《淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》解讀*

冉隆榮,吳雪蓮,楊再林

重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液腫瘤中心,重慶 400030

血液腫瘤是一類起源于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤(HL)等是臨床常見的血液腫瘤類型[1]。據(jù)資料顯示,在2019年全球新增血液腫瘤患者約134.385萬例,73.022萬人因其死亡,是全球主要死亡原因之一[2]。腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān),雖然基于流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的淋巴細(xì)胞亞群檢測已被廣泛用于評估血液腫瘤患者的免疫狀態(tài)、預(yù)測疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及指導(dǎo)治療等方面,但依然存在認(rèn)識不統(tǒng)一、應(yīng)用不規(guī)范等問題。由中國醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量管理專業(yè)委員會發(fā)表的《淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》(以下簡稱《共識》)[3],是國內(nèi)首個(gè)關(guān)于淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識,其詳細(xì)介紹了淋巴細(xì)胞亞群檢測推薦的抗體組合、報(bào)告內(nèi)容、檢測過程中質(zhì)量管理的要點(diǎn),總結(jié)了淋巴細(xì)胞亞群對血液腫瘤篩查、復(fù)發(fā)及合并感染預(yù)警、預(yù)后評估、造血干細(xì)胞移植(HSCT)后免疫重建與移植物抗宿主病(GVHD)監(jiān)測、嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞(CAR-T)免疫治療后監(jiān)測、用藥指導(dǎo)與療效監(jiān)測等方面的應(yīng)用價(jià)值,并對血液腫瘤患者的監(jiān)測方案與隨訪時(shí)機(jī)選擇做出了推薦?，F(xiàn)對該《共識》作一解讀,以期望更好地應(yīng)用于臨床。

1 淋巴細(xì)胞亞群檢測的報(bào)告內(nèi)容與質(zhì)量管理

淋巴細(xì)胞亞群檢測是臨床開展最廣泛的FCM檢測項(xiàng)目之一,是利用各種熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體測定各類淋巴細(xì)胞胞膜或胞內(nèi)的分化抗原(CD),從而對淋巴細(xì)胞的各個(gè)亞群進(jìn)行分析。原國家衛(wèi)生部在2011年發(fā)布的(WS/T 360-2011)《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》對于規(guī)范FCM在外周血淋巴細(xì)胞亞群分析中的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義[4]。常規(guī)檢測的淋巴細(xì)胞亞群包括T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)和NK淋巴細(xì)胞CD3-(CD16+CD56)+,T淋巴細(xì)胞又分為輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)及殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+),以上細(xì)胞統(tǒng)稱為TBNK;CD3+CD4+CD25+CD127low/-的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是另一個(gè)重要的T細(xì)胞功能亞群,在該《共識》中,把TBNK和Treg細(xì)胞統(tǒng)稱為淋巴細(xì)胞亞群。

《共識》推薦外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測的標(biāo)本采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝,并在24 h內(nèi)進(jìn)行檢測。根據(jù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)條件的不同,既可以采用雙平臺法,也可以采用單平臺法。雙平臺法應(yīng)采用與FCM檢測的同一標(biāo)本進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類;單平臺法既可以采用微球法,也可以采用體積法。推薦的TBNK檢測抗體組合為CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56;推薦的Treg細(xì)胞檢測的抗體組合為CD3、CD4、CD25、CD127;推薦每管獲取淋巴細(xì)胞數(shù)應(yīng)不小于10 000個(gè);TBNK檢測推薦報(bào)告CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞和CD3-(CD16+CD56)+NK細(xì)胞的相對計(jì)數(shù)(百分比)和絕對計(jì)數(shù)(絕對值),CD4+/CD8+比值,Treg細(xì)胞檢測推薦報(bào)告Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比。在報(bào)告審核時(shí)應(yīng)滿足CD3+%+CD19+%+(CD16+CD56)+%≈(100%±5%);CD4+%+CD8+%≈CD3+%(變化范圍為5%～10%),若不滿足,必要時(shí)應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)及標(biāo)本推片鏡檢。

近年來,越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道了不同地區(qū)、不同種族、不同人群的淋巴細(xì)胞亞群參考范圍[5-9],《共識》推薦有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間及評價(jià)體系。實(shí)驗(yàn)室自建參考區(qū)間時(shí),每組應(yīng)不少于120例健康樣本,參考區(qū)間驗(yàn)證應(yīng)不少于20例健康樣本,分布在參考區(qū)間外的測定值應(yīng)不超過10%。開展淋巴細(xì)胞亞群檢測的實(shí)驗(yàn)室均需參加國家衛(wèi)生健康委員會或省市級臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評,從而保證實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。Treg細(xì)胞檢測項(xiàng)目因?yàn)槟壳皣鴥?nèi)沒有相應(yīng)的室間質(zhì)評,應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室室間比對。

2 淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中的應(yīng)用

血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫功能失衡有關(guān),免疫功能在疾病和診療評價(jià)中發(fā)揮著重要的作用[10-16]。淋巴細(xì)胞亞群檢測可為臨床對機(jī)體細(xì)胞免疫功能評價(jià)提供依據(jù)。該《共識》總結(jié)了淋巴細(xì)胞亞群檢測對血液腫瘤7個(gè)方面的應(yīng)用,為臨床提供參考,其具體應(yīng)用如下。

2.1初篩血液腫瘤 對于部分由淋巴細(xì)胞來源的血液腫瘤,包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞增殖性疾病(CLPD)等可表現(xiàn)為特定外周血淋巴細(xì)胞亞群比例及表型異常[16]。出現(xiàn)以下3種情況,在排除標(biāo)本、實(shí)驗(yàn)操作及反應(yīng)性改變等原因后,可考慮對血液腫瘤進(jìn)行篩查:(1)當(dāng)B淋巴細(xì)胞或NK淋巴細(xì)胞顯著增高,在排除細(xì)菌感染及其他非腫瘤原因引起的淋巴細(xì)胞增高后,需考慮成熟B淋巴細(xì)胞增殖性疾病或NK細(xì)胞淋巴瘤可能;(2)若CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞或CD3+CD4-CD8-T明顯增高,在排除感染導(dǎo)致的反應(yīng)性升高后需考慮T淋巴細(xì)胞腫瘤可能;(3)當(dāng)CD4+/CD8+比值大于10∶1或小于1∶10,可輔助CD4+T淋巴細(xì)胞來源或CD8+T淋巴細(xì)胞來源的腫瘤診斷。

2.2評估血液腫瘤患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后 淋巴細(xì)胞亞群改變與血液腫瘤患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示,Treg細(xì)胞能抑制腫瘤微環(huán)境中有效的抗腫瘤反應(yīng),從而有利于腫瘤細(xì)胞的生長[17]。Treg細(xì)胞的數(shù)量和比例與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)[18-22]。CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例增高與患者較好的預(yù)后相關(guān)。在急性髓系白血病(AML)患者中,NK細(xì)胞數(shù)量和比例減低與患者較差的預(yù)后相關(guān)[23]。NK細(xì)胞數(shù)量減少的慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和MM患者可能預(yù)后較差,且發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)增加[24-25]。

2.3血液腫瘤合并感染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警 淋巴細(xì)胞亞群檢測可以用于腫瘤患者感染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)<500個(gè)/微升時(shí),患者機(jī)會性感染風(fēng)險(xiǎn)增加;淋巴瘤患者CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量低下時(shí),患者化療后感染風(fēng)險(xiǎn)增加;初診時(shí)Treg細(xì)胞比例增加的患者,住院期間感染率增加。

2.4HSCT后患者免疫重建的監(jiān)測及GVHD的預(yù)防 HSCT后造血能力的恢復(fù)與免疫功能密切相關(guān)。GVHD是異基因HSCT后死亡的主要原因[26],及時(shí)準(zhǔn)確地判斷患者免疫重建狀態(tài)及是否發(fā)生排異反應(yīng)是移植成敗的關(guān)鍵。HSCT患者免疫重建過程中,NK淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)最快,CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)次之,CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)較慢,CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)時(shí)間不等,短則3個(gè)月,長則1年半以上。在HSCT早期Treg細(xì)胞比例很低,晚期逐漸增多。研究表明,Treg細(xì)胞隨著GVHD等級的增加而呈下降趨勢[27],Treg細(xì)胞有望作為預(yù)測急性和慢性GVHD的特異性指標(biāo)[28-29]。移植后NK細(xì)胞數(shù)量增加能促進(jìn)大量炎癥因子的分泌,也可作為急性GVHD發(fā)生的預(yù)測標(biāo)志物。

2.5CAR-T治療患者的規(guī)范化管理和評估 針對CAR-T治療患者,推薦對患者外周血中CAR-T細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群同時(shí)檢測。有研究發(fā)現(xiàn),CAR-T細(xì)胞回輸后第15天的外周血低水平的淋巴細(xì)胞數(shù)(<0.67×109/L)與CAR-T治療患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[30]。另有研究顯示,體內(nèi)CAR-T細(xì)胞增殖水平與療效呈正相關(guān)[31-33]。外周血CAR-T細(xì)胞檢測時(shí)建議報(bào)告總CAR-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞、CD4+CAR-T細(xì)胞(占T淋巴細(xì)胞)和CD8+CAR-T細(xì)胞(占T淋巴細(xì)胞)的比例及數(shù)量。

2.6指導(dǎo)CD20單抗和免疫調(diào)節(jié)藥物的用藥 在CD20單抗治療的血液腫瘤患者中,外周血B淋巴細(xì)胞數(shù)量與藥物使用呈劑量依賴性,若外周血B淋巴細(xì)胞數(shù)量未出現(xiàn)明顯減少或無劑量依賴,則提示患者對CD20單抗治療反應(yīng)差,需考慮更換治療方案。對免疫功能缺陷或嚴(yán)重受損的患者,當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量<100個(gè)/微升時(shí),患者嚴(yán)重感染的概率增加,建議停用免疫抑制藥;當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量<200個(gè)/微升時(shí),需注意免疫抑制藥的劑量。對移植和免疫治療患者,當(dāng)CD4+/CD8+比值<0.2時(shí),建議停用免疫抑制藥;CD4+/CD8+比值<0.5時(shí),需謹(jǐn)慎使用免疫抑制藥,并注意患者免疫功能狀態(tài)及感染情況。在治療期間合并感染的患者,如果出現(xiàn)NK淋巴細(xì)胞或CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例較治療前明顯升高,提示伴有病毒感染的可能。

2.7動態(tài)監(jiān)測及隨訪 《共識》強(qiáng)調(diào)了建立患者淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果基線的重要性,并建議規(guī)律、動態(tài)監(jiān)測其變化趨勢。建議有條件的單位,可在報(bào)告中呈現(xiàn)結(jié)果動態(tài)變化的趨勢圖。對放化療、免疫治療、靶向治療的患者,推薦在初診時(shí)、治療周期動態(tài)監(jiān)測淋巴細(xì)胞亞群變化,評估患者治療期間免疫功能恢復(fù)情況及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及感染的風(fēng)險(xiǎn)情況。有條件的情況下,建議可在治療結(jié)束后半年內(nèi)每3個(gè)月跟蹤隨訪,半年后每6個(gè)月進(jìn)行隨訪。對造血干細(xì)胞移植治療的患者在移植后第14天、21天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年進(jìn)行監(jiān)測與隨訪。對CAR-T治療的患者,應(yīng)在患者回輸CAR-T后,連續(xù)監(jiān)測第4、7、14、28天的外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化情況,評估患者在治療期間的免疫狀態(tài),在治療后2、3、6月隨訪患者的免疫功能狀態(tài)。

3 淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤患者中應(yīng)用的挑戰(zhàn)和展望

《共識》指出,由于機(jī)體免疫功能受年齡、藥物、感染、營養(yǎng)、生理等眾多因素的影響,存在較大的個(gè)體差異,且機(jī)體免疫功能是動態(tài)變化的,同一患者的不同疾病狀態(tài)下淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)較大的波動。因此,淋巴細(xì)胞亞群檢測在參考范圍的建立、報(bào)告結(jié)果解讀等方面依然存在挑戰(zhàn)。用于免疫功能評價(jià)的淋巴細(xì)胞亞群檢測在臨床已廣泛開展,《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[4]是各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)及實(shí)驗(yàn)室開展淋巴細(xì)胞亞群項(xiàng)目檢測最基本的參照依據(jù)。該《共識》一方面強(qiáng)調(diào)了淋巴細(xì)胞亞群檢測實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果報(bào)告、結(jié)果分析的質(zhì)量控制要點(diǎn),有助于提高實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性;另一方面總結(jié)了淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤中的臨床價(jià)值,并對血液腫瘤患者的監(jiān)測方案與隨訪時(shí)機(jī)選擇做出了推薦?！豆沧R》推薦了淋巴細(xì)胞亞群檢測在血液腫瘤應(yīng)用中的規(guī)范模式,有利于系統(tǒng)科學(xué)的監(jiān)測及評估血液腫瘤患者的免疫功能狀態(tài),可以幫助臨床醫(yī)生做出更加精準(zhǔn)的診療決策,使患者獲益。