝基苯肼完全反應(yīng)生成脎，導(dǎo)致吸光度較低；水浴時間足夠時反應(yīng)完全，吸光度值不會隨時間增加而上升，在3.5h后趨于穩(wěn)定。故選3.5h為實(shí)驗(yàn)測定條件。

圖3 水浴時間的影響

④氧化液用量的影響

氧化液用量是影響脎生成的重要因素，吸光度值會隨其增加而增高。若用量不夠，不僅浪費(fèi)顯色劑，且不足以形成足夠的脎用于吸光度的測定。見圖4。氧化液用量＜4mL，吸光度值較小；氧化液用量＞5mL，吸光度值基本不變。同時考慮比色皿容量大小，故選5mL氧化液用量為實(shí)驗(yàn)測定條件。

圖4 氧化液用量的影響

(2)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)因素的極差值越大，則該因素的水平變化對實(shí)驗(yàn)測得吸光度值影響越大。如表1所示，四因素對沙棘果中VC含量測定影響的順序?yàn)椋夯钚蕴坑昧浚ˋ）＞水浴時間（C）＞氧化液用量（D）＞溫度（B）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

據(jù)實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)反應(yīng)條件為A2，B2，C2，D2，即1.2g活性炭，38℃溫度，3.5h水浴時間，5mL氧化液用量。

如表2所示，四因素對沙棘果中VC含量測定的影響只有活性炭用量有顯著性差異。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

(3)方法驗(yàn)證結(jié)果

①最大吸收波長與線性關(guān)系

在其他水平恒定不變的情況下，加入抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液得可見光吸收曲線。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，最大吸收波長為496nm，故選496nm進(jìn)行測定。

線性范圍評價是測定被測物質(zhì)濃度或活性的反應(yīng)曲線接近直線的程度。如圖5，以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以溶液吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得含抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為y=0.0114x+0.0764，r2=0.9984，且抗壞血酸濃度在10～70μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)濃度抗壞血酸線性關(guān)系

②精密度

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示精密度，其可接受范圍一般為2.0%以下。2,4-二硝基苯肼法測定VC含量精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%，精密度較好。

③穩(wěn)定性

2,4-二硝基苯肼法測定VC含量有較好穩(wěn)定性，但若實(shí)驗(yàn)時間較長，生成的脎會分解，溶液吸光度會隨時間增加呈現(xiàn)細(xì)微下降趨勢。故須在溶液配制后立即檢測。

④加標(biāo)回收率

2,4-二硝基苯肼法測定VC含量平均加標(biāo)回收率為102.1%±0.1%，在回收率限度范圍內(nèi)。說明分析方法對分析物在純?nèi)芤夯驈?fù)雜的基制檢測環(huán)境中反應(yīng)能力一致性較強(qiáng)，受基質(zhì)影響較小。

4.總結(jié)與展望

2,4-二硝基苯肼法測定沙棘果中VC含量，其基本原理為氧化生成的脫氫抗壞血酸與顯色劑作用生成紅色化合物，利用分光光度計進(jìn)行比色、標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中VC含量。本實(shí)驗(yàn)以2,4-二硝基苯肼作為顯色劑，活性炭作為氧化劑，活性炭1.2g，溫度38℃，水浴時間3h，氧化液5mL組合測定。精密度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，回收率好，易于推廣，為準(zhǔn)確測定沙棘果中VC含量提供依據(jù)，可推動高附加值沙棘產(chǎn)品研發(fā)，市場前景廣闊。顯然，沙棘中存在大量較強(qiáng)抗氧化性的多酚，目前該方法沒有色譜分離，無法嚴(yán)密考慮多酚引起的顯色反應(yīng)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。接下來將繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)色譜分離后觀察多酚引起的抗氧化性與維生素C的對比，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。