恭城月柿多酚氧化酶特性研究

吳婷婷 ，段振華 ，王春婷

1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（賀州 542899）；2.廣西康養(yǎng)食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室（賀州 542899）；3.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

柿為柿科柿屬植物，是我國六大木本糧油樹種之一[1]。我國種植地區(qū)廣泛且擁有三千多年的種植歷史，其中河南、河北、廣西是我國三大種植區(qū)，總年產(chǎn)量約占全國年產(chǎn)量的50%[2]。我國柿果品種繁多，初步可以分為兩類：一類是可以在樹上自然脫澀并直接食用的甜柿；一類是無法在樹上通過自身作用脫澀，需經(jīng)過人工脫澀處理才可食用的澀柿[3]。恭城月柿，別名“水柿”，盛產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)桂林市恭城瑤族自治縣（簡稱恭城），是廣西主要種植的特色澀柿品種，距今已有400多年栽培歷史。因月柿品質(zhì)上等，1996年恭城被授予全國唯一的“中國月柿之鄉(xiāng)”稱號，2000年，恭城月柿的優(yōu)良品質(zhì)讓其好評如潮，被授予“中華名果”的美稱[4]。同時，恭城月柿是一種藥食同源的水果，不僅含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、糖類和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)及碘、鈣、鐵、磷等礦質(zhì)元素，還含有大量抗氧化物質(zhì)，如單寧、蘆丁和黃酮類物質(zhì)等，具有一定藥用價值[5-6]。

恭城月柿營養(yǎng)豐富，是典型的呼吸躍變型果實，采摘后在鮮果貯存、保鮮和加工過程中極易發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，嚴(yán)重影響恭城月柿相關(guān)加工產(chǎn)品的風(fēng)味和外觀品質(zhì)，制約了恭城月柿的深加工產(chǎn)業(yè)。多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于果蔬的組織細(xì)胞中，是一類含有輔基銅離子的結(jié)合酶[7]。很多研究表明PPO的激活會引起酚類物質(zhì)的氧化和聚合，是果蔬酶促褐變的主要原因之一[8]，且不同果蔬中PPO的酶學(xué)特性也各有差異。因此，為阻止酶促褐變對加工產(chǎn)品產(chǎn)生的不良影響，恭城月柿PPO酶學(xué)特性的相關(guān)研究是恭城月柿采后加工的研究重點。

國內(nèi)外學(xué)者對許多水果中PPO的酶學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)研究，如蘋果[9]、芒果[10]、桃[11]和檸檬[12]等。但是對于恭城月柿，很少有關(guān)其PPO的酶學(xué)特性及控制措施的報道。因此，以廣西恭城月柿為試驗材料，研究其PPO的酶學(xué)特性，以及3種酶抑制劑對PPO酶活性的影響效果，以期為恭城月柿采后生產(chǎn)加工過程中的酶促褐變控制及機(jī)理研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

恭城月柿（市售）。

1.2 儀器與試劑

PTX-FA11OS型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；A11型微型粉碎機(jī)（德國IKA集團(tuán)）；P1200S型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)（湖南力辰儀器科技有限公司）；HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；UV-1780型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；5804R型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公司）。

愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、冰醋酸、乙酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉（均為分析純）。

1.3 方法

1.3.1 恭城月柿PPO粗酶液的提取

參考Qi等[13]的方法并略有修改。將新鮮的恭城月柿清洗、削皮后，用液氮速凍后快速研磨呈粉末狀，放置于-80 ℃超低溫冰箱中貯藏備用。稱取1 g恭城月柿粉末，加入6 mL 0.1 mol/L pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液（溶液中含有1%的聚乙烯吡咯烷酮），振蕩搖勻后在冰浴條件下靜置提取10 min，在4 ℃以10 000 r/min離心20 min，所得上清液即為PPO粗酶液，放入4℃冰箱中保存，并在12 h內(nèi)完成PPO酶活性的測定。

1.3.2 恭城月柿PPO酶活性的測定

PPO酶活性的測定采用鄰苯二酚法[13]。0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液組成反應(yīng)體系，迅速啟動反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)15 s后于波長410 nm處測定吸光度。每隔30 s記錄1次，共測定3 min?？瞻讓φ詹捎谜麴s水代替鄰苯二酚，以每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活力單位U，最后活力值表示為U/g。試驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3.3 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

分別用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制濃度為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液。分別取2.9 mL各濃度鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室溫下反應(yīng)15 s后于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.4 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

分別配制pH 3.5，4.5和5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 6.0，6.5，7.0，7.5和8.0的磷酸鹽緩沖液，用上述不同pH的緩沖液配制濃度0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液作為反應(yīng)底物。分別取2.9 mL各pH的0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室溫下反應(yīng)15 s后于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.5 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

濃度0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液組成反應(yīng)體系，快速搖勻反應(yīng)體系，分別在20，25，30，35，40，45，50，60，70和80 ℃于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.6 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響

在1.3.2的反應(yīng)體系中分別加入0.2 mL不同濃度的亞硫酸氫鈉溶液（1，5和10 mmol/L）、抗壞血酸溶液（1，5和10 mmol/L）和檸檬酸溶液（1，5和10 mmol/L），在室溫下反應(yīng)15 s后于波長410 nm處測定吸光度。PPO相對酶活性以初始酶活力為100%，不同抑制處理下測得的酶活力與初始酶活力的比值[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行處理分析，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Origin 2021 Pro軟件進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并以干基計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響如圖1所示。恭城月柿PPO酶活性與底物鄰苯二酚溶液的濃度息息相關(guān)，PPO酶活性隨著鄰苯二酚濃度的增加而呈現(xiàn)增大的趨勢，鄰苯二酚濃度0.03 mol/L時PPO酶活性達(dá)到最大，最大值為47.43 U/g。而刺梨PPO的最適底物濃度為0.1 mol/L[15]，杏PPO的最適底物濃度為0.067 mol/L[16]，這表明不同水果PPO反應(yīng)時的最適底物濃度各有差異。隨著鄰苯二酚溶液濃度繼續(xù)增加，PPO酶活性不再增大，反而呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是底物濃度過低時，PPO粗酶液中只有部分酶分子能與底物結(jié)合發(fā)生酶促褐變反應(yīng)。隨著底物濃度的增加，越來越多的酶分子可與底物結(jié)合反應(yīng)，酶分子與底物的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，此時酶活性達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加底物濃度也不能提高PPO酶活性[17]。

圖1 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.2 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

圖2描述pH對恭城月柿PPO酶活性的影響。在不同pH的緩沖液下恭城月柿PPO酶活性變化明顯，說明PPO酶活性對反應(yīng)環(huán)境的酸堿性很敏感。pH在6.0～7.0時，PPO酶活性較高，pH 6.5時PPO酶活性達(dá)到最大，因此，恭城月柿PPO酶的最適pH為6.5，這與文獻(xiàn)中報道的PPO最適pH[18-19]一致。pH低于6.0或高于7.0時，PPO酶活性急劇下降，且在pH 3.5時PPO酶活性極低，這說明酸性或堿性過強(qiáng)的環(huán)境都不利于PPO與底物結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。PPO酶活性的下降可能與其本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。PPO是一類含銅蛋白質(zhì)，輔基銅在較強(qiáng)的酸性條件下會以銅離子的形式解離出來，從而導(dǎo)致PPO的變性失活；而在較強(qiáng)的堿性條件下，輔基銅又會與堿性溶液中的氫氧根離子結(jié)合形成不溶性的氫氧化銅，進(jìn)一步促使酶活力顯著降低[20]。由于反應(yīng)環(huán)境酸堿性嚴(yán)重影響恭城月柿PPO的酶活性，所以在恭城月柿的生產(chǎn)加工過程中可通過控制反應(yīng)環(huán)境的酸堿性抑制PPO酶活性，進(jìn)而有效控制酶促褐變。

圖2 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.3 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

圖3反映不同溫度下，恭城月柿PPO酶活性的強(qiáng)弱。恭城月柿PPO的最適反應(yīng)溫度為25 ℃，而蘋果PPO[21]的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，桃金娘PPO[22]的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，這說明不同果蔬PPO的適宜反應(yīng)溫度存在差異。同時，隨著溫度的升高，恭城月柿PPO酶活性呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，溫度25 ℃時PPO酶活性達(dá)到最大值53.72 U/g，溫度80 ℃時PPO酶活性基本消失。這主要是由于PPO的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，高溫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級組織重排和三級組織斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致PPO變性失活[23]。在實際生產(chǎn)加工過程中，如果選用高溫手段使PPO失活，則應(yīng)選擇80 ℃以上的溫度。

圖3 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.4 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響

不同濃度的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸溶液對恭城月柿PPO酶活性的抑制影響如表1所示。結(jié)果顯示，3種酶抑制劑對PPO酶活性均有抑制作用，其中抗壞血酸對PPO酶活性的抑制作用最強(qiáng)，亞硫酸氫鈉對PPO酶活性有明顯的抑制作用，而檸檬酸對PPO酶活性的抑制作用較弱，這與朱金霞等[24]對枸杞鮮果的研究結(jié)果相似?？箟难釋PO的抑制作用在于抗壞血酸與PPO結(jié)合后，PPO的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)減少，從而顯著改變PPO的二級結(jié)構(gòu)[25]。從表1中還可以看出，恭城月柿PPO相對酶活性隨著抗壞血酸濃度的升高而減小，抗壞血酸濃度增大到10 mmol/L時，PPO相對酶活性僅有8.1%，極大抑制了PPO酶活性；隨著亞硫酸氫鈉和檸檬酸濃度的增大，對PPO酶活性的抑制效果越明顯。雖然亞硫酸氫鈉也能明顯抑制恭城月柿PPO活性，但是亞硫酸鹽及其分解產(chǎn)物SO2對人體健康有害，亞硫酸氫鈉在食品中的使用有嚴(yán)格的限制[26]。而抗壞血酸是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時是國標(biāo)允許在鮮果加工過程中使用的食品添加劑[27]，被廣泛用于果蔬貯藏加工中，如各種果汁、罐頭的色澤保鮮等[28]。因此，在恭城月柿采后的生產(chǎn)加工過程中可通過添加抗壞血酸抑制PPO的酶活力，抑制酶促褐變的發(fā)生。

表1 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響（±s，n=3）

表1 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響（±s，n=3）

3 結(jié)論

試驗研究反應(yīng)條件和3種抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響。結(jié)果表明，以鄰苯二酚為底物，恭城月柿的最適底物濃度0.03 mol/L，最適pH 6.5，最適反應(yīng)溫度25 ℃。3種酶抑制劑對PPO活性均有抑制作用，抗壞血酸的抑制效果最好，亞硫酸氫鈉的效果次之，檸檬酸的抑制效果最差。其中，濃度10 mmol/L時的抗壞血酸可使恭城月柿多酚氧化酶喪失90%以上的酶活力。試驗明確恭城月柿PPO的酶學(xué)特性，為恭城月柿深加工中酶促褐變的控制提供一定理論依據(jù)。