《淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》解讀*

冉隆榮,吳雪蓮,楊再林

重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院血液腫瘤中心,重慶 400030

血液腫瘤是一類起源于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤(HL)等是臨床常見的血液腫瘤類型[1]。據(jù)資料顯示,在2019年全球新增血液腫瘤患者約134.385萬例,73.022萬人因其死亡,是全球主要死亡原因之一[2]。腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機體的免疫功能密切相關(guān),雖然基于流式細胞術(shù)(FCM)的淋巴細胞亞群檢測已被廣泛用于評估血液腫瘤患者的免疫狀態(tài)、預(yù)測疾病復發(fā)或轉(zhuǎn)移風險及指導治療等方面,但依然存在認識不統(tǒng)一、應(yīng)用不規(guī)范等問題。由中國醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會醫(yī)學檢驗質(zhì)量管理專業(yè)委員會發(fā)表的《淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識》(以下簡稱《共識》)[3],是國內(nèi)首個關(guān)于淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中應(yīng)用的專家共識,其詳細介紹了淋巴細胞亞群檢測推薦的抗體組合、報告內(nèi)容、檢測過程中質(zhì)量管理的要點,總結(jié)了淋巴細胞亞群對血液腫瘤篩查、復發(fā)及合并感染預(yù)警、預(yù)后評估、造血干細胞移植(HSCT)后免疫重建與移植物抗宿主病(GVHD)監(jiān)測、嵌合抗原受體T淋巴細胞(CAR-T)免疫治療后監(jiān)測、用藥指導與療效監(jiān)測等方面的應(yīng)用價值,并對血液腫瘤患者的監(jiān)測方案與隨訪時機選擇做出了推薦?，F(xiàn)對該《共識》作一解讀,以期望更好地應(yīng)用于臨床。

1 淋巴細胞亞群檢測的報告內(nèi)容與質(zhì)量管理

淋巴細胞亞群檢測是臨床開展最廣泛的FCM檢測項目之一,是利用各種熒光染料標記的單克隆抗體測定各類淋巴細胞胞膜或胞內(nèi)的分化抗原(CD),從而對淋巴細胞的各個亞群進行分析。原國家衛(wèi)生部在2011年發(fā)布的(WS/T 360-2011)《流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群指南》對于規(guī)范FCM在外周血淋巴細胞亞群分析中的應(yīng)用具有重要指導意義[4]。常規(guī)檢測的淋巴細胞亞群包括T淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD3-CD19+)和NK淋巴細胞CD3-(CD16+CD56)+,T淋巴細胞又分為輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+)及殺傷性T淋巴細胞(CD3+CD8+),以上細胞統(tǒng)稱為TBNK;CD3+CD4+CD25+CD127low/-的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg細胞)是另一個重要的T細胞功能亞群,在該《共識》中,把TBNK和Treg細胞統(tǒng)稱為淋巴細胞亞群。

《共識》推薦外周血淋巴細胞亞群檢測的標本采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝,并在24 h內(nèi)進行檢測。根據(jù)醫(yī)療機構(gòu)條件的不同,既可以采用雙平臺法,也可以采用單平臺法。雙平臺法應(yīng)采用與FCM檢測的同一標本進行白細胞計數(shù)和分類;單平臺法既可以采用微球法,也可以采用體積法。推薦的TBNK檢測抗體組合為CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56;推薦的Treg細胞檢測的抗體組合為CD3、CD4、CD25、CD127;推薦每管獲取淋巴細胞數(shù)應(yīng)不小于10 000個;TBNK檢測推薦報告CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD3-CD19+B淋巴細胞和CD3-(CD16+CD56)+NK細胞的相對計數(shù)(百分比)和絕對計數(shù)(絕對值),CD4+/CD8+比值,Treg細胞檢測推薦報告Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的百分比。在報告審核時應(yīng)滿足CD3+%+CD19+%+(CD16+CD56)+%≈(100%±5%);CD4+%+CD8+%≈CD3+%(變化范圍為5%～10%),若不滿足,必要時應(yīng)重復實驗及標本推片鏡檢。

近年來,越來越多的文獻報道了不同地區(qū)、不同種族、不同人群的淋巴細胞亞群參考范圍[5-9],《共識》推薦有條件的實驗室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間及評價體系。實驗室自建參考區(qū)間時,每組應(yīng)不少于120例健康樣本,參考區(qū)間驗證應(yīng)不少于20例健康樣本,分布在參考區(qū)間外的測定值應(yīng)不超過10%。開展淋巴細胞亞群檢測的實驗室均需參加國家衛(wèi)生健康委員會或省市級臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)評,從而保證實驗室檢測結(jié)果的準確性。Treg細胞檢測項目因為目前國內(nèi)沒有相應(yīng)的室間質(zhì)評,應(yīng)進行實驗室室間比對。

2 淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中的應(yīng)用

血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫功能失衡有關(guān),免疫功能在疾病和診療評價中發(fā)揮著重要的作用[10-16]。淋巴細胞亞群檢測可為臨床對機體細胞免疫功能評價提供依據(jù)。該《共識》總結(jié)了淋巴細胞亞群檢測對血液腫瘤7個方面的應(yīng)用,為臨床提供參考,其具體應(yīng)用如下。

2.1初篩血液腫瘤 對于部分由淋巴細胞來源的血液腫瘤,包括急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞增殖性疾病(CLPD)等可表現(xiàn)為特定外周血淋巴細胞亞群比例及表型異常[16]。出現(xiàn)以下3種情況,在排除標本、實驗操作及反應(yīng)性改變等原因后,可考慮對血液腫瘤進行篩查:(1)當B淋巴細胞或NK淋巴細胞顯著增高,在排除細菌感染及其他非腫瘤原因引起的淋巴細胞增高后,需考慮成熟B淋巴細胞增殖性疾病或NK細胞淋巴瘤可能;(2)若CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞或CD3+CD4-CD8-T明顯增高,在排除感染導致的反應(yīng)性升高后需考慮T淋巴細胞腫瘤可能;(3)當CD4+/CD8+比值大于10∶1或小于1∶10,可輔助CD4+T淋巴細胞來源或CD8+T淋巴細胞來源的腫瘤診斷。

2.2評估血液腫瘤患者復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后 淋巴細胞亞群改變與血液腫瘤患者復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示,Treg細胞能抑制腫瘤微環(huán)境中有效的抗腫瘤反應(yīng),從而有利于腫瘤細胞的生長[17]。Treg細胞的數(shù)量和比例與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)[18-22]。CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量和比例增高與患者較好的預(yù)后相關(guān)。在急性髓系白血病(AML)患者中,NK細胞數(shù)量和比例減低與患者較差的預(yù)后相關(guān)[23]。NK細胞數(shù)量減少的慢性淋巴細胞白血病(CLL)和MM患者可能預(yù)后較差,且發(fā)生感染的風險增加[24-25]。

2.3血液腫瘤合并感染風險預(yù)警 淋巴細胞亞群檢測可以用于腫瘤患者感染風險預(yù)警。當CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)<500個/微升時,患者機會性感染風險增加;淋巴瘤患者CD4+T、CD8+T淋巴細胞數(shù)量低下時,患者化療后感染風險增加;初診時Treg細胞比例增加的患者,住院期間感染率增加。

2.4HSCT后患者免疫重建的監(jiān)測及GVHD的預(yù)防 HSCT后造血能力的恢復與免疫功能密切相關(guān)。GVHD是異基因HSCT后死亡的主要原因[26],及時準確地判斷患者免疫重建狀態(tài)及是否發(fā)生排異反應(yīng)是移植成敗的關(guān)鍵。HSCT患者免疫重建過程中,NK淋巴細胞數(shù)量恢復最快,CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量恢復次之,CD3+CD4+T淋巴細胞數(shù)量恢復較慢,CD3-CD19+B淋巴細胞數(shù)量恢復時間不等,短則3個月,長則1年半以上。在HSCT早期Treg細胞比例很低,晚期逐漸增多。研究表明,Treg細胞隨著GVHD等級的增加而呈下降趨勢[27],Treg細胞有望作為預(yù)測急性和慢性GVHD的特異性指標[28-29]。移植后NK細胞數(shù)量增加能促進大量炎癥因子的分泌,也可作為急性GVHD發(fā)生的預(yù)測標志物。

2.5CAR-T治療患者的規(guī)范化管理和評估 針對CAR-T治療患者,推薦對患者外周血中CAR-T細胞和淋巴細胞亞群同時檢測。有研究發(fā)現(xiàn),CAR-T細胞回輸后第15天的外周血低水平的淋巴細胞數(shù)(<0.67×109/L)與CAR-T治療患者的預(yù)后呈負相關(guān)[30]。另有研究顯示,體內(nèi)CAR-T細胞增殖水平與療效呈正相關(guān)[31-33]。外周血CAR-T細胞檢測時建議報告總CAR-T細胞占淋巴細胞、CD4+CAR-T細胞(占T淋巴細胞)和CD8+CAR-T細胞(占T淋巴細胞)的比例及數(shù)量。

2.6指導CD20單抗和免疫調(diào)節(jié)藥物的用藥 在CD20單抗治療的血液腫瘤患者中,外周血B淋巴細胞數(shù)量與藥物使用呈劑量依賴性,若外周血B淋巴細胞數(shù)量未出現(xiàn)明顯減少或無劑量依賴,則提示患者對CD20單抗治療反應(yīng)差,需考慮更換治療方案。對免疫功能缺陷或嚴重受損的患者,當CD4+T淋巴細胞數(shù)量<100個/微升時,患者嚴重感染的概率增加,建議停用免疫抑制藥;當CD4+T淋巴細胞數(shù)量<200個/微升時,需注意免疫抑制藥的劑量。對移植和免疫治療患者,當CD4+/CD8+比值<0.2時,建議停用免疫抑制藥;CD4+/CD8+比值<0.5時,需謹慎使用免疫抑制藥,并注意患者免疫功能狀態(tài)及感染情況。在治療期間合并感染的患者,如果出現(xiàn)NK淋巴細胞或CD8+T淋巴細胞數(shù)量及比例較治療前明顯升高,提示伴有病毒感染的可能。

2.7動態(tài)監(jiān)測及隨訪 《共識》強調(diào)了建立患者淋巴細胞亞群檢測結(jié)果基線的重要性,并建議規(guī)律、動態(tài)監(jiān)測其變化趨勢。建議有條件的單位,可在報告中呈現(xiàn)結(jié)果動態(tài)變化的趨勢圖。對放化療、免疫治療、靶向治療的患者,推薦在初診時、治療周期動態(tài)監(jiān)測淋巴細胞亞群變化,評估患者治療期間免疫功能恢復情況及腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移及感染的風險情況。有條件的情況下,建議可在治療結(jié)束后半年內(nèi)每3個月跟蹤隨訪,半年后每6個月進行隨訪。對造血干細胞移植治療的患者在移植后第14天、21天、1個月、3個月、6個月、1年、2年進行監(jiān)測與隨訪。對CAR-T治療的患者,應(yīng)在患者回輸CAR-T后,連續(xù)監(jiān)測第4、7、14、28天的外周血淋巴細胞亞群的變化情況,評估患者在治療期間的免疫狀態(tài),在治療后2、3、6月隨訪患者的免疫功能狀態(tài)。

3 淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤患者中應(yīng)用的挑戰(zhàn)和展望

《共識》指出,由于機體免疫功能受年齡、藥物、感染、營養(yǎng)、生理等眾多因素的影響,存在較大的個體差異,且機體免疫功能是動態(tài)變化的,同一患者的不同疾病狀態(tài)下淋巴細胞亞群檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)較大的波動。因此,淋巴細胞亞群檢測在參考范圍的建立、報告結(jié)果解讀等方面依然存在挑戰(zhàn)。用于免疫功能評價的淋巴細胞亞群檢測在臨床已廣泛開展,《流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群指南》[4]是各級醫(yī)療機構(gòu)及實驗室開展淋巴細胞亞群項目檢測最基本的參照依據(jù)。該《共識》一方面強調(diào)了淋巴細胞亞群檢測實驗操作、結(jié)果報告、結(jié)果分析的質(zhì)量控制要點,有助于提高實驗室檢測結(jié)果的準確性;另一方面總結(jié)了淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中的臨床價值,并對血液腫瘤患者的監(jiān)測方案與隨訪時機選擇做出了推薦?！豆沧R》推薦了淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤應(yīng)用中的規(guī)范模式,有利于系統(tǒng)科學的監(jiān)測及評估血液腫瘤患者的免疫功能狀態(tài),可以幫助臨床醫(yī)生做出更加精準的診療決策,使患者獲益。