吡咯伯克霍爾德氏菌Burkholderia puraquae新型磷脂酶C催化特性及其應(yīng)用研究

李科娜,吳楠,楊旭,孫永威,段晨陽(yáng),張志平,宋麗麗,張靖楠,魏濤

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州,450002)

毛油中磷脂成分是影響植物成品油氣味、口感、外觀及保質(zhì)期的重要因素之一,因此油脂精煉過(guò)程脫膠效果直接影響油脂精煉的效率和最終產(chǎn)品質(zhì)量[1-4]。傳統(tǒng)脫膠工藝存在污水排放量大、中性油脂消耗大、殘磷量高等問(wèn)題,因此會(huì)增加后續(xù)油脂精煉的工藝步驟[5-6]。酶法脫膠是一種植物油脂脫膠的綠色新工藝,與傳統(tǒng)脫膠工藝相比,酶法脫膠具有脫膠完全、用水量和廢水排放少、耗能低、精煉得率高等優(yōu)點(diǎn),因此備受世界各國(guó)油脂加工工業(yè)的關(guān)注[7-9]。磷脂酶是應(yīng)用于植物油脂酶法脫膠的重要工業(yè)酶,根據(jù)作用磷脂位點(diǎn)不同,可以分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B和磷脂酶C,其中磷脂酶A1和磷脂酶A2是目前酶法脫膠中應(yīng)用最多的磷脂酶[10-13]。

磷脂酶C(phospholipse C, PLC)是一種水解甘油磷脂Sn-3位點(diǎn)甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶,水解產(chǎn)物為甘油二酯及有機(jī)磷酸酯(磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)[14-15]。PLC廣泛存在于原核生物和真核生物中,相關(guān)基因已在動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌等多種生物中鑒定與分析[16]。PLC作用于磷脂分子的酯鍵,生成易溶于水的磷酸酯等而被脫除,同時(shí)生成甘油二酯進(jìn)而增加中性油的得率,因此PLC是油脂精煉得率最高的酶法脫膠方式。目前已報(bào)道PLC存在催化活性低、穩(wěn)定性不高、微生物來(lái)源酶不易分離純化和重組酶多以包涵體表達(dá)等問(wèn)題,因此亟需尋找適用于油脂酶法脫膠的新型酶源[17-20]。本研究利用分子克隆方法從吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapuraquae)克隆表達(dá)新型PLC基因plc_bp,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),通過(guò)熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析獲得純化重組酶,詳細(xì)研究重組酶酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能以及油脂脫膠效果,為植物油脂酶法脫膠提供新的酶源,為酶法脫膠的工業(yè)化應(yīng)用提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要菌株與質(zhì)粒

吡咯伯克霍爾德氏菌B.puraquae、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL和質(zhì)粒pET28a,本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與原料

PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SalⅠ、DNA連接試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司;磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG),美國(guó)Avanti公司;對(duì)硝基苯基磷酰膽堿(p-nitrophenylphosphorylcholine, NPPC)、PCR引物、卡那霉素、異丙基-那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)等,生工生物工程(上海)股份有限公司;大豆油、花生油毛油,金太陽(yáng)糧油股份有限公司;葵花籽油、粗菜籽油毛油,河南省淇花食用油有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組酶PLC_BP生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站BLASTp和Clustal X 2.0軟件,對(duì)B.puraquae重組磷脂酶PLC_BP及其同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用同源建模軟件SWISS-MODEL和Pymol對(duì)PLC_BP三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.2.2 PLC_BP基因克隆

根據(jù)B.puraquae重組磷脂酶PLC_BP基因核苷酸序列,設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物:5′-CAGCCATATGGGCCAGAAAACGTCTGCGACC-3′;下游引物:5′-TCGCGGATCCTCAGGCAGTGGCCTTGGCC-3′。在上下游引物5′端分別設(shè)計(jì)NdeⅠ與BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)(劃線部分表示),由上海生工公司合成。100 μL PCR反應(yīng)體系:模板DNA 1.0 μL(20 ng),dNTP 1.0 μL(25 mmol/L),引物(100 μmol/L)各1.0 μL,10×緩沖液10 μL,PfuDNA聚合酶(5 U/μL)1.0 μL,超純水43.0 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 1.5 min,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接到pET28a上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α并篩選重組質(zhì)粒,經(jīng)NdeⅠ與BamH Ⅰ雙酶切及上海生工測(cè)序驗(yàn)證后將其命名為pET28a-PLC_BP。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

挑取平板上生長(zhǎng)的菌落于含有50 μg/mL卡那霉素的30 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按照體積分?jǐn)?shù)2%接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),轉(zhuǎn)接于含有50 μg/mL卡那霉素的600 mL LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h,4 ℃、8 000×g離心20 min。向所得菌體中添加破壁buffer(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.9,50 mmol/L NaCl),懸浮菌體后于冰上進(jìn)行超聲波破碎10 min。按照破壁buffer的0.1%體積分?jǐn)?shù)添加Triton X-100,于4 ℃、75 r/min振蕩2.5 h,取1 mL留樣為全蛋白。超聲波破碎菌體后60 ℃熱處理30 min,4 ℃、8 000×g離心20 min,上清液即為粗酶液。采用鎳柱親和層析方法進(jìn)行目的蛋白的純化,以20～500 mmol/L的線性咪唑(流速1 mL/min)梯度洗脫重組酶。利用Superdex 200(16/60)凝膠過(guò)濾柱進(jìn)一步純化蛋白,以緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,200 mmol/L NaCl)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)純化效果,蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍(lán)比色Bradford方法測(cè)定。

1.2.4 重組酶PLC_BP活性的檢測(cè)

在96孔板中測(cè)定PLC_BP活性,具體酶活性反應(yīng)體系:1 mmol/L NPPC底物、1 μmol/L純化酶蛋白、60%(體積分?jǐn)?shù))山梨醇、1 mmol/L MnCl2和反應(yīng)緩沖液50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5),60 ℃反應(yīng)30 min,并在405 nm下測(cè)定吸光度。酶活力單位定義:每分鐘生成1 mmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5 重組酶PLC_BP酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 底物特異性

分別以PC、PE和PG為反應(yīng)底物,于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中測(cè)定酶活力,測(cè)定重組酶PLC_BP的底物特異性。

1.2.5.2 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

最適反應(yīng)溫度:以1 mmol/L NPPC作為反應(yīng)底物,緩沖體系為50 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.5),反應(yīng)時(shí)間30 min,在25～80 ℃,每隔5 ℃測(cè)酶活力。酶的熱穩(wěn)定性:取相同濃度的酶置于不同溫度(50、60、70 ℃)下,分別保溫0～8 h后,在標(biāo)準(zhǔn)體系下檢測(cè)酶活力。

1.2.5.3 最適反應(yīng)pH

在不同pH(6.0～11.0)的緩沖液下測(cè)酶活力。所用緩沖液為50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.5)和3-環(huán)己氨基丙磺酸緩沖液(pH 9.5～11.0),反應(yīng)溫度60 ℃,底物為NPPC,對(duì)照不加酶,以相應(yīng)pH的緩沖液代替。

1.2.5.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

研究不同金屬離子對(duì)PLC_BP活力的影響。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別加入不同的金屬離子溶液(Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ni2+和Cu2+)至終濃度為5 mmol/L,室溫放置60 min,以NPPC為底物,以不加任何金屬離子的酶促反應(yīng)物為對(duì)照,60 ℃反應(yīng)測(cè)酶活力。

1.2.6 酶法脫膠

參照YANG等[21]的方法稍作改進(jìn),用PLC_BP對(duì)油菜籽油、大豆油、花生油及向日葵籽油進(jìn)行酶法脫膠工藝研究。100 g毛油加入0.1 mL檸檬酸溶液(450 g/L),置于可以密封的錐形瓶,10 000 r/min均質(zhì)1 min,于75 ℃、500 r/min孵育20 min。將混合液10 000×g離心10 min。向上清混合液中加入一定量檸檬酸溶液(0.1 mmol/L)調(diào)節(jié)pH。加入2 mg純化后的PLC_BP(250 U/mg),并加入2 mL去離子水,5 000 r/min均質(zhì)1 min進(jìn)行乳化,酶脫膠過(guò)程在65 ℃、500 r/min條件下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行磷含量和脂肪酸分析。磷含量分析方法:油乳樣品10 mL,80 ℃水浴加熱10 min,10 000×g離心10 min,取5 g上清油,使用GB/T 5537—2008《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》中的鉬藍(lán)比色法進(jìn)行磷含量分析。游離脂肪酸含量根據(jù)AOCS Ca 5a-40《Free Fatty Acids》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLC_BP氨基酸序列分析

NCBI網(wǎng)站中BLAST分析PLC_BP的同源序列,發(fā)現(xiàn)在Burkholderialata和Burkholderiacepacia等中存在同源蛋白,相似性在95%以上;PLC193蛋白來(lái)自海洋細(xì)菌Phaeobactersp.strain MED 193,是課題組前期已經(jīng)報(bào)道的具有水解NPPC和磷脂的PLC;來(lái)自Haemophilusinfluenza的HiLpxH(UDP-2,3-二酰基葡萄糖胺水解酶,PDB:5K8K)是PLC_BP同源建模的模板蛋白。利用軟件Clustal X 2.0比對(duì)PLC_BP的同源序列,結(jié)果如圖1所示,PLC_BP及其同源蛋白具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[11,15],分別為SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測(cè)D93和H169與金屬離子Mn2+存在相互作用關(guān)系。

圖1 PLC_BC與同源蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.1 PLC_BC alignment with amino acid sequences of congeners注:右邊序號(hào)代表氨基酸的位置;陰影部分為保守序列;“*”和“:”分別代表保守的和半保守氨基酸位點(diǎn);5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)已經(jīng)表示標(biāo)識(shí);PLC_BP:B.puraquae(WP085042045.1);PLC_BL:B.lata(ABB09191.1);PLC_BC:B.cepacia(WP059531150.1);PLC193:Phaeobacter sp.strain MED 193(EAQ46983.1);HiLpxH:H.influenza(BBF08221.1)。

2.2 重組酶PLC_BP表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒pET28a-PLC_BP在E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)熱處理、鎳柱親和層析及分子篩Superdex 200層析純化,得到純化重組酶PLC_BP,分子質(zhì)量是38.0 kDa。點(diǎn)突變體D93A和H169A表達(dá)純化步驟與PLC_BP野生型酶相同,結(jié)果如圖2所示。

1-Marker;2-全蛋白;3-粗蛋白;4-鎳柱親核層析純化的酶;5-分子篩Superdex 200層析純化的酶;6-純化后突變體D93A;7-純化后突變體H169A

2.3 最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性與反應(yīng)pH

重組酶PLC_BP的最適溫度為60 ℃,在45～65 ℃時(shí)酶活力能保持最大活力的一半以上(圖3-a)。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,60 ℃處理8 h,重組酶仍然保持50%左右的活力(圖3-b),結(jié)果表明重組酶PLC_BP是具有較好的熱穩(wěn)定性。重組酶最適pH為8.5,pH 7.5～9.5時(shí)酶活力能保持最大活力的50%以上(圖3-c)。

a-最適反應(yīng)溫度;b-熱穩(wěn)定性;c-最適反應(yīng)pH

2.4 金屬離子對(duì)PLC_BP活力的影響

如圖4所示,Mn2+具有明顯的激活作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道部分PLC需要Mn2+作為輔助因子是一致的[10-11,15]。分別以Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Ni2+和Cu2+作為酶反應(yīng)輔助因子,PLC_BP的活性分別下降到33.1%、15.3%、23.1%、8.3%、11.6%和3.5%,因此PLC_BP是Mn2+依賴性PLC,與氨基酸序列同源性和蛋白同源建模分析結(jié)果相一致。

圖4 金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on enzyme activity

2.5 PLC_BP對(duì)天然磷脂的水解特異性

由表1可知, PLC_BP對(duì)不同磷脂的kcat/Km值依次為PC[7.3 s-1·(mmol/L)-1]>PE[5.7 s-1·(mmol/L)-1]>PG[1.5 s-1·(mmol/L)-1],表明PC是PLC的最佳底物,PC和PE在植物油中是含量最高的2種磷脂, PLC對(duì)PC、PE水解效果好,也為后續(xù)油脂脫膠打下了較好基礎(chǔ)。

表1 PLC_BP對(duì)不同天然磷脂底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of PLC_BP on natural phospholipid

2.6 PLC結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

以來(lái)自H.influenza的HiLpxH為模板(PDB:5K8K,相似性16%)建立PLC_BP的蛋白結(jié)構(gòu),如圖5所示。

a-PLC_BP預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)的雙核錳離子結(jié)合位點(diǎn);b-PLC_BP催化關(guān)鍵位點(diǎn)

預(yù)測(cè)PLC_BP蛋白結(jié)構(gòu)具有雙核錳離子結(jié)合位點(diǎn)(圖5-a),其中處于保守結(jié)構(gòu)域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)的殘基D63、H65、D93、N133、H134、H169、H253、H255與酶催化活性關(guān)鍵位點(diǎn),其中D93和H169與金屬離子Mn2+結(jié)合存在相互作用(圖5-b)[10-11,15]。通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建Mn2+結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)D93A和H169A,對(duì)比分析野生型和突變體動(dòng)力學(xué)(表2),發(fā)現(xiàn)D93A和H169A的Km為468.4和382.6 mmol/L,大于野生型酶的Km值(214.2 mmol/L),突變體酶與底物NPPC的結(jié)合能力低于野生型酶;對(duì)比分析催化效率,突變體酶D93A和H169A的kcat/Km為8.1和6.5 s-1·(mmol/L)-1,遠(yuǎn)低于野生型酶的kcat/Km值(253.5 mmol/L),突變體酶催化效率也低于野生型酶,以上結(jié)果表明氨基酸位點(diǎn)D93和H169與金屬離子Mn2+結(jié)合有關(guān)。

表2 PLC_BP與突變體對(duì)NPPC底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of wild-type and site-directed mutants of PLC_BP and on NPCC substrate

2.7 PLC脫膠效果

脫膠油中磷含量降低(<10 mg/kg)滿足了油脂工業(yè)精煉的要求。向檸檬酸處理后的油樣中加入PLC_BP,反應(yīng)5 h,菜籽油、大豆油和葵花籽油的殘磷量均降至10 mg/kg內(nèi)(圖6)。酶脫膠反應(yīng)6 h后,菜籽油、大豆油、花生油和葵花籽油的殘磷量分別為3.5、4.2、2.8和3.4 mg/kg。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PLC_BP脫膠效果的影響Fig.6 Effect of reaction time on degumming of PLC_BP

用PLC_BP進(jìn)行毛油脫膠會(huì)使游離脂肪酸的含量略有增加。如表3所示,PLC_BP對(duì)菜籽油、大豆籽油、花生籽油和葵花籽油進(jìn)行酶法脫膠后(6 h),游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了0.04%～0.08%。據(jù)報(bào)道,在酶脫膠反應(yīng)過(guò)程中,殘磷含量降低至100 mg/kg時(shí),游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)將增加約0.2%[22]。因此,本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸含量的增加與磷含量的下降(29.5～46.7 mg/kg)基本一致,說(shuō)明游離脂肪酸濃度增加是磷脂被酶水解的結(jié)果。以上結(jié)果表明,PLC_BP具有較好的植物油脫膠活性,是一種具有油脂工業(yè)應(yīng)用前景的植物油酶法脫膠的工具酶。

表3 PLC_BP脫膠不同植物油的脂肪酸含量 單位:%

3 結(jié)論

本文成功構(gòu)建吡咯伯克霍爾德氏菌B.puraquae新型PLC原核表達(dá)載體pET28a-PLC_BP,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。經(jīng)60 ℃熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析純化,得到純化的重組磷脂酶PLC_BP,SDS-PAGE檢測(cè)該酶分子質(zhì)量是38.0 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該酶的最適溫度與pH分別為60 ℃與pH 8.5,在最適反應(yīng)溫度60 ℃處理8 h,酶活力穩(wěn)定在50%以上。通過(guò)氨基酸序列同源性和蛋白質(zhì)同源建模分析,發(fā)現(xiàn)PLC_BP具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)和2個(gè)Mn2+結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)(D93A和H169A)。PLC_BP可有效降低不同來(lái)源毛油中的磷脂,經(jīng)過(guò)脫膠后菜籽油、大豆油、花生油和葵花籽油的殘磷量分別為3.5、4.2、2.8和3.4 mg/kg,滿足后續(xù)油脂精煉要求,為植物油脂酶法脫膠提供新的酶源,為酶法脫膠的工業(yè)化應(yīng)用提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。