全基因組測(cè)序技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用*

姚如恩,傅啟華,郁婷婷△

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心遺傳分子診斷科,上海 200127;2.上海市兒科臨床分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200127

全基因組測(cè)序(WGS)技術(shù)是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物技術(shù)結(jié)合的方法,對(duì)生物體整個(gè)基因組序列進(jìn)行測(cè)序,并分析其遺傳信息的基因檢測(cè)技術(shù)。相比其他分子檢測(cè)技術(shù),WGS技術(shù)具有檢測(cè)基因組所有區(qū)域內(nèi)幾乎所有類(lèi)型遺傳變異的重要優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,尤其是國(guó)產(chǎn)測(cè)序儀的不斷推出和優(yōu)化,推動(dòng)著測(cè)序成本的降低,使得WGS技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床診斷。特別是在遺傳病診斷領(lǐng)域中,WGS技術(shù)已經(jīng)逐漸展現(xiàn)出強(qiáng)大的診斷實(shí)力和廣泛的應(yīng)用前景。

目前在遺傳病基因診斷、腫瘤基因檢測(cè)、個(gè)體化用藥研究等臨床應(yīng)用中,靶向測(cè)序和全外顯子組測(cè)序(WES)已經(jīng)得到臨床廣泛認(rèn)可,但由于技術(shù)特點(diǎn),這些測(cè)序方法在檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異(SV)、深度內(nèi)含子區(qū)等方面仍存在局限性。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的大規(guī)模推廣、臨床研究的不斷深入,復(fù)雜致病變異不斷涌現(xiàn),亟需更加全面的檢測(cè)手段。WGS技術(shù)對(duì)受檢者基因組中的全部DNA序列進(jìn)行檢測(cè),不僅覆蓋了全部基因的外顯子序列,也覆蓋了內(nèi)含子序列和基因間序列,同時(shí)WGS技術(shù)可有效避免在對(duì)相關(guān)基因組區(qū)域進(jìn)行靶向富集時(shí)產(chǎn)生的技術(shù)性擴(kuò)增偏差,不僅可以檢出單個(gè)核苷酸變異(SNV)、堿基插入缺失(InDel)、拷貝數(shù)變異(CNV),還可以對(duì)SV進(jìn)行分析,并可以常規(guī)性地對(duì)線粒體基因組(mtDNA)變異進(jìn)行分析,極大地?cái)U(kuò)展了檢測(cè)范圍,同時(shí)其操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)化,能更加快速地獲得更完整的基因組信息。隨著近年臨床實(shí)踐及科學(xué)研究的不斷深入,WGS技術(shù)的應(yīng)用也在不斷拓展,在藥物基因組學(xué)、腫瘤及感染性疾病的基因組學(xué)研究等多方面的應(yīng)用進(jìn)一步成熟,WGS技術(shù)已逐漸成為分子診斷領(lǐng)域的重要技術(shù)平臺(tái)和研究工具。

1 WGS技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用

基因組學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了遺傳病診斷的革新與轉(zhuǎn)變,在已經(jīng)發(fā)布的WGS技術(shù)臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)中指出,WGS技術(shù)應(yīng)用于臨床遺傳病診斷可以提高診斷率,縮短診斷流程,節(jié)省時(shí)間及降低診療費(fèi)用[1]。目前WGS技術(shù)的適應(yīng)證范圍主要為高度懷疑為遺傳病,但前期一種或多種遺傳學(xué)檢測(cè)未獲得明確分子診斷的病例[1]。多項(xiàng)研究和實(shí)踐已經(jīng)證明,WGS技術(shù)有助于臨床快速診斷疾病,幫助患者家庭避免漫長(zhǎng)的診斷過(guò)程,從而及時(shí)為患者提供個(gè)性化的治療方案[2-10]。WGS在技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)及特點(diǎn),已在許多遺傳病的分子診斷過(guò)程中得到了充分的體現(xiàn),促進(jìn)了遺傳病診療水平的提高。

1.1出生缺陷及遺傳綜合征 在出生缺陷防控中,基因診斷是極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié),WGS技術(shù)已經(jīng)在許多出生缺陷及遺傳綜合征的臨床診斷中展現(xiàn)出更好的診斷效率。在一項(xiàng)針對(duì)22例Rubinstein-Taybi綜合征患兒的隊(duì)列研究中,研究者比較了高分辨率熔解曲線分析、染色體芯片分析(CMA)、靶向測(cè)序、WES和WGS等多項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù)在該綜合征診斷中的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)其中4例患兒的變異位于致病基因的5′端非翻譯區(qū)、內(nèi)含子區(qū)等非編碼區(qū),結(jié)合此類(lèi)疾病患兒表型的多樣性,提示W(wǎng)GS技術(shù)是針對(duì)此類(lèi)疾病患兒診斷的有效檢測(cè)技術(shù)[2]。目前在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中,針對(duì)超聲異常胎兒的分子診斷主要還是采用序貫檢測(cè)方法,即先采用CMA或低深度全基因組拷貝數(shù)測(cè)序(CNV-seq)技術(shù)分析染色體拷貝數(shù)異常,如CMA/CNV-seq檢測(cè)結(jié)果陰性則進(jìn)一步采用WES技術(shù)排查單基因病。一項(xiàng)針對(duì)WGS技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用的前瞻性研究顯示,在結(jié)構(gòu)異常胎兒的產(chǎn)前診斷中,WGS技術(shù)與CMA/WES序貫檢測(cè)方法相比,具有檢測(cè)更全的基因組變異類(lèi)型、較短的報(bào)告周期以及較低的DNA用量等優(yōu)勢(shì)[3]。

1.2神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病 相對(duì)于WES技術(shù),WGS技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的基因診斷中更為高效,可獲得更高的診斷率。在一項(xiàng)線粒體基因和核基因檢測(cè)均陰性的以腦病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)異常為主要臨床表現(xiàn)的患者隊(duì)列研究中,通過(guò)WGS技術(shù)的應(yīng)用,以及個(gè)性化定制的生物信息學(xué)分析流程、針對(duì)性的表型及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等,可將診斷率從16.7%提高到31.4%[4]。同時(shí)WGS技術(shù)對(duì)于SV的檢測(cè)效果顯著,如PACOT等[5]通過(guò)WGS技術(shù)成功鑒定到1型神經(jīng)纖維瘤患兒NF1基因啟動(dòng)子區(qū)域至第一外顯子之間大小為24.6 kb的嵌合缺失。

1.3肌肉系統(tǒng)疾病 WGS技術(shù)可用于肌萎縮性肌無(wú)力癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良等肌肉系統(tǒng)遺傳病的診斷。臨床上常見(jiàn)部分肌肉疾病患者,其病史和/或肌肉活檢結(jié)果高度提示遺傳病可能,但無(wú)法通過(guò)WES技術(shù)檢測(cè)中得到準(zhǔn)確的診斷,強(qiáng)烈提示變異可能位于致病基因深部?jī)?nèi)含子區(qū)域或其他非編碼區(qū)域。如PLUTA等[6]利用WGS技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3號(hào)染色體上SGCG基因和LINC00621基因的純合子倒位變異,產(chǎn)生融合基因LINC00621-SGCG,造成SGCG基因翻譯異常,導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性肢帶肌營(yíng)養(yǎng)不良癥5型;ZAUM等[7]和GON?ALVES等[8]分別利用WGS技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DMD基因44號(hào)內(nèi)含子和Xq13.3區(qū)域發(fā)生臂間倒位、第74號(hào)內(nèi)含子和PRDX4基因上游區(qū)域的重排等特殊類(lèi)型的變異,從而確診以往WES技術(shù)檢測(cè)無(wú)法明確病因的假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良病例,為此類(lèi)患者的精準(zhǔn)診治提供了重要的遺傳學(xué)證據(jù)。

1.4遺傳代謝性疾病 家族性高膽固醇血癥(FH)最常見(jiàn)的致病基因?yàn)榈兔芏戎鞍资荏w(LDLR)基因,LDLR基因致病性突變的人群發(fā)病率較高,大約50%的LDLR雜合子基因突變?cè)?0～50歲會(huì)發(fā)展為各種類(lèi)型的心血管疾病,因此通過(guò)基因檢測(cè)早期診斷或篩查L(zhǎng)DLR基因致病性突變,對(duì)于高膽固醇血癥及相關(guān)心血管系統(tǒng)疾病的防治有著重要的作用。在一項(xiàng)針對(duì)FH患者的分子診斷研究中,通過(guò)WGS技術(shù)檢測(cè)到LDLR基因Alu序列之間的非等位基因同源重組引起的拷貝數(shù)重復(fù),并準(zhǔn)確定位變異的位置及斷裂位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷[9]。隨著測(cè)序成本的不斷降低,WGS技術(shù)以其強(qiáng)大的檢測(cè)能力可能在未來(lái)被廣泛應(yīng)用于遺傳代謝病的分子診斷,甚至可能擴(kuò)展應(yīng)用于疾病篩查。有研究通過(guò)對(duì)比常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和WGS技術(shù)在新生兒疾病篩查中的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)WGS技術(shù)不僅降低了假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生,還在特定疾病和目標(biāo)基因中發(fā)現(xiàn)更多具有臨床意義的致病突變位點(diǎn)和CNV,為未來(lái)WGS技術(shù)在疾病篩查領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路[10]。

2 WGS技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)防治中的應(yīng)用

WGS技術(shù)作為綜合、全面的變異檢測(cè)方法,在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床診斷中的應(yīng)用成果層出不窮。越來(lái)越多的證據(jù)顯示,該技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)檢測(cè)方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),有充分的潛力成為腫瘤研究和臨床診斷更佳的選擇[11-12]。

通過(guò)WGS技術(shù)檢測(cè)可以得到腫瘤患者全基因組數(shù)據(jù),揭示患者腫瘤樣本中的突變特征、DNA損傷等信息,為分析其致瘤作用提供全方位視角。有研究團(tuán)隊(duì)利用WGS技術(shù)揭示了22種轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的全基因組變化特征,證明WGS技術(shù)在癌轉(zhuǎn)移研究中發(fā)揮重要作用[11];在腫瘤變異檢測(cè)研究中,通過(guò)采用WGS、WES和RNA-Seq 3種不同的測(cè)序方法,對(duì)78例兒科腫瘤樣本進(jìn)行變異檢測(cè)及交叉驗(yàn)證,結(jié)果顯示W(wǎng)GS技術(shù)能極大提升腫瘤變異檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度,對(duì)于低腫瘤純度或高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性樣本的檢測(cè)極具潛力[12]。WGS技術(shù)在變異檢測(cè)及腫瘤變異數(shù)據(jù)深度挖掘方面展現(xiàn)出高度的敏感性、全面性和準(zhǔn)確性,該技術(shù)將在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床診斷方面的應(yīng)用發(fā)揮不可替代的重要作用。

3 WGS技術(shù)在個(gè)體化用藥中的應(yīng)用

藥物遺傳學(xué)的揭示有望實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥,WES技術(shù)應(yīng)用于藥物遺傳學(xué)的不足之處在于其缺失部分編碼區(qū)的捕獲探針,對(duì)含鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶(GC)序列的敏感性較差,以及對(duì)于一些非外顯子區(qū)域的藥物遺傳學(xué)變異信息無(wú)法分析,包括CYP2C19*17、CYP3A5*3、UGT1A1*28/*37和VKORC1*2等[13]。而WGS從技術(shù)上更適合個(gè)體化用藥研究,WGS技術(shù)檢測(cè)及分析可以幫助識(shí)別患者對(duì)某些藥物的敏感性或耐受性,從而提高藥物的療效和降低不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),因此個(gè)體化用藥也是WGS技術(shù)今后臨床應(yīng)用的一個(gè)重要場(chǎng)景。

目前,WGS技術(shù)在個(gè)體化用藥中的應(yīng)用包括在急性早幼粒細(xì)胞白血病患者中鑒別隱匿的融合基因和指導(dǎo)治療方案[14];在惡性腫瘤患者中,通過(guò)WGS技術(shù)檢測(cè)分析識(shí)別體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)突變和指導(dǎo)抑制突變的治療[15];在非瘤樣病變的治療中,用于鑒別華法林敏感性生殖細(xì)胞系多態(tài)性并指導(dǎo)用藥劑量[16];進(jìn)行多巴-反應(yīng)性肌張力障礙患者的疾病鑒別診斷進(jìn)而指導(dǎo)臨床用藥等[17]。盡管WGS技術(shù)在個(gè)體化用藥中已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展,但目前其臨床應(yīng)用還不夠完善,未來(lái)通過(guò)在基因組信息全面評(píng)估的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物治療的個(gè)性化評(píng)分,結(jié)合藥物基因突變作用的精確預(yù)測(cè)和其他患者特異性因素,有望最終達(dá)到基于藥物基因組學(xué)的精準(zhǔn)治療和安全用藥的目的。

4 WGS技術(shù)在家族遺傳咨詢(xún)及疾病預(yù)防中的應(yīng)用

通過(guò)WGS技術(shù),可以評(píng)估家族成員的遺傳風(fēng)險(xiǎn),以便提供遺傳咨詢(xún)服務(wù)。WGS技術(shù)可以幫助識(shí)別患者潛在的疾病風(fēng)險(xiǎn),以便采取預(yù)防措施,降低疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前大規(guī)模人群隊(duì)列的基因組學(xué)和多組學(xué)大數(shù)據(jù)在重大慢病、腫瘤和遺傳病的預(yù)防、診斷和新藥研發(fā)中發(fā)揮引領(lǐng)作用,推動(dòng)個(gè)體化精準(zhǔn)健康管理和疾病診療的變革。美國(guó)和歐洲已實(shí)施多項(xiàng)以大規(guī)模隊(duì)列的基因分型、基因組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的醫(yī)學(xué)研究計(jì)劃,包括著名的英國(guó)生物樣本庫(kù)(UK Biobank)、腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)和多組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究計(jì)劃(TOPMed)等,已得出一系列具有深遠(yuǎn)影響的里程碑式成果。我國(guó)的中國(guó)代謝解析計(jì)劃(ChinaMAP)是目前最大規(guī)模的中國(guó)人群WGS和表型研究[18]。該研究通過(guò)高深度WGS數(shù)據(jù)和精細(xì)表型分析,以覆蓋中國(guó)各地區(qū)的研究隊(duì)列為基礎(chǔ)建立高質(zhì)量中國(guó)人群數(shù)據(jù)庫(kù),為疾病機(jī)制研究、預(yù)防、遺傳咨詢(xún)和公共衛(wèi)生管理提供依據(jù)。在復(fù)雜疾病的遺傳因素中,效應(yīng)較強(qiáng)的基因變異大多存在于特定的地理區(qū)域和種族群體中,只有基于特定人群完善的數(shù)據(jù)分析才有可能對(duì)該類(lèi)人群的疾病遺傳風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)評(píng)估,通過(guò)本地人群大規(guī)模WGS數(shù)據(jù)累積及臨床研究的深入,也必將為疾病預(yù)防、遺傳咨詢(xún)、精準(zhǔn)治療等提供全面的基因組信息和證據(jù)。

5 WGS技術(shù)應(yīng)用與推廣面臨的挑戰(zhàn)

WGS技術(shù)具有非常重要和多樣化的臨床應(yīng)用,但作為一項(xiàng)新技術(shù),WGS技術(shù)臨床應(yīng)用的全面推廣仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。

5.1技術(shù)復(fù)雜性及數(shù)據(jù)分析困難 (1)數(shù)據(jù)規(guī)模:WGS技術(shù)生成的數(shù)據(jù)量巨大,在解決數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、管理和分析問(wèn)題方面需要先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)和軟件工具;(2)復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu):人類(lèi)基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其中包含大量的基因重復(fù)和變異,因此數(shù)據(jù)分析難度較高;(3)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性:WGS技術(shù)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性受到諸多因素的影響,如序列誤差、技術(shù)偏差等,這需要在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中進(jìn)行充分校正;(4)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化:WGS技術(shù)缺乏統(tǒng)一的數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn),這導(dǎo)致了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的不一致性和可重復(fù)性差;(5)參考數(shù)據(jù)庫(kù)的缺失:雖然目前有內(nèi)含子區(qū)域變異、SV等相關(guān)罕見(jiàn)變異類(lèi)型的數(shù)據(jù)庫(kù),但相對(duì)于WES技術(shù)分析常用的參考數(shù)據(jù)庫(kù),WGS技術(shù)參考數(shù)據(jù)庫(kù)仍處于初步發(fā)展階段,需要大量臨床數(shù)據(jù)的累積及經(jīng)驗(yàn)。

5.2臨床醫(yī)生對(duì)于WGS技術(shù)檢測(cè)的認(rèn)識(shí)及結(jié)果解讀能力 國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)生能力差異顯著,絕大多數(shù)基層醫(yī)生及非遺傳專(zhuān)科醫(yī)生對(duì)于基因檢測(cè)報(bào)告的解讀能力有限,因此也極大地限制了新技術(shù)如WGS技術(shù)等在臨床應(yīng)用中的推廣。

5.3信息安全 與所有的高通量測(cè)序技術(shù)相同,WGS技術(shù)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)包含個(gè)人隱私信息,如果不妥善處理,可能會(huì)造成個(gè)人隱私泄露的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)WGS數(shù)據(jù)屬于人類(lèi)遺傳資源管理保護(hù)體系,需嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)人類(lèi)遺傳資源管理?xiàng)l例》做到有效保護(hù)和合理利用。

5.4檢測(cè)費(fèi)用 雖然高通量測(cè)序成本目前已經(jīng)逐步下降,但WGS技術(shù)由于分析難度高等原因,大多需要核心家系同時(shí)檢測(cè),總體費(fèi)用較高,對(duì)于國(guó)內(nèi)多數(shù)患者來(lái)說(shuō),檢測(cè)費(fèi)用很難負(fù)擔(dān)。

面對(duì)上述挑戰(zhàn)和限制,通過(guò)進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)的研發(fā),提升對(duì)數(shù)據(jù)的保護(hù)和管理,促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的合作和交流,遵循相關(guān)的道德和法律規(guī)定,保護(hù)個(gè)人隱私的安全,確保臨床診斷的準(zhǔn)確性和公正性,將促進(jìn)WGS技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的健康發(fā)展。WGS技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊的前景,隨著技術(shù)的持續(xù)完善、應(yīng)用的不斷規(guī)范及檢測(cè)成本的降低,未來(lái)WGS技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將得到進(jìn)一步提升,WGS技術(shù)的廣泛應(yīng)用將為臨床診療帶來(lái)顯著益處。